本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种基于阿司匹林及其代谢产物提高干扰素抗病毒活性的抗病毒药盒。
背景技术：
病毒是临床常见的病原体，近年来一直威胁着人类的生活与健康，甚至危及生命。由于病毒种类的多样性和病毒的高频突变，靶向药物研发困难重重，尤其是针对突发病毒的威胁，能够选择的特效药十分有限，因此提升目前已有的广谱抗病毒药物的疗效具有重要的临床意义。
如今临床使用的广谱抗病毒药物主要是干扰素(interferons，ifns)。干扰素是生物细胞产生的一类高活性多功能的糖蛋白，由干扰素诱生剂诱导产生。1957年，isaacs和lindenmann等利用鸡胚绒毛囊研究流感干扰现象时，发现细胞产生一种能使未感染的细胞对随后入侵的病毒发生抵抗的蛋白，该蛋白干扰感染病毒的复制，因而被命名为干扰素。干扰素与不同的受体结合能够激活不同的信号通路，发挥多种生物学功能。其中主要是janus激酶家族及信号转导和转录活化因子(stat)家族途径，即jak-stat途径。干扰素一旦与其受体结合，将诱导jak(jak1/tyk2)家族的酪氨酸磷酸化，磷酸化的jak家族然后活化stats蛋白。stats蛋白活化后与irf9形成复合体并进入核内，与调控元件isre结合，诱导isgs(ifn-stimulatedgenes)的转录和表达，最终由这些isgs执行一系列生物学功能。干扰素在机体先天免疫过程中发挥重要作用，尤其是一型干扰素(typeiinterferons，ifn-i)在广谱抗病毒方面的功能一直受到研究者们的重视。但是由于其造价昂贵且临床抗病毒疗效欠佳，大大限制了它的使用，因此，如何提高ifn-i的治疗效率成为临床亟待解决的问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种新的抗病毒策略，使用阿司匹林或其产物水杨酸盐提高临床干扰素的抗病毒活性。为解决上述技术问题，本发明基于老药新用和联合用药的药物开发策略，提供了一类抗炎药物(阿司匹林或其产物水杨酸盐)在临床辅助干扰素抗病毒治疗中的应用。
本发明的第一个目的是提供一种抗病毒药盒，所述药盒包括：含阿司匹林或其代谢产物的制剂；含干扰素的制剂。
进一步地，所述干扰素为一型干扰素。
进一步地，所述含阿司匹林或其产物水杨酸盐的制剂中还包括可药用的药物赋形剂、载体或稀释剂。
进一步地，所述含阿司匹林或其代谢产物的制剂为注射剂或粉针剂。
进一步地，所述含干扰素的制剂中还包括可药用的药物赋形剂、载体或稀释剂。
进一步地，所述含干扰素的制剂为注射剂或粉针剂。
进一步地，所述含阿司匹林或其代谢产物的制剂促进干扰素诱导基因的表达。
进一步地，所述含阿司匹林或其代谢产物的制剂促进免疫细胞、纤维细胞或上皮细胞中干扰素诱导基因的表达。
进一步地，所述干扰素诱导基因包括ifit1、viperin、isg15、isg54。
本发明通过大量的实验证实了水杨酸钠对干扰素抗病毒活性的提高。
首先，对水杨酸钠能否抑制病毒感染进行了研究。结果显示，细胞水平上，水杨酸钠可以显著抑制病毒的感染，包括抑制多种rna病毒与dna病毒的rna水平、病毒蛋白水平和细胞感染病毒的量；动物实验中，水杨酸钠能够明显抑制小鼠体内各个脏器中病毒的感染量。
其次，对水杨酸钠能否增强干扰素诱导的抗病毒效应来达到抗病毒的功能进行了研究。结果显示，水杨酸钠不能增加干扰素的产生，但是显著促进了ifn介导的抗病毒功能。
最后，分析水杨酸钠是否促进了ifn-i介导的信号通路，进一步验证水杨酸钠可以提高干扰素的抗病毒活性。结果显示，利用水杨酸钠与ifn-i联合处理细胞，水杨酸钠可以显著促进ifn-i信号通路，包括上调ifn-i刺激下的多种干扰素诱导基因(isgs)的表达。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
目前治疗病毒感染缺乏广谱的抗病毒药物，临床常用的广谱抗病毒药物主要是干扰素，但是由于ifn-i造价昂贵并且治疗效果有限，因此在使用过程存在诸多限制。本发明基于老药新用和联合用药的药物开发策略，阐明了一类药物阿司匹林及其代谢产物水杨酸盐可以通过上调ifn-i诱导的isgs的表达，进而促进干扰素介导的抗病毒能力，为广谱抗病毒药物研发提供了新策略。这类药物(阿司匹林及其代谢产物水杨酸盐)为临床常用药物，毒性较小。阿司匹林及其代谢产物水杨酸盐有望成为一种更加安全的广谱抗病毒药物用于提高临床干扰素抗病毒活性。
附图说明
图1：a549细胞系加入水杨酸钠预处理，并分别感染h1n1、sev、vsv、hsv病毒，利用实时荧光定量pcr(realtimeqpcr)技术检测不同病毒的rna水平。n＝4，mean±sd，***p<0.001。
图2：分别取小鼠不同组织的原代细胞，加入水杨酸钠并感染vsv病毒，利用realtimeqpcr技术检测不同病毒的rna水平。n＝3，mean±sd，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图3：a549、hct116、hepg2细胞系分别加入不同剂量的水杨酸钠处理，并感染病毒，利用realtimeqpcr技术检测不同病毒的rna水平。n＝4，mean±sd，***p<0.001。
图4：用水杨酸钠处理细胞，然后感染vsv病毒或h1n1病毒，通过westernblot技术检测病毒蛋白vsv-g和h1n1-ha。
图5：ht1080和hct116分别用水杨酸钠处理，并感染vsv病毒(带有绿色荧光蛋白gfp标签)，用荧光倒置显微镜观察水杨酸钠处理后感染vsv-gfp病毒的细胞量变化。
图6：使用不同剂量的水杨酸钠处理ht1080细胞，并用sev刺激干扰素产生，利用realtimeqpcr技术检测水杨酸钠对干扰素产生的影响。
图7：使用水杨酸钠处理raw264.7细胞后，用不同剂量的鼠ifnβ(mifnβ)刺激细胞，并感染h1n1病毒，利用realtimeqpcr技术检测水杨酸钠处理组与未处理组干扰素介导的抗病毒能力变化。n＝4，mean±sd，***p<0.001。
图8：使用水杨酸钠处理2ftgh细胞后，用ifnα刺激细胞，并感染vsv病毒，利用realtimeqpcr技术检测水杨酸钠处理组与未处理组干扰素介导的抗病毒能力变化。n＝4，mean±sd，***p<0.001。
图9：使用水杨酸钠处理后，用ifn刺激不同类型的细胞系，通过realtimeqpcr技术检测代表性干扰素诱导基因(isgs)的mrna水平。n＝4，mean±sd，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图10：使用不同剂量的水杨酸钠处理，并加入ifn刺激不同类型的细胞系，通过westernblot检测代表性干扰素诱导基因(isgs)的蛋白水平。
图11：利用病毒感染小鼠，然后腹腔注射水杨酸钠，利用realtimeqpcr技术检测小鼠各脏器中病毒的rna水平。n＝5，mean±sd，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图12：利用水杨酸钠腹腔注射小鼠，然后腹腔注射干扰素，利用realtimeqpcr技术检测小鼠脏器中干扰素诱导基因(isgs)的mrna水平。n＝4，mean±sd，**p<0.01。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
如无特殊说明，本发明实施例所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
阿司匹林为较温和的解热镇痛药物，有较强的抗炎、抗风湿、抗血小板凝集作用，是世界上最常用的临床药物之一。阿司匹林服用后在胃和小肠内吸收，并在胃黏膜、血浆和肝中水解，最终以水杨酸盐的形式发挥功能。因此，本发明以有效成分水杨酸钠(sodiumsalicylate，sa)开展细胞学及动物学实验。阿司匹林和水杨酸钠均属于非类固醇抗炎药(non-steroidalanti-inflammatorydrug，nsaids)。
实施例1：水杨酸钠显著抑制细胞中多种rna和dna病毒的复制
为了探索水杨酸钠是否能抑制病毒的感染，将a549细胞，铺板于12孔细胞培养板上(约0.5×106/孔)，加入水杨酸钠(600μg/ml)预处理12h，分别感染h1n1、sev、vsv、hsv(moi＝1)病毒，37℃培养箱孵育20h。使用trizol裂解细胞，之后提取细胞中总rna并逆转录成cdna，利用荧光定量pcr(real-timeqpcr)技术检测检测不同病毒的rna水平。所得结果如图1所示。
将野生型c57bl/6小鼠(6-8周)取肺、脾、心、肾和肝组织，研磨后获取原代细胞铺板于12孔细胞培养板，加入水杨酸钠(600μg/ml)预处理12h，并感染vsv(moi＝1)病毒，37℃培养箱孵育20h。使用trizol裂解细胞，之后提取细胞中总rna并逆转录成cdna，利用荧光定量pcr(real-timeqpcr)技术检测检测vsv病毒的rna水平。所得结果如图2所示。
将a549、hct116、hepg2细胞，铺板于12孔细胞培养板上(约0.5×106/孔)，加入不同剂量的水杨酸钠(100、200、300μg/ml)预处理12h，并感染vsv或h1n1病毒，37℃培养箱孵育20h。使用trizol裂解细胞，之后提取细胞中总rna并逆转录成cdna，利用荧光定量pcr(real-timeqpcr)技术检测检测病毒的rna水平。所得结果如图3所示。
将a549和mef细胞，铺板于12孔细胞培养板上(约0.5×106/孔)，加入不同剂量的水杨酸钠预处理12h，并感染vsv病毒，37℃培养箱孵育24h。用np-40裂解液将细胞裂解，制备蛋白样品，用sds-page电泳后，转至pvdf膜上，5％脱脂奶粉室温封闭1h，加入一抗4℃孵育过夜，pbst洗涤后，加入二抗室温孵育1h，pbst洗涤后，加入发光底物进行曝光、显影和定影。所得结果如图4所示。
将ht1080和hct116细胞，铺板于12孔细胞培养板上(约0.5×106/孔)，加入不同剂量的水杨酸钠预处理12h，感染vsv-gfp病毒(带有绿色荧光蛋白gfp标签)，用荧光倒置显微镜观察感染vsv-gfp病毒的细胞，分析水杨酸钠处理后感染病毒的细胞数量的变化。所得结果如图5所示。
图1至图5的结果显示，水杨酸钠可以显著抑制细胞中多种rna病毒和dna病毒的复制，包括下调病毒的rna水平、病毒的蛋白水平及病毒感染的细胞量。
实施例2：水杨酸钠促进ifn-i介导的抗病毒能力
为了分析水杨酸钠的广谱抗病毒能力是否通过调控ifn-i介导的抗病毒信号，将ht1080细胞，铺板于12孔细胞培养板上(约0.5×106/孔)，用水杨酸钠不同剂量(100、300、600μg/ml)处理细胞，用仙台病毒sev(moi＝1)感染细胞以刺激干扰素产生。使用trizol裂解细胞，之后提取细胞中总rna并逆转录成cdna，利用荧光定量pcr(real-timeqpcr)技术检测检测ifnβ的mrna水平。所得结果如图6所示。
将raw264.7细胞，铺板于12孔细胞培养板上(约0.5×106/孔)，用水杨酸钠不同剂量(100、300、600μg/ml)处理细胞，用h1n1(moi＝1)感染细胞。使用trizol裂解细胞，之后提取细胞中总rna并逆转录成cdna，利用荧光定量pcr(real-timeqpcr)技术检测检测h1n1病毒的rna水平。所得结果如图7所示。
将2ftgh细胞，铺板于12孔细胞培养板上(约0.5×106/孔)，用水杨酸钠(600μg/ml)处理细胞，用vsv(moi＝1)感染细胞。使用trizol裂解细胞，之后提取细胞中总rna并逆转录成cdna，利用荧光定量pcr(real-timeqpcr)技术检测vsv病毒的rna水平。所得结果如图8所示。
图6至图8的结果显示，水杨酸钠不能上调干扰素的产生，但是却显著促进了干扰素的抗病毒功能，表明水杨酸钠可能通过促进干扰素信号通路发挥功能。
实施例3：水杨酸钠增加干扰素诱导基因(isgs)的表达
为了进一步分析水杨酸钠是否上调了ifn-i介导的信号通路，将细胞铺板于12孔细胞培养板上(约0.5×106/孔)，用水杨酸钠处理，然后加入ifnα刺激细胞。使用trizol裂解细胞，之后提取细胞中总rna并逆转录成cdna，利用荧光定量pcr(real-timeqpcr)技术检测代表性isgs基因的mrna水平。该实验在免疫细胞(thp1、u937)，纤维细胞(ht1080)，上皮细胞(hela、a549、293t)进行验证。所得结果如图9所示。
将raw264.7细胞，铺板于12孔细胞培养板上(约0.5×106/孔)，用水杨酸钠不同剂量(100，300、600μg/ml)处理细胞，然后加入mifnβ刺激细胞24h。用np-40裂解液将细胞裂解，制备蛋白样品，用sds-page电泳后，转至pvdf膜上，5％脱脂奶粉室温封闭1h，加入一抗4℃孵育过夜，pbst洗涤后，加入二抗室温孵育1h，pbst洗涤后，加入发光底物进行曝光、显影和定影。水杨酸钠促进干扰素诱导isgs的蛋白水平的实验，在thp1、u937、2ftgh中进行验证。所得结果如图10所示。
实施例4：水杨酸钠有效降低小鼠体内病毒的感染
本实施例所使用的c57bl/6野生型小鼠从苏州大学动物中心购买，在苏州大学spf环境中饲养。
为了分析动物体内水杨酸钠的抗病毒功能，在小鼠体内感染vsv(1x108pfu)病毒12h，然后腹腔注射水杨酸钠，24h后分别取小鼠心、肝、脾、肺、肾组织进行研磨。使用trizol裂解，之后提取各组织总rna并逆转录成cdna，利用荧光定量pcr(real-timeqpcr)技术检测小鼠各脏器vsv病毒的rna水平。所得结果如图11所示。
为了分析动物体内水杨酸钠能否上调干扰素诱导的isgs，在小鼠体内腹腔注射水杨酸钠12h，然后腹腔注射ifn，取小鼠的肺组织进行研磨。使用trizol裂解，之后提取肺组织总rna并逆转录成cdna，利用荧光定量pcr(real-timeqpcr)技术检测小鼠肺组织中干扰素诱导的ifit1的mrna水平。所得结果如图12所示。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
1.一种抗病毒药盒，其特征在于，所述药盒包括：含阿司匹林或其代谢产物的制剂；含干扰素的制剂。
2.根据权利要求1所述的抗病毒药盒，其特征在于，所述干扰素为一型干扰素。
3.根据权利要求1所述的抗病毒药盒，其特征在于，所述含阿司匹林或其代谢产物的制剂中还包括可药用的药物赋形剂、载体或稀释剂。
4.根据权利要求3所述的抗病毒药盒，其特征在于，所述含阿司匹林或其代谢产物的制剂为注射剂或粉针剂。
5.根据权利要求1所述的抗病毒药盒，其特征在于，所述含干扰素的制剂中还包括可药用的药物赋形剂、载体或稀释剂。
6.根据权利要求5所述的抗病毒药盒，其特征在于，所述含干扰素的制剂为注射剂或粉针剂。
7.根据权利要求1所述的抗病毒药盒，其特征在于，所述含阿司匹林或其代谢产物的制剂促进干扰素诱导基因的表达。
8.根据权利要求7所述的抗病毒药盒，其特征在于，所述含阿司匹林或其代谢产物的制剂促进免疫细胞、纤维细胞或上皮细胞中干扰素诱导基因的表达。
9.根据权利要求7所述的抗病毒药盒，其特征在于，所述干扰素诱导基因包括ifit1、viperin、isg15、isg54。
10.根据权利要求1所述的抗病毒药盒，其特征在于，所述阿司匹林的代谢产物为水杨酸盐。
技术总结