一、技术领域：
本发明涉及一种姜黄素衍生物的应用，特别是涉及一种姜黄素类似物cur5g作为一种新型自噬抑制剂的应用。cur5g的化学式为(3e,5e)-1-甲基-3-(4-羟基亚苄基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮。
二、
背景技术：
：
化学式(3e,5e)-1-甲基-3-(4-羟基亚苄基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮简称为cur5g，其结构式为：
(3e,5e)-1-甲基-3-(4-羟基亚苄基)-5-(3-吲哚亚甲基)-哌啶-4-酮的分子式为c22h20n2o2，分子量为344.41，性状为橙黄色结晶粉末。
姜黄是一种传统中药材，是从姜科、天南星科类的植物根茎中提取的一种二酮类化学成分。姜黄素(curcumin)则是从姜黄中提取的一类酚类色素，是姜黄的主要成分，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血脂等作用。姜黄素的水溶性差、结构不稳定、活性偏低、口服后体内代谢快和生物利用度等缺陷极大地限制了其应用。目前，以姜黄素为先导化合物，合成了具有相似生物学效应且活性稳定的姜黄素衍生物，从而能够克服姜黄素的相关限制。因而，得到广泛关注。
根据相关查新报道，姜黄素类似物cur5-8能够改善高脂饮食引起的肥胖小鼠胰岛素抵抗和肝脂肪变性。姜黄素类似物wz35通过ros-yap-jnk途径影响胃癌细胞的糖酵解抑制，从而引起胃癌细胞死亡。姜黄素类似物wz37通过抑制akt/mtor促进头颈部鳞状细胞癌headandnecksquamouscellcarcinoma(hnscc)细胞的g2/m阻滞引起细胞凋亡。姜黄素衍生物e4能激活tfeb(transcriptionfactoreb)，促进α突触蛋白的降解从而在体外抵抗帕金森氏症的神经毒性。这些研究表明，姜黄素类似物比姜黄素有更好的生物活性，其在临床上的应用可能更为广泛。
目前，姜黄素类似物在癌症方面的学术报道也被提及。但是cur5g在抑制自噬方面的作用及其相关药理学研究，目前国内外尚未见报道。
三、
技术实现要素：
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本发明要解决的技术问题是：针对姜黄素类似物的现有研究状况，本发明提供一种姜黄素类似物cur5g作为新型自噬抑制剂的应用。本发明实验及其结果证明了姜黄素类似物cur5g作为一种自噬抑制剂具有显著作用。
为了解决上述问题，本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种姜黄素类似物cur5g作为自噬抑制剂的应用。
根据上述的姜黄素类似物cur5g作为自噬抑制剂的应用，所述姜黄素类似物cur5g在抑制a549细胞、h157细胞、hepg-2细胞或mcf-7细胞自噬中的作用。
根据上述的姜黄素类似物cur5g作为自噬抑制剂的应用，所述姜黄素类似物cur5g作为自噬抑制剂应用的有效浓度为5～40μm。
根据上述的姜黄素类似物cur5g作为自噬抑制剂的应用，所述姜黄素类似物cur5g作为自噬抑制剂应用的有效浓度为10μm。
本发明利用的姜黄素类似物cur5g化合物的合成方法已有参考文献公开，参考文献为synthesisandbiologicalevaluationofcurcuminanalogueshavingapiperidonecoreaspotentialantioxidantagents.
参考文献公开的合成路线图为：
本发明实验及其结果证明了cur5g作为一种自噬抑制剂具有显著作用，为自噬抑制剂的开发应用提供了诱人前景。
四、附图说明：
图1透射电镜下溶剂对照组和10μmcur5g实验组处理24小时后a549细胞的超微结构图。
图2在a549细胞中蛋白质免疫印迹法检测自噬相关蛋白。
图3在h157细胞、hepg-2细胞和mcf-7细胞中蛋白质免疫印迹法检测自噬相关蛋白。
图4在a549细胞中使用自噬调节剂后，蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白。
图5在a549细胞中蛋白质印迹法检测自噬通路相关蛋白。
图6荧光显微镜下观察细胞内荧光信号。
图7试剂盒检测溶酶体蛋白酶ctsb(cathepsinb)与ctsd(cathepsind)的相对酶活性。
五、具体实施方式：
以下结合姜黄素类似物cur5g的具体药理实验及结果实施例进行证明cur5g作为一种自噬抑制剂的作用。
a549细胞的制备：以常规方法培养a549细胞，选取生长状态良好的、且处于对数生长期的a549细胞备用。
结合细胞生物学和分子生物学的方法，进行如下实验，以观察cur5g对自噬抑制的影响。
实施例实验1、透射电镜实验检测cur5g对a549细胞自噬的影响：
将a549细胞接种到100mm培养皿中。设置对照组：加入与药物等体积的二甲基亚砜(dmso)处理24h；设置实验组：加入10μmcur5g处理24h。将细胞用预冷的1×pbs冲洗两遍，向培养皿中加入预冷的2.5％戊二醛5ml，固定细胞30min，用刮刀从皿低轻轻刮取细胞，在4℃下12000rpm离心10min，移除上清后向其中缓慢加入预冷的2.5％戊二醛1ml。利用透射电子显微镜观察细胞超微结构。
实验结果显示：cur5g处理的a549细胞中出现大量空泡化，能够观测到大量的双层或多层膜结构的自噬小体(详见附图1)。
实施例实验2、蛋白质免疫印迹法检测cur5g对a549细胞自噬标志蛋白水平的影响：
将a549细胞接种到100mm培养皿中。设置对照组：加入二甲基亚砜(dmso)处理24h；设置实验组：分别加入10μmcur5g处理1h、3h、6h、12h和24h。另一组实验中设置对照组：加入二甲基亚砜dmso(dimethylsulfoxide)处理24h；设置实验组：分别加入1μm、5μm、10μm、20μm和40μmcur5g处理24h。处理完毕后提取蛋白质，检测细胞中自噬标志蛋白lc3b-ii和sqstm1/p62的水平。
实验结果显示：实验组能够引起细胞中lc3b-ii含量增加、且具有浓度和时间依赖性(详见附图2)，microtubuleassociatedprotein1lightchain3beta(lc3b-ii)是自噬标志蛋白；sqstm1(sequestosome1)/p62作为一个泛素连接蛋白，能够将选择性自噬中待降解的细胞质物质转运到自噬小体中，以特异性底物的形式被自噬溶酶体降解。因此sqstm1/p62水平被用来作为自噬流是否通畅的一个标志。cur5g引起细胞中sqstm1/p62的积累，且具有时间和浓度依赖性(详见附图2)，表明cur5g能够抑制a549细胞自噬流。
实施例实验3、蛋白质免疫印迹法检测cur5g对h157、hepg-2和mcf-7细胞自噬标志蛋白水平的影响：
将h157、hepg-2和mcf-7细胞分别接种到100mm培养皿中。设置对照组：加入二甲基亚砜(dmso)处理24h；设置实验组：分别加入1μm、5μm、10μm、20μm和40μmcur5g处理24h。处理完毕后提取蛋白质，检测细胞中自噬标志蛋白lc3b-ii和sqstm1/p62的水平。
实验结果显示：cur5g能够引起非小细胞肺癌细胞h157、人肝癌细胞hepg2以及人乳腺癌细胞mcf-7细胞中lc3b-ii含量增加、且具有浓度依赖性(详见附图3)，并且cur5g引起h157、hepg2和mcf-7细胞中sqstm1/p62的积累，且具有浓度依赖性(详见附图3)，表明cur5g能够抑制h157、hepg-2和mcf-7细胞自噬流。
实施例实验4、蛋白质免疫印迹法检测在自噬抑制及激活条件下，cur5g对a549细胞自噬标志蛋白水平的影响：
将a549细胞接种到100mm培养皿中。分别使用自噬起始抑制剂3-methyladenine(3-ma)(10mm)、自噬小体降解抑制剂chloroquine(cq)(30μm)、ebss(earle平衡盐溶液)溶液处理a549细胞，然后设置对照组：加入二甲基亚砜(dmso)处理24h；设置实验组：加入10μmcur5g处理24h。处理完毕后提取蛋白质，检测细胞中自噬标志蛋白lc3b-ii的水平。
实验结果显示：3-ma不能逆转cur5g对lc3b-ii表达的影响；cur5g不能进一步增加cq对lc3b-ii的积累作用；cur5g引起ebss诱导饥饿条件下lc3b-ii的进一步积累(详见附图4)。
上述实验结果表明，cur5g抑制a549细胞自噬的晚期阶段。
实施例实验5、蛋白质免疫印迹法检测cur5g对a549细胞自噬起始蛋白水平的影响：
将a549细胞接种到100mm培养皿中。分别加入10μmcur5g处理1h、3h、6h、12h、24h，提取细胞总蛋白，利用蛋白免疫印迹法检测自噬起始相关蛋白atg5、beclin-1、pik3c3(phosphatidylinositol3-kinasecatalyticsubunittype3)水平的变化。
实验结果显示：自噬起始相关蛋白atg5、beclin-1、pik3c3水平没有显著变化(详见附图5)，进一步排除cur5g影响自噬起始的可能性。
实施例实验6、免疫荧光检测cur5g对自噬小体与溶酶体融合的影响。
使用稳定表达gfp-lc3b的u87细胞。设置对照组：加入二甲基亚砜(dmso)处理24h，加入30μmcq处理6h。设置实验组：加入10μmcur5g处理24h，加入10μmcur5g与ebss共处理。使用溶酶体红色荧光探针lysotrackerred与溶酶体关联膜蛋白1(lamp1,lysosomalassociatedmembraneprotein1)标记溶酶体，细胞核使用dapi(4',6-diamidino-2-phenylindole)染色，在荧光显微镜下观察gfp-lc3b与溶酶体的定位。
实验结果显示：cur5g处理u87细胞引起gfp-lc3b的点状聚集，大多数gfp-lc3b斑点不与lysotrackerred或lamp1共定位，这与cq阳性对照组结果相似(详见附图6)，说明cur5g抑制自噬体与溶酶体的融合。
实施例实验7、cur5g不影响溶酶体蛋白水解酶ctsb和ctsd的活性。
使用a549细胞，设置对照组：加入二甲基亚砜(dmso)处理24h；设置实验组：分别加入10μmcur5g处理1h、3h、6h、12h和24h，使用试剂盒检测溶酶体蛋白酶ctsb(cathepsinb)与ctsd(cathepsind)的相对酶活性。
实验结果显示：cur5g不影响ctsb和ctsd(详见附图7)的活性，表明cur5g不损伤溶酶体的水解功能。
上述实验数据统计学处理：结果以平均值±标准差表示。经t检验，p<0.05时视为差异显著。
通过上述实验及其结果，得出如下结论：
cur5g浓度在5～40μm(尤其浓度为10μm)时，在体外能够有效地抑制自噬体与溶酶体的融合从而抑制细胞自噬。证明了cur5g作为一种新型自噬抑制剂有很大应用开发前景。
本发明实验及其结果证明了cur5g作为一种自噬抑制剂具有显著作用，为自噬抑制剂的开发应用提供了诱人前景。
1.姜黄素类似物cur5g作为自噬抑制剂的应用。
2.根据权利要求1所述的姜黄素类似物cur5g作为自噬抑制剂的应用，其特征在于：所述姜黄素类似物cur5g在抑制a549细胞、h157细胞、hepg-2细胞或mcf-7细胞自噬中的作用。
3.根据权利要求1所述的姜黄素类似物cur5g作为自噬抑制剂的应用，其特征在于：所述姜黄素类似物cur5g作为自噬抑制剂应用的有效浓度为5～40μm。
4.根据权利要求3所述的姜黄素类似物cur5g作为自噬抑制剂的应用，其特征在于：所述姜黄素类似物cur5g作为自噬抑制剂应用的有效浓度为10μm。
技术总结