本发明涉及医药技术领域，具体涉及烟酰胺在制备变异链球菌产酸和生物膜形成抑制剂的应用。
技术背景
龋病是人类最常见的口腔疾病，它是在以细菌为主的多种因素作用下，牙体硬组织发生慢性进行性破坏的一种疾病，表现为牙齿颜色、形态、质地的改变。龋病严重影响口腔的发音、咀嚼、语言等功能，严重者还可导致牙髓炎及颌骨骨髓炎等多种疾病。无论是婴儿、青少年或成人，都具有患龋风险。龋病已经成为全球普遍存在的口腔健康及公共卫生问题(listl,galloway,mossey,&marcenes,2015)。世界卫生组织已将其与肿瘤和心血管疾病并列为人类三大重点防治疾病。
牙菌斑生物膜是细菌在口腔中的主要存在形式，也是龋病发生的始动因子(klein,hwang,santos,campanella,&koo,2015)。流行病学研究发现，牙菌斑生物膜中变异链球菌的检出率与龋病的发生呈正相关，变异链球菌被认为是主要的龋病相关性细菌(bowen,burne,wu,&koo,2018)。变异链球菌的致龋能力主要归结为：利用蔗糖合成胞内胞外多糖，参与牙菌斑生物膜的形成；将多种碳水化合物转运和代谢成有机酸，长期局部的低ph环境容易引起牙齿脱矿；较强的环境适应能力包括耐酸性(abranchesetal.,2018)。因此，抑制变异链球菌的致龋毒力可以通过抑制其生长、粘附定植，抑制形成生物膜的能力，抑制产糖尤其是胞外多糖，抑制产酸耐酸性等途径来实现。
然而，目前龋病的临床防治策略并不是采取药物干预龋病进展，而是单纯被动地针对龋病的结局——龋洞进行治疗。氟化物因具有逆转牙体脱矿、促进再矿化的作用而一直被用于龋病的防治。但是，氟化物防龋效果存在争议：首先，摄入过多氟化物可能造成氟中毒；其次，氟化物对于牙齿的作用部位具有选择性，对咬合面的点隙裂沟龋效果较差；同时，氟化物对牙菌斑的作用甚微，无法从病因学角度彻底控制龋病(cheng,chalmers,&sheldon,2007)。
因此，从龋病病因学和发病机制的角度出发，寻找新的防龋策略并研发新的防龋药物是目前亟待解决的问题。同时，我们需要克服现有龋病防治策略的不足，寻找能够有效抑制和清除牙菌斑生物膜的新型靶向药物。
技术实现要素：
本发明针对现有技术存在的问题提供一种能够抑制变异链球菌生长、产酸、生物膜形成、产胞外多糖的抑制剂。
本发明采用的技术方案是：烟酰胺在制备变异链球菌产酸和生物膜形成抑制剂的应用，所述烟酰胺结构如下：
进一步的，所述抑制剂的有效浓度为4μg/μl～16μg/μl。
进一步的，所述抑制剂的制备方法包括以下步骤：
步骤1：将烟酰胺溶解到去离子水中，配制成原始浓度为512μg/μl抑制剂母液；
步骤2：将配制好抑制剂母液加入到牛心脑浸液液体培养基中，得到浓度为4μg/μl～16μg/μl的抑制剂。
进一步的，所述抑制剂可抑制变异链球菌浮游菌的生长及生物膜的形成。
进一步的，所述抑制剂可抑制变异链球菌浮游菌和生物膜产酸。
进一步的，所述抑制剂可抑制变异链球菌产胞外多糖。
进一步的，所述抑制剂在制备预防龋病药物中的应用。
进一步的，所述抑制剂对正常人口腔上皮细胞没有明显毒性。
本发明的有益效果是：
(1)本发明采用烟酰胺作为抑制剂，烟酰胺是临床常用的药物，成本低，来源广，生物安全性好；
(2)本发明的抑制剂能够有效抑制变异链球菌多种致龋毒力，可以作为预防龋病的药物；
(3)本发明抑制剂分子量小，结构相对简单，较易溶于多种溶剂，制备方法简单。
附图说明
图1为本发明实施例中抑制剂对浮游状态下变异链球菌生长影响曲线图。
图2为本发明实施例中抑制剂对变异链球菌浮游菌糖酵解产酸致ph值下降影响曲线图。
图3为本发明实施例中抑制剂对变异链球菌生物膜上清液ph值下降影响曲线图。
图4为本发明实施例中采用结晶紫法检测变异链球菌生物膜含量的结果示意图。
图5为本发明实施例中采用蒽酮法检测变异链球菌胞外多糖含量的结果示意图。
图6为本发明实施例中抑制剂对人正常口腔上皮角质细胞(hok细胞)的细胞毒性试验结果示意图。
图7为本发明实施例中抑制剂对人牙龈上皮细胞(hge细胞)的细胞毒性试验结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
本发明采用的烟酰胺结构如下：
分子式为c6h6n2o，分子量为122.13；老鼠口服半数致死量(ratoralld50)为3500mg/kg。该化合物可以从商业途径购买得到，所使用的该化合物是从solarbio公司(网址：http://http://www.solarbio.com/)购买得到。
抑制剂的制备方法包括以下步骤：
步骤1：将粉末状烟酰胺512mg溶解到1ml去离子水中，配制成原始浓度为512μg/μl抑制剂母液；
步骤2：将配制好抑制剂母液加入到牛心脑浸液液(bhi)体培养基或蔗糖液体培养基中，采用二倍稀释法进行梯度稀释，得到浓度为4μg/μl～16μg/μl的抑制剂。本发明实施例中采用的抑制剂终浓度为16μg/μl、8μg/μl、4μg/μl。
本发明采用的菌株为变异链球菌(菌株编号：32401，从中国医学细菌保藏管理中心获得)。采用的牛心脑浸液(bhi)液体培养基按以下方法配制：将37g商购的bhi粉末(该bhi粉末购自美国sigma公司，货号：53286)加入1000ml蒸馏水中，高温高压(121.3℃，103.4kpa)灭菌15分钟，冷却后待用。该液体培养基是针对变异链球菌浮游培养的典型液体培养基。采用的蔗糖液体培养基按以下方法配制：分别将37g商购bhi粉末该bhi粉末购自美国sigma公司，货号：53286)和10g蔗糖(thermofisherscientific，usa，货号：s3-500)加入1000ml蒸馏水中，高温高压(121.3℃，103.4kpa)灭菌15分钟，冷却后待用。该液体培养基是针对变异链球菌生物膜培养的典型液体培养基。
下述实施例中采用的接种及培养方法：
将变异链球菌(菌种编号为：32401)菌液接种于bhi固体培养基上，37℃、兼性厌氧(5％co2)培养24小时。用接种环挑取一个单菌落接种于3mlbhi液体培养基，37℃、兼性厌氧(5％co2)培养。用紫外可见光分光光度计测定其在595nm波长的吸收值(od595)，将培养至对数生长期(od595≈0.6)的菌悬液按照1：100比例稀释于bhi液体培养基(用于培养浮游状态的变异链球菌)或bhi蔗糖液体培养基(用于培养变异链球菌生物膜)并分装到24孔板中继续培养。整个操作在生物安全柜的无菌条件下进行。
实施例1
按照无菌操作程序，将变异链球菌悬液(菌种编号为：32401)分别接种于含不同浓度抑制剂(16μg/μl、8μg/μl、4μg/μl、0μg/μl(control))的bhi液体培养基中来确定抑制剂对浮游生长状态变异链球菌的影响。
按照1:100比例将培养至对数生长期(od595≈0.6)的变异链球菌悬液分别接种到添加有浓度梯度为16μg/μl、8μg/μl、4μg/μl、0μg/μl(control)抑制剂的bhi液体培养基中。于37℃、兼性厌氧(5％co2)培养24小时，期间每半个小时读取一次595nm波长下的od值，并与对照组(不添加抑制剂)进行比较来判断变异链球菌的浮游生长是否受到影响。
不同浓度抑制剂条件下浮游状态下变异链球菌生长曲线如图1所示，添加抑制剂的处理组(浓度分别为16μg/μl，8μg/μl，4μg/μl)与不添加抑制剂的对照组相比，生长明显减缓且od值减小，说明烟酰胺对变异链球菌浮游菌生长有明显抑制作用，且浓度越高抑制作用越明显。
实施例2
按照无菌操作程序，将变异链球菌悬液(菌种编号为：32401)分别接种于含不同浓度抑制剂(16μg/μl、8μg/μl、4μg/μl、0μg/μl(control))的bhi液体培养基中培养6小时后确定抑制剂对浮游生长状态变异链球菌的影响。
按照1:100比例将培养至对数生长期(od595≈0.6)的变异链球菌悬液分别接种到添加有浓度梯度为16μg/μl、8μg/μl、4μg/μl、0μg/μl(control)抑制剂的bhi液体培养基中。于37℃、兼性厌氧(5％co2)培养6小时，4℃，4，000×g离心10min。收集菌沉淀，用ppb溶液重悬菌沉淀并调节各处理组菌悬液的吸光度od600＝0.3，取上一步菌悬液6ml于离心管，4000g，4℃，10min，去上清。用6ml磷酸钾缓冲液ppbplus 1％葡萄糖(ph＝6.5)重悬，ph计检测0min-90min时的ph值。
所用到的ppb磷酸钾缓冲液各组分配比如表1所示：
表1.0.1m磷酸钾缓冲液(母液)
所用到的ppb缓冲液plus各组分配比如表2所示：
表2.ppb缓冲液plus
图2为本发明实施例中抑制剂对变异链球菌浮游菌糖酵解产酸致ph值下降影响曲线图，从图中可以看出添加抑制剂的处理组和不添加抑制剂的对照组(control)对比，ph值下降减缓且下降幅度减小，说明烟酰胺对变异链球菌浮游菌产酸有明显抑制作用，且浓度越高抑制作用越明显。
实施例3
按照无菌操作程序，将变异链球菌悬液(菌种编号为：32401)分别接种于含不同浓度抑制剂(16μg/μl、8μg/μl、4μg/μl、0μg/μl(control))的bhi蔗糖液体培养基中，以确定抑制剂对变异链球菌生物膜产酸的抑制活性。
按照1:100比例将培养至对数生长期(od595≈0.6)的变异链球菌悬液分别接种到添加有浓度梯度为16μg/μl、8μg/μl、4μg/μl、0μg/μl(control)抑制剂的bhi蔗糖液体培养基中。在12孔板内培养生物膜，每孔3ml，每组至少3个重复。于37℃、兼性厌氧(5％co2)分别培养6、12、24、48小时。取出12孔板，小心吸出12孔板中上清液，ph计检测ph值。
结果如图3所示，与对照组相比，烟酰胺对变异链球菌生物膜产酸有一定抑制作用，其中16μg/μl烟酰胺对生物膜上清液ph值下降的抑制作用较为明显。
实施例4
按照无菌操作程序，将变异链球菌悬液(菌种编号为：32401)分别接种于含不同浓度抑制剂(16μg/μl、8μg/μl、4μg/μl、0μg/μl(control)的bhi蔗糖液体培养基中，以确定抑制剂对变异链球菌生物膜形成的抑制活性。
按照1:100比例将培养至对数生长期(od595≈0.6)的变异链球菌悬液分别接种到添加有浓度梯度为16μg/μl、8μg/μl、4μg/μl、0μg/μl(control)抑制剂的bhi蔗糖液体培养基中。在24孔板内培养生物膜，每孔1ml，每组至少3个重复。于37℃、兼性厌氧(5％co2)培养6小时。取出24孔板，小心吸出24孔板中的浮游细菌及上清液，用ph＝7.4，0.01m的磷酸盐缓冲液(该缓冲液购自美国thermo公司，货号：p5368。一袋内容物溶于1000ml去离子水，摇匀)清洗底部的生物膜2-3遍。然后加入1ml0.1％结晶紫染液，温和振荡10min。将上一步24孔板用pbs清洗2-3次，然后加入1ml30％乙酸，温和振荡15min。从24孔板中吸取200μl乙酸洗脱液，酶标仪读取od575。
结果如图4所示，与对照组相比，烟酰胺对变异链球菌6h生物膜形成有一定抑制作用，其中8μg/μl，16μg/μl差异有统计学意义，浓度越高，抑制生物膜形成越明显。
实施例5
按照无菌操作程序，将变异链球菌悬液(菌种编号为：32401)分别接种于含不同浓度抑制剂(16μg/μl、8μg/μl、4μg/μl、0μg/μl(control)的bhi蔗糖液体培养基中，以确定抑制剂对变异链球菌生物膜形成的抑制活性。
按照1:100比例将培养至对数生长期(od595≈0.6)的变异链球菌悬液分别接种到添加有浓度梯度为16μg/μl、8μg/μl、4μg/μl、0μg/μl(control)抑制剂的bhi蔗糖液体培养基中。在24孔板内培养生物膜，每孔1ml，每组至少3个重复。于37℃、兼性厌氧(5％co2)培养6小时。
取出24孔板，小心吸出24孔板中的浮游细菌及上清液，刮下孔板底部的全部生物膜至1.5mlep管内，将其离心(4000r/min)10min，弃上清，沉淀用pbs清洗2-3次，再离心(4000r/min)10min，然后弃上清。向1.5mlep管内加入0.4mol/lnaoh溶液1ml，先吹打混匀，再旋涡震荡彻底混匀，37℃孵育2h。将上一步混合液4℃离心(6000r/min)10min，取上清液200μl至另一ep管中，并贴壁缓慢加入600μl蒽酮试剂(200mg蒽酮溶解于100ml浓硫酸)，上下颠倒混匀，95℃水浴6min。
待上一步溶液冷却至室温，取200μl于96孔板中，酶标仪读取od625。
向上一步的离心管中加600μl蒽酮试剂(200mg蒽酮溶解于100ml浓硫酸)，上下颠倒混匀，95℃煮6min。
待上一步溶液冷却至室温，取200μl于96孔板中，酶标仪读取od625。
结果如图5所示，从图中可以看出8μg/μl和16μg/μl烟酰胺对变异链球菌产胞外多糖有明显抑制作用，且药物浓度越高，抑制作用越明显。
实施例6
按照无菌操作原则，用含不同浓度抑制剂(16μg/μl、8μg/μl、4μg/μl、0μg/μl(control)的细胞培养基处理hok细胞5min后，cck-8试剂检测细胞毒性。hok细胞系由四川大学口腔疾病国家重点实验室提供。
细胞培养基的配制：50ml细胞培养基中包含45mldmem培养基(gibco) 500μl双抗(100u/ml青霉素 100mg/ml链霉素) 5ml胎牛血清(gibco)。hok细胞在96孔细胞培养板中培养，每孔5000个细胞密度，100μl细胞培养基，5％co2、37℃培养24h后，吸去上清，用含不同浓度抑制剂(16μg/μl、8μg/μl、4μg/μl、0μg/μl(control)的细胞培养基处理hok细胞5min。弃上清，pbs轻柔清洗2次后，向每个孔内加入100μlcck-8溶液(apexbio，cck-8试剂用细胞培养基10倍稀释后使用)。将上述96孔板37℃5％co2避光孵育4h后，酶标仪读取od450，每组至少3个重复，cck-8试验重复进行3次。
结果如图6所示，与对照组相比，用不同浓度烟酰胺处理hok细胞5min后，未见明显的细胞毒性。
实施例7
按照无菌操作原则，用含不同浓度抑制剂(16μg/μl、8μg/μl、4μg/μl、0μg/μl(control)的细胞培养基处理hge细胞5min后，cck-8试剂检测细胞毒性。hge细胞系由四川大学口腔疾病国家重点实验室提供。
细胞培养基的配制：50ml细胞培养基中包含45mldmem培养基(gibco) 500μl双抗(100u/ml青霉素 100mg/ml链霉素) 5ml胎牛血清(gibco)。hge细胞在96孔细胞培养板中培养，每孔5000个细胞密度，100μl细胞培养基，5％co2、37℃培养24h后，吸去上清，用含不同浓度抑制剂(16μg/μl、8μg/μl、4μg/μl、0μg/μl(control)的细胞培养基处理hok细胞5min。弃上清，pbs轻柔清洗2次后，向每个孔内加入100μlcck-8溶液(apexbio，cck-8试剂用细胞培养基10倍稀释后使用)。将上述96孔板37℃5％co2避光孵育4h后，酶标仪读取od450，每组至少3个重复，cck-8试验重复进行3次。
结果如图6所示，与对照组相比，用不同浓度烟酰胺处理hge细胞5min后，未见明显的细胞毒性。
本发明中用含不同浓度(16μg/μl，8μg/μl，4μg/μl)的抑制剂的液体培养培养变异链球菌浮游菌及生物膜，对生长、产酸、生物膜形成、产胞外多糖4个表型进行检测并与对照组(不含抑制剂的液体培养基)对比。实验结果表明：所述抑制剂对于变异链球菌致龋毒力有明显的抑制作用。细胞毒性实验表明，抑制剂对正常人口腔上皮细胞没有明显的细胞毒性作用。
本发明抑制剂溶质分子量小，结构相对简单，较易溶于多种溶剂；烟酰胺是临床常用的药物，成本低，来源广，生物安全性好；抑制剂能够有效抑制变异链球菌产酸和生物膜形成，可以作为新型防龋策略的候选靶向药物。
1.一种烟酰胺在制备变异链球菌产酸和生物膜形成抑制剂的应用，其特征在于，所述烟酰胺结构如下：
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂的有效浓度为4μg/μl～16μg/μl。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂的制备方法包括以下步骤：
步骤1：将烟酰胺溶解到去离子水中，配制成原始浓度为512μg/μl抑制剂母液；
步骤2：将配制好抑制剂母液加入到牛心脑浸液液体培养基中，得到浓度为4μg/μl～16μg/μl的抑制剂。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂可抑制变异链球菌浮游菌的生长及生物膜的形成。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂可抑制变异链球菌浮游菌和生物膜产酸。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂可抑制变异链球菌产胞外多糖。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂在制备预防龋病药物中的应用。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂对正常的人口腔上皮细胞没有明显的细胞毒性。
技术总结