本发明涉及生物医药领域，特别是一种乌药叶提取物及其制备方法和用途。
背景技术：
乌药为新“浙八味”药材之一，为樟科植物乌药的干燥块根，最早载于唐代《本草拾遗》，具有行气止痛，温肾散寒等功效。主要用于寒凝气滞，胸腹胀痛，气逆喘急，膀胱虚冷，遗尿尿频，疝气疼痛，经寒腹痛等证的治疗。乌药块根中含丰富的倍半萜及内酯、生物碱等，研究表明乌药中起行气止痛的主要成分为总生物碱类，然而其成分复杂，且含量较低。乌药叶中主要含有黄酮类、生物碱类和挥发油。现代药理学主要集中于乌药叶总黄酮的研究，具有抗氧化、治疗心血管疾病等药理作用，而对于含量较低的挥发油和生物碱类成分的研究相对较少，还需进一步的探究以提升乌药的全资源开发利用的附加值。
乌药叶中生物碱、黄酮、挥发油等多种成分均与活血镇痛活性相关，若采取简单的直接浸提或回流浸提以生产简单的醇提物或水提取，技术含量不高，难以实现附加值的产业升级,且乌药叶中所含的多种功能性成分无法被有效提取，造成原料及功能性成分资源的极大浪费。在提取单一组分时，提取条件会破坏其他组分或者导致其他组分的提取率低，并且纯度低，后续处理复杂。因此，应综合考虑各种成分的相互影响，活性和提取率，开发一种能连续提取乌药多种活性成分的方法，最大限度开发乌药叶中有效成分的利用价值。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决上述技术的不足而提供一种能连续提取乌药多种活性成份，最大限度开发乌药叶中具有活血镇痛有效成份的利用价值的一种乌药叶提取物及其制备方法和用途。
为了达到上述目的，本发明所提供的一种乌药叶提取物的制备方法，其特征是：包括以下步骤：
步骤一、将乌药叶经30℃～40℃烘干粉碎，然后置于超临界萃取装置中的萃取釜内，采用二氧化碳作溶剂，对烘干粉碎后的乌药叶在超临界萃取装置中进行二氧化碳超临界萃取：首先将通入的二氧化碳通过冷凝器进行降温至二氧化碳处于液态，通过高压泵将二氧化碳泵入萃取釜内，并对超临界萃取装置中的萃取釜进行加热加压，使二氧化碳处于超临界状态萃取，在萃取时，二氧化碳的流量控制在每小时30l，并进行循环萃取；同时保持萃取压力为22±5mpa，萃取温度40±5℃、萃取时间2小时至3小时，在分离釜中进行两级分离，第一级分离压力为4±0.5mpa、分离温度为40±5℃，第二级分离压力为4±0.5mmpa、分离温度35±5℃，由此获取黄绿色粘稠状萃取物，将萃取物中水分去除即为乌药叶挥发油，精密称重，计算萃取物收率；在此，所述将乌药叶经30℃～40℃烘干粉碎，其粉碎程度可以是选择过20至100目筛后进行后续萃取；
步骤二、将通过超临界提取乌药叶挥发油后的残渣，按料液比1∶10～15g/ml加入含0.1％hcl的浓度为80％的乙醇在60℃温度控制下回流提取1小时至2小时，同法提取2次至3次，合并滤液，用naoh溶液调节ph至7.0，过滤收集滤液，经旋转蒸发浓缩挥发乙醇，用蒸馏水溶解，即为粗提取液；
步骤三、将步骤二所得粗提取液以2bv/h流速上样,上样液浓度为2mg/ml，上样ph为6.0，加入大孔树脂柱上，分别用2bv水和1bv20％的乙醇各冲洗1次，再分别用3bv的60％乙醇和2bv的含2％氨水的80％乙醇以2bv/h的流速进行洗脱，收集合并洗脱液，获得黄酮和生物碱混合提取物。在此，bv为柱床体积单位，h为小时。
为了有效收集并提取所萃取的黄酮和生物碱混合提取物，所述步骤三的大孔树脂柱中采用的树脂为d101和nka-9组成的大孔树脂组合物，d101和nka-9的质量比为7～8:3～2。
根据上述方法制备的乌药叶提取物，它是一种由通过对乌药叶进行二氧化碳超临界萃取的乌药叶挥发油或对通过二氧化碳超临界提取乌药叶挥发油后的残渣再进行乙醇浸取获得的黄酮和生物碱混合提取物或及其它们的混合物。
所述乌药叶挥发油与黄酮和生物碱混合提取物的混合物可以是将步骤1得到的乌药叶挥发油通过乳化再与步骤三获得的黄酮和生物碱混合提取物混合获得。
根据本发明所述的方法获得的乌药叶挥发油，主要包含莪术烯、乌药烯、β-桉叶油醇和β-桉叶烯；所述的黄酮和生物碱混合提取物主要包含去甲异波尔定、降波尔定碱boldine和网脉碱、karakoramine去甲乌药碱higenamine儿茶素、异槲皮苷和槲皮苷。
本发明提供一种根据上述方法获得的乌药叶提取物的用途，主要用于活血和镇痛及其对应的保健食品、功能化妆品和普通食品。
本发明得到的一种乌药叶提取物及其制备方法和用途，其优点是：本发明从乌药叶中可制取得到具有活血镇痛活性的提取物，是一种天然的、植物源的、无毒、成本低的天然产物；本发明所得的黄酮和生物碱混合提取物、乌药叶挥发油及其两者的混合物的活血镇痛活性均明显高于传统方法制备的乌药叶水提物，与目前已知的化学药物阿司匹林相近；充分考虑了乌药叶活血镇痛活性相关的多种成分的化学性质和提取率，采用超临界萃取制备乌药叶挥发油，操作温度低、不易破坏有效成分；采用大孔树脂组合物精制超临界萃取残渣，同时得到高纯度、高收率的乌药叶黄酮和生物碱，不用后续提纯处理，可直接使用，能有效降低生产成本，并且本发明的工艺易于操作、工艺流程短、无有害溶剂、适合工业化生产。
由于乌药叶是一种新资源食品，安全性高，用本发明从乌药叶中制取的提取物作为原料制成活血镇痛的保健食品、功能化妆品、普通食品等，符合国家对于保健食品及普通食品原料的限定和法规要求，因此，本发明制备的提取物具有广阔的应用开发前景。
通常乌药药用部位为8-10年生的地下块根，药材的采收都是以整株植物的死亡为代价的，已远远不能满足市场的需求。而漫长的生长周期中产生大量的茎叶，大部分被废弃掉，资源利用率低，本发明符合实现资源节约型、环境友好型循环经济发展理念。
中医理论中“产后身痛”、“痛经”等多种病证多因瘀血阻滞经络或肌肤或其他脏腑而导致气血不通，容易出现“不通则痛”。患者实验室检查无异常，西医无对应病名，主要对症治疗，常用激素、解热镇痛药，可以暂时改善症状，但有停药易复发、副作用大等缺点，且影响患者哺乳，依从性不佳。从天然药物或药食同源中药中发掘能够温阳活血、温经通痹的成分具有较大的应用前景。
本发明以乌药叶为原料，在超临界提取挥发油的基础上制备乌药叶挥发油提取残渣，然后采用大孔树脂组合精制其中的黄酮和生物碱，从而获得乌药叶挥发油与黄酮、生物碱的连续提取工艺。本发明不仅丰富了纯天然活血镇痛功能成分的来源,也开拓了乌药非药用部位新的功效及应用价值，提升了乌药资源开发利用的附加值，它对活血镇痛药物、保健食品和功能食品等领域产品的进一步开发都具有非常积极的现实意义。
附图说明
图1是各实验组处理后斑马鱼平均总运动距离与模型对照组比较统计图；
图2是各实验组斑马鱼尾部瘀血平均发生数与模型对照组比较统计图。
具体实施方式
为了更清晰地理解本发明的技术方案，下面通过实施例结合附图对本发明作进一步的举例说明。
实施例1：
本实施例提供一种乌药叶提取物的制备方法，它包括以下步骤：
步骤一、将乌药叶经30至40℃烘干粉碎，过40目筛，称取1000克置于超临界萃取装置中的萃取釜内，采用二氧化碳作溶剂，对烘干粉碎后的乌药叶在超临界萃取装置中进行二氧化碳超临界萃取：首先将通入的二氧化碳通过冷凝器进行降温至二氧化碳处于液态，通过高压泵将二氧化碳泵入萃取釜内，并对超临界萃取装置中的萃取釜进行加热加压，使二氧化碳处于超临界状态萃取，在萃取时，二氧化碳的流量控制在每小时30l，并进行循环萃取；同时保持萃取压力为17mpa，萃取温度35℃、萃取时间3小时，在分离釜中进行两级分离，第一级分离压力为4±0.5mpa、分离温度为40±5℃，第二级分离压力为4±0.5mmpa、分离温度35±5℃，由此获取黄绿色粘稠状萃取物，将萃取物中水分去除即为乌药叶挥发油，经精密称重获得27克乌药叶挥发油(编号为wh1)，计算萃取物收率为2.7％，经检测，其中主要包含莪术烯12.6％、乌药烯5.06％、β-桉叶油醇4.82％、β-桉叶烯2.18％；
步骤二、将通过超临界提取乌药叶挥发油后的残渣，按料液比1∶10g/ml加入含0.1％hcl的浓度为80％的乙醇在60℃温度控制下回流提取1小时，同法提取2次，合并滤液，用naoh溶液调节ph至7.0，过滤收集滤液，经旋转蒸发浓缩挥发乙醇，用蒸馏水溶解，获得粗提取液；
步骤三、将步骤二所得粗提取液以2bv/h流速上样,上样液浓度为2mg/ml，上样ph为6.0，加入大孔树脂柱上，分别用2bv水和1bv20％的乙醇各冲洗1次，所述的大孔树脂柱装有d101和nka-9组成的大孔树脂组合物，d101和nka-9的质量比为7:3；再分别用3bv的60％乙醇和2bv的含2％氨水的80％乙醇以2bv/h的流速进行洗脱，收集合并洗脱液，通过对洗脱液经旋转蒸发浓缩或采用无水乙醇最后定容获得黄酮和生物碱混合提取物1000毫升(编号wy1)。在此，bv为柱床体积单位，h为小时。
本实施例定容获得的黄酮和生物碱混合提取物的洗脱液，经测试，主要包含去甲异波尔定0.0067％、降波尔定碱boldine和网脉碱,karakoramine去甲乌药碱higenamine儿茶素3.4518％，异槲皮苷0.1113％和槲皮苷0.9705％。
纯化后的乌药叶总黄酮的百分比含量是粗提物的3.8倍，总生物碱的百分比含量是粗提取液的6.5倍。
实施例2：
本发明提供一种具有活血镇痛活性的乌药叶提取物制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将乌药叶经30至40℃烘干粉碎，过40目筛，称取1000克置于超临界萃取装置中的萃取釜内，采用二氧化碳作溶剂，对烘干粉碎后的乌药叶在超临界萃取装置中进行二氧化碳超临界萃取：首先将通入的二氧化碳通过冷凝器进行降温至二氧化碳处于液态，通过高压泵将二氧化碳泵入萃取釜内，并对超临界萃取装置中的萃取釜进行加热加压，使二氧化碳处于超临界状态萃取，在萃取时，二氧化碳的流量控制在每小时30l，并进行循环萃取；保持萃取压力为27mpa，萃取温度45℃、萃取时间2h，在分离釜中进行两级分离，第一级分离压力为4±0.5mpa、分离温度为40±5℃，第二级分离压力为4±0.5mmpa、分离温度35±5℃，获取黄绿色粘稠状物乌药叶挥发油，将萃取物中水分去除，精密称重获得28.8克乌药叶挥发油(编号为wh2)，萃取收率2.88％；
本实施例得到的乌药叶挥发油萃取收率为2.85％，经测试，其中主要包含莪术烯12.8％、乌药烯5.12％、β-桉叶油醇4.9％、β-桉叶烯2.20％；
步骤二、将乌药叶挥发油超临界提取后的残渣，按料液比1∶15g/ml加入含0.1％hcl的80％乙醇60℃回流提取2h，同法提取3次，合并滤液，用naoh溶液调节ph至7.0，过滤收集滤液，经旋转蒸发浓缩挥发乙醇，用蒸馏水溶解，获得粗提取液。
步骤三、将步骤二所得粗提取液以2bv/h流速上样,上样液浓度为2mg/ml，上样ph为6.0，加入大孔树脂柱上，分别用2bv水和1bv20％的乙醇各冲洗1次，所述的大孔树脂柱装有d101和nka-9组成的大孔树脂组合物，d101和nka-9的质量比为8:2；再分别用3bv的60％乙醇和2bv的含2％氨水的80％乙醇以2bv/h的流速进行洗脱，收集合并洗脱液，通过对洗脱液经旋转蒸发浓缩或采用无水乙醇最后定容获得黄酮和生物碱混合提取物1000毫升(编号wy2)。
本实施例得到的黄酮和生物碱混合提取物的洗脱液，经检测，主要包含去甲异波尔定0.0071％、降波尔定碱boldine和网脉碱,karakoramine去甲乌药碱higenamine儿茶素3.4620％，异槲皮苷0.1120％和槲皮苷0.9711％。
实施例3：
本发明提供一种具有活血镇痛活性的乌药叶提取物制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将乌药叶经30至40℃烘干粉碎，过40目筛，称取1000克置于超临界萃取装置中的萃取釜内，采用二氧化碳作溶剂，对烘干粉碎后的乌药叶在超临界萃取装置中进行二氧化碳超临界萃取：首先将通入的二氧化碳通过冷凝器进行降温至二氧化碳处于液态，通过高压泵将二氧化碳泵入萃取釜内，并对超临界萃取装置中的萃取釜进行加热加压，使二氧化碳处于超临界状态萃取，在萃取时，二氧化碳的流量控制在每小时30l，并进行循环萃取；保持萃取压力为22mpa，萃取温度40℃、萃取时间2.5h，在分离釜中进行两级分离，第一级分离压力为4±0.5mpa、分离温度为40±5℃，第二级分离压力为4±0.5mmpa、分离温度35±5℃，获取黄绿色粘稠状萃取物，将萃取物中水分去除，精密称重获得28.2克乌药叶挥发油(编号为wh3),得到的乌药叶挥发油萃取收率为2.82％；
步骤二、将乌药叶挥发油超临界提取后的残渣，按料液比1∶12g/ml加入含0.1％hcl的80％乙醇60℃回流提取1.5h，同法提取2次，合并滤液，用naoh溶液调节ph至7.0，过滤收集滤液，经旋转蒸发浓缩挥发乙醇，用蒸馏水溶解，即为粗提取液；
步骤三、将步骤二所得粗提取液以2bv/h流速上样,上样液浓度为2mg/ml，上样ph为6.0，加入大孔树脂柱上，分别用2bv水和1bv20％的乙醇各冲洗1次，所述的大孔树脂柱装有d101和nka-9组成的大孔树脂组合物，d101和nka-9的质量比为7:2；再分别用3bv的60％乙醇和2bv的含2％氨水的80％乙醇以2bv/h的流速进行洗脱，收集合并洗脱液，通过对洗脱液经旋转蒸发浓缩或采用无水乙醇最后定容获得黄酮和生物碱混合提取物1000毫升(编号wy3)。
本实施例得到的黄酮和生物碱混合提取物，经检测，其中去甲异波尔定0.0068％、降波尔定碱boldine和网脉碱,karakoramine去甲乌药碱higenamine儿茶素3.4519％，异槲皮苷0.1116％和槲皮苷0.9709％。
实施例4：
本实施例是重复实施例1、2、3，并分别将重复实施例1、2、3所获得的乌药叶挥发油通过乳化再与各自步骤三获得的黄酮和生物碱混合提取物混合，获得乌药叶挥发油与黄酮和生物碱混合提取物的液态混合物，分别编号为why1、why2和why3，并取其平均数为why。
所述的乌药叶挥发油与黄酮和生物碱混合提取物的液态混合物的获得是采用聚氧乙烯40氢化蓖麻油作为乳化剂，将上述各实施例所获得量的乌药叶挥发油按1:2至2.5的重量比例与聚氧乙烯40氢化蓖麻油混合，然后分别并入各实施例中已定容为1000毫升的黄酮和生物碱混合提取物，通过高速搅拌至混合物呈透明状态。
上述呈透明状态的乌药叶挥发油与黄酮和生物碱混合提取物的液态混合物的形成是由于含有多种成份的油相乌药叶挥发油在聚氧乙烯40氢化蓖麻油的作用下与采用乙醇为洗脱液的黄酮和生物碱混合提取物混溶后，乙醇在此既起到了将黄酮和生物碱混合提取物从大孔树脂组合物中洗脱的作用，又起到了助乳化剂的作用，从而使黄酮和生物碱混合提取物中的所含的多种物质和乌药叶挥发油中所含的多种油溶性物质在乙醇水溶液中形成了微乳状分布，经检测，其平均粒径为15.25±1.22nm左右，由此形成的乌药叶挥发油与黄酮和生物碱混合提取物的液态混合物，滴入水相物质中不仅能实现良好的分散性，而且从下述测试数据来看，还能提高其活性作用，在活血和镇痛作用中显示出了更加良好的效果。
为了充分体现本发明获得的乌药叶提取物能用于活血和镇痛，下面将进一步对上述实施例得到的编号分别为wh1、wh2、wh3的乌药叶挥发油和编号分别为wy1、wy2、wy3的黄酮和生物碱混合提取物及其编号分别为why1、why2和why3的乌药叶挥发油与黄酮和生物碱混合提取物的液态混合物分别进行用于镇痛实验检测和用于活血实验检测，并获得wh1、wh2、wh3的平均值为wh；wy1、wy2、wy3的平均值为wy和why1、why2、why3的平均值为why，通过图1、图2所示来进一步体现本发明所能达到的技术效果。
由于乌药为天然无毒性植物，本发明获得的乌药叶提取物又具有活血和镇痛，因此本发明提供的乌药叶提取物还可以用于添加到相对应的活血镇痛药物、保健食品和功能食品等领域。
一、用于镇痛实验检测：
本实验检测是将上述实施例得到的乌药叶挥发油、黄酮和生物碱混合提取物及其它们的混合物用于镇痛实验检测，其中采用常规的水提物(ws)及阿司匹林作活血、镇痛作用比较。
乌药叶水提物(ws)是现有技术，在此只做对比之用。
镇痛作用比较实验如下：
随机选取3dpf野生型ab品系斑马鱼于六孔板中，每孔(每实验组)30尾，每孔容量为3ml。分别水溶给予wh1、wh2、wh3、wy1、wy2、wy3、why1、why2和why3，浓度均为31.25μg/ml，阳性对照药阿司匹林100μg/ml浓度，同时设置正常对照组(养鱼用水处理组)和模型对照组。各实验组分别处理1h后，立即将斑马鱼转移至96孔板中，1尾/孔，100μl/孔，除正常对照组外，其余实验组均水溶给予冰乙酸，利用行为分析仪检测0.5h内斑马鱼总运动距离，以总运动距离的统计学分析结果评价三个提取物对斑马鱼的镇痛作用。统计学处理结果采用mean±se表示。镇痛作用计算公式如下：
用ttest检验进行统计学分析，p<0.05表明具有显著性差异。
实验结果如表1及图1所示，其中图1为各实验组处理后斑马鱼总运动距离与模型对照组比较，**p<0.01，***p<0.001。
表1.各实验组处理后斑马鱼总运动距离(n＝10)
与模型对照组比较，**p<0.01，*＊*p<0.001
模型对照组斑马鱼总运动距离(6866mm)与正常对照组(1611mm)比较p<0.001，提示模型构建成功。阳性对照组阿司匹林100μg/ml浓度组斑马鱼总运动距离为4393mm，与模型对照组比较p<0.001，镇痛作用为47.1％，提示阿司匹林具有明显的镇痛作用。
wy1、wy2、wy3、wh1、wh2、wh3、why1、why2和why3、ws组对应的斑马鱼总运动距离为分别为4854、4939、4790、5031、5010、5201、4482、4790、4602和5569mm，由此得到wy1、wy2、wy3对应的斑马鱼总运动距离的平均值为4861，其组别设为wy；wh1、wh2、wh3对应的斑马鱼总运动距离的平均值为5081，其组别设为wh；why1、why2、why3对应的斑马鱼总运动距离的平均值为4625，其组别设为why，与模型对照组比较p<0.001&p<0.001&p<0.01，镇痛作用分别为38.3％，36.7％，39.5％，34.9％，35.3％，31.7％，45.4％，39.5％，43.1％和24.7％，由此可见在本实验浓度条件下，wy1、wy2、wy3、wh1、wh2、wh3、why1、why2和why3组均具有明显的镇痛作用，且均高于“ws”组，特别是why1、why2和why3组的平均镇痛作用为42.67％，接近于阿司匹林47.1％，乌药叶挥发油与黄酮和生物碱混合提取物的混合物在此对镇痛也起到了协同作用，如图1所示。
二、用于活血实验检测：
本实施例是将上述实施例得到的乌药叶挥发油、黄酮和生物碱混合提取物及其它们的混合物用于活血实验检测，其中采用常规的水提物(ws)及阿司匹林作活血(下面用气滞血瘀描述)作用比较。
治疗气滞血瘀功效比较实验如下：
随机选取3dpf黑色素等位基因突变型半透明albino品系斑马鱼于六孔板中，每孔(每实验组)30尾，每孔容量为3ml。分别水溶给予wh1、wh2、wh3、wy1、wy2、wy3、why1、why2和why3，浓度均为3.9μg/ml，同时设置正常对照组(养鱼用水处理组)和模型对照组。各实验组分别处理48h后，在解剖显微镜下观察各实验组30尾斑马鱼尾部瘀血发生情况，并对典型图片进行拍照，统计分析斑马鱼尾部瘀血发生尾数和尾部瘀血发生率(％)，以斑马鱼尾部瘀血尾数的统计学意义评价两个粗提物对斑马鱼气滞血瘀的治疗作用。
实验结果如表2及图2所示，其中图2为各实验组处理后斑马鱼尾部瘀血发生数与模型对照组比较，**p<0.01，***p<0.001。
表2.各实验组处理后斑马鱼尾部瘀血发生统计(n＝30)
与模型对照组比较，**p<0.01，*＊*p<0.001
模型对照组斑马鱼尾部瘀血发生尾数(25尾)与正常对照组(0尾)比较p<0.001，尾部瘀血发生率为83％(25/30)，提示模型构建成功。阳性对照药阿司匹林30μg/ml浓度组尾部瘀血发生尾数(6尾)与模型对照组比较p<0.001，尾部瘀血发生率为20％(6/30)，提示阿司匹林具有明显的治疗气滞血瘀作用。
wy1、wy2、wy3、wh1、wh2、wh3、why1、why2、why3和ws浓度组对应的斑马鱼尾部瘀血发生尾数分别为10、12、9、12、11、12、7、8、8、14尾，由此得到wy1、wy2、wy3对应的斑马鱼尾部瘀血发生尾数的平均值为10.33，其组别设为wy；wh1、wh2、wh3对应的斑马鱼尾部瘀血发生尾数的平均值为11.67，其组别设为wh；why1、why2、why3对应的斑马鱼尾部瘀血发生尾数的平均值为7.67，其组别设为why，与模型对照组比较p<0.001&p<0.001&p<0.01，尾部瘀血发生率分别为33％、40％、30％、40％、37％、40％、23％、27％、27％和47％。上述数据可知在本实验浓度条件下，wh1、wh2、wh3、wy1、wy2、wy3、why1、why2和why3组均具有明显的治疗气滞血瘀作用，且wh1、wh2、wh3、wy1、wy2、wy3、why1、why2和why3均高于“ws”组，特别是why1、why2和why3组平均尾部瘀血发生率为25.67％，接近于阿司匹林20％，说明其治疗气滞血瘀作用已接近于阿司匹林，乌药叶挥发油与黄酮和生物碱混合提取物的混合物在此对治疗气滞血瘀起到了协同作用，如图2所示。
1.一种乌药叶提取物的制备方法，其特征是：包括以下步骤：
步骤一、将乌药叶经30～40℃烘干粉碎，然后置于超临界萃取装置中的萃取釜内，采用二氧化碳作溶剂，对烘干粉碎后的乌药叶在超临界萃取装置中进行二氧化碳超临界萃取：首先将通入的二氧化碳通过冷凝器进行降温至二氧化碳处于液态，通过高压泵将二氧化碳泵入萃取釜内，并对超临界萃取装置中的萃取釜进行加热加压，使二氧化碳处于超临界状态萃取，在萃取时，二氧化碳的流量控制在每小时30l，并进行循环萃取；同时保持萃取压力为22±5mpa，萃取温度40±5℃、萃取时间2小时至3小时，在分离釜中进行两级分离，第一级分离压力为4±0.5mpa、分离温度为40±5℃，第二级分离压力为4±0.5mmpa、分离温度35±5℃，由此获取黄绿色粘稠状萃取物，将萃取物中水分去除即为乌药叶挥发油；
步骤二、将通过超临界提取乌药叶挥发油后的残渣，按料液比1∶10～15g/ml加入含0.1％hcl的浓度为80％的乙醇在60℃温度控制下回流提取1小时至2小时，同法提取2次至3次，合并滤液，用naoh溶液调节ph至7.0，过滤收集滤液，经旋转蒸发浓缩挥发乙醇，用蒸馏水溶解，即为粗提取液；
步骤三、将步骤二所得粗提取液以2bv/h流速上样,上样液浓度为2mg/ml，上样ph值为6.0，加入大孔树脂柱上，分别用2bv水和1bv20％的乙醇各冲洗1次，再分别用3bv的60％乙醇和2bv的含2％氨水的80％乙醇以2bv/h的流速进行洗脱，收集合并洗脱液，获得黄酮和生物碱混合提取物。
2.根据权利要求1所述的一种具有活血镇痛活性的乌药叶提取物制备方法，其特征是所述步骤三的大孔树脂柱中采用的树脂为d101和nka-9组成的大孔树脂组合物，d101和nka-9的质量比为7～8:3～2。
3.一种根据权利要求1所述方法制备的乌药叶提取物，其特征是它是一种由权利要求1所述的通过对乌药叶进行二氧化碳超临界萃取的乌药叶挥发油或对通过二氧化碳超临界提取乌药叶挥发油后的残渣再进行乙醇浸取获得的黄酮和生物碱混合提取物或所述方法获得的乌药叶挥发油与所述方法获得的黄酮和生物碱混合提取物的混合物。
4.根据权利要求3所述的乌药叶提取物，其特征是所述乌药叶挥发油与黄酮和生物碱混合提取物的混合物是将步骤1得到的乌药叶挥发油通过乳化再与步骤三获得的黄酮和生物碱混合提取物混合获得。
5.一种根据权利要求3所述乌药叶提取物的用途，其特征是用于活血和镇痛。
技术总结