本发明涉及医药技术领域，具体涉及5-羟甲基糠醛在制备抗病毒药物中的应用。
背景技术：
水疱性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus，vsv)属于弹状病毒科(rhabdoviridae)。部分家畜如猪、牛、马在感染了水疱性口炎病毒后，其临床表现症状与口蹄疫和猪水疱疹极为相似，均有舌、唇、乳头等部位出现水疱和溃烂的症状。感染水疱性口炎病毒会对畜牧业中牲畜个体的生长发育造成严重的影响，会对养殖业所造成严重的经济损失。水疱性口炎病毒为人兽共患性传染病，人类也容易感染水疱性口炎病毒。水疱性口炎病毒的传播方式为直接接触和气溶胶传播，其临床表现为头疼、发热、恶心、无力等类似流感样的症状。目前对水疱性口炎病毒还没有有效且可靠的治疗方法。同时，由于水疱性口炎病毒具有结构简单、复制能力强等特点，故被广泛应用于研究rna病毒感染过程中机体固有免疫的研究模型。
当病毒侵袭机体时会迅速诱导机体产生干扰素(interferon，ifn)，干扰素作为抵抗病毒的主要细胞因子，直接参与宿主细胞的抗病毒免疫反应、介导天然免疫应答和诱导干扰素刺激基因(interferonstimulatedgene，isg)的表达，从而使机体快速建立针对病毒侵染的天然免疫防线，在病毒的复制及传播过程中对病毒进行抑制。目前，以ifn-α/β为代表的ⅰ型干扰素已成为临床上治疗病毒感染的重要手段。因此寻找并开发新的可以增强病毒感染过程中宿主细胞ifn-β表达的化合物，具有重要的意义。
5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural，5-hmf)是一个广泛存在与许多中药及含糖食品中的一种活性物质，由单糖化合物，如葡萄糖和果糖，脱水生成，其分子中含有一个呋喃环、一个醛基和一个羟甲基。5-羟甲基糠醛的结构式如式ⅰ所示。5-羟甲基糠醛有多种药理作用，5-hmf的药理学作用主要包括抗炎、抗菌、抗氧化应激、抗缺氧和免疫调节作用等。
公开号为cn1565438a的专利文献涉及5-羟甲基糠醛及其衍生物用于制备预防和/或治疗神经系统疾病和症状的药物的用途，所述化合物在改善神经缺血缺氧以及神经损伤导致的功能障碍，减轻神经细胞水肿，提高自由基清除能力，减少自由基损伤，以及减轻神经细胞钙超载等方面具有良好的效果。该发明还提供了包含5-羟甲基糠醛或其衍生物作为活性成分的药物组合物，以及通过施用有效量的5-羟甲基糠醛或其衍生物预防和/或治疗神经系统疾病和症状的方法。
公开号为cn101116661a的专利文献涉及5-羟甲基糠醛在制药中的新用途，5-羟甲基糠醛是葡萄糖等单糖化合物在高温或弱酸等条件下脱水产生的一个醛类化合物，该化合物在多数中药中都含有次成分，近年来研究发现5-羟甲基糠醛(5-hmf)具有抗氧化、抗心肌缺血等对人体有益的作用。该发明是以人体血管内皮细胞为材料，观察5-hmf的保护作用，据试验研究结果表明5-羟甲基糠醛能拮抗h2o2对血管内皮细胞造成的损伤，反映了5-羟甲基糠醛对血管内皮细胞的保护作用，5-hmf组细胞凋亡率分别为0.95％、0.72％，而模型组的细胞凋亡率为8.17％，5-hmf细胞凋亡率远低于模型组，充分说明5-羟甲基糠醛对血管内皮细胞有保护作用。
以上专利文献未涉及5-hmf对于水疱性口炎病毒感染引起的相关疾病的相关报道，也未涉及5-hmf调控宿主细胞ifn-β表达的相关应用。
技术实现要素：
为预防、缓解或治疗水疱性口炎病毒的感染，本发明提供5-羟甲基糠醛在制备抗病毒药物中的应用。
本发明首先提供了5-羟甲基糠醛(5-hmf)在制备抗病毒药物中的应用，所述病毒为水疱性口炎病毒。
优选的，所述药物的剂型为药学上认可的任何一种剂型。更优选的，所述药物的剂型包括粉剂、颗粒剂、片剂、冲剂、软胶囊、滴丸剂、口服剂、软膏剂或注射剂。本发明用5-羟甲基糠醛制备的药物是由5-羟甲基糠醛或5-羟甲基糠醛与固体或液体赋形剂一起构成。
优选的，所述药物的给药途径为静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、口服给药、舌下给药、鼻腔给药或经皮给药中的任意一种或至少两种的组合。
优选的，5-羟甲基糠醛的给药浓度为12mg/kg。
优选的，5-羟甲基糠醛通过促进i型干扰素ifn-β表达来抑制水疱性口炎病毒的复制。
5-hmf具有廉价易得、小剂量使用安全可靠、无毒副作用的优点，是一种有效的预防、缓解或治疗水疱性口炎病毒药物。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明首次发现5-羟甲基糠醛能够有效在体外抑制vsv的复制，增强vsv感染后小鼠腹腔巨噬细胞中ifn-β基因的表达。
(2)本发明首次发现5-羟甲基糠醛能够降低vsv感染后小鼠的肺损伤情况，抑制小鼠各个器官中病毒的复制，提高小鼠血清中ifn-β表达水平，显著延长小鼠的生存期。
(3)本发明提供的具有防治vsv感染相关疾病的复方组合物，可以方便和药物载体组合制备成多种剂型，临床上服用方便，并且使用安全，长期服用无毒副作用。
附图说明
图1为利用realtimepcr法检测vsv感染不同时间点后，5-羟甲基糠醛对于vsvmrna转录水平的影响，a：小鼠原代腹腔巨噬细胞，b：raw264.7细胞。
图2为本发明5-hmf的浓度对于vsv感染小鼠腹腔巨噬细胞中vsvmrna表达水平的影响。
图3为本发明5-hmf的浓度对于vsv感染小鼠腹腔巨噬细胞中病毒载量的抑制情况。
图4为利用realtimepcr法检测vsv感染不同时间点后，5-羟甲基糠醛对于细胞中ifn-βmrna转录水平的影响，a：小鼠原代腹腔巨噬细胞，b：raw264.7细胞。
图5为利用elisa法检测vsv感染不同时间点后，5-羟甲基糠醛对于细胞上清中ifn-β表达分泌水平的影响，a：小鼠原代腹腔巨噬细胞，b：raw264.7细胞。
图6为5-羟甲基糠醛对vsv感染小鼠肺部病理结构及炎症细胞浸润的影响情况。
图7为real-timepcr检测5-羟甲基糠醛对vsv感染小鼠肝、脾、肺组织中vsvmrna水平的影响。
图8为elisa检测5-羟甲基糠醛对vsv感染小鼠血清中ifn-β水平的影响。
图9为5-羟甲基糠醛对vsv感染小鼠存活率的影响。
具体实施方式
本发明通过如下实验说明5-hmf具有预防、缓解或治疗水疱性口炎病毒的感染的作用。
实验材料：
vsv病毒：购自atcc(https://www.atcc.org/products/vr-1238)。
细胞：小鼠腹腔巨噬细胞(原代提取)；raw264.7细胞。
动物：4-6周龄的c57bl/6健康雄性小鼠，上海史莱克公司提供；小鼠用全价营养颗粒饲料，杭州师范大学实验动物中心提供。
仪器：ifn-βelisa检测试剂盒，biolegend生物公司提供；rnaisoplus，takara公司提供；primerscript1ststandcdnasynthesiskit，takara公司提供；primerscriptrtreagentkitsybrpremixextaqtm(perfectrealtime)，takara公司提供。
试剂：5-hmf，sigma-aldrich公司提供；dmem高糖培养基，bi公司提供；胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)，bi公司提供；胰酶(0.25％trypsin-edta)，bi公司提供。
实验过程中所用引物的序列如下：
vsvmrna
上游引物：5’-acggcgtacttccagatgg-3’，
下游引物：5’-ctcggttcaagatccaggt-3’，
ifn-β编码基因ifnb
上游引物：5’-agctccaagaaaggacgaaca-3’，
下游引物：5’-gccctgtaggtgaggttgat-3’，
内参基因gapdh
上游引物：5’-aggtcggtgtgaacggatttg-3’，
下游引物：5’-tgtagaccatgtagttgaggtca-3’。
实施例1
5-hmf降低vsv感染的细胞病毒核酸载量实验。
先将小鼠腹腔巨噬细胞和raw264.7细胞进行培养，
(1)小鼠腹腔巨噬细胞病毒核酸载量实验
对照组：以vsv(moi＝1)感染小鼠原代腹腔巨噬细胞；
实验组：培养基中加入使用浓度(即，加入到培养基后的终浓度)为50μg/ml的5-hmf30min后，再以vsv(moi＝1)感染小鼠原代腹腔巨噬细胞；
在vsv感染细胞0h、6h、12h和24h的时刻分别收集小鼠腹腔细胞并提取mrna并逆转录生成cdna，用real-timepcr技术检测细胞内的vsvmrna水平，实验结果如图1所示。
从图1可见，5-hmf处理的小鼠腹腔巨噬细胞感染vsv24h后，细胞内病毒载量明显低于pbs处理的小鼠腹腔巨噬细胞。
(2)raw264.7细胞病毒核酸载量实验
对照组：用pbs预处理30min，然后以vsv(moi＝1)感染raw264.7细胞；
实验组：用使用浓度为50μg/ml的5-hmf预处理30min，然后以vsv(moi＝1)感染raw264.7细胞；
在vsv感染细胞0h、6h、12h和24h的时刻分别收集细胞并提取mrna并逆转录生成cdna，用real-timepcr技术检测细胞内的vsvmrna水平，实验结果如图1所示。
从图1中可见，在5-hmf处理的raw264.7细胞感染vsv24h后，细胞内病毒载量明显低于pbs处理的raw264.7细胞。
实施例2
不同浓度5-hmf对vsv感染的小鼠腹腔巨噬细胞中vsvmrna表达水平的影响。
将小鼠腹腔巨噬细胞随机分成4组，
分别在培养基中加入使用浓度为0μg/ml、10μg/ml、25μg/ml和50μg/ml的5-hmf作用小鼠腹腔巨噬细胞；再以vsv(moi＝1)分别感染上述预处理后的小鼠腹腔巨噬细胞，24h后通过q-pcr技术检测上述小鼠腹腔巨噬细胞内vsv的rna的复制情况，结果如图2所示。
用病毒空斑形成实验(plagueassay)检测细胞培养液上清中vsv成熟病毒滴度。实验结果如图3所示。
图2和图3的结果表明，5-hmf对vsv感染后小鼠腹腔巨噬细胞内的病毒载量的抑制作用呈现出剂量依赖性。
实施例3
5-hmf增强vsv感染的小鼠腹腔巨噬细胞和raw264.7细胞中ifn-β的表达。
(1)小鼠腹腔巨噬细胞
对照组：以vsv(moi＝1)感染小鼠原代腹腔巨噬细胞；在vsv感染小鼠腹腔巨噬细胞后的0h、6h、12h和24h的时刻通过real-timepcr技术检测小鼠腹腔巨噬细胞内ifn-β编码基因ifnb的mrna转录水平。
实验组：在培养基中加入使用浓度为50μg/ml的5-hmf作用小鼠腹腔巨噬细胞30min后，以vsv(moi＝1)感染小鼠原代腹腔巨噬细胞；在vsv感染小鼠腹腔巨噬细胞后的0h、6h、12h和24h的时刻通过real-timepcr技术检测小鼠腹腔巨噬细胞内ifn-β编码基因ifnb的mrna转录水平。实验结果如图4。
(2)raw264.7细胞
对照组：以vsv(moi＝1)感染raw264.7细胞；在vsv感染小鼠腹腔巨噬细胞后的0h、6h、12h和24h的时刻通过real-timepcr技术检测raw264.7细胞内ifn-β编码基因ifnb的mrna转录水平。
实验组：在培养基中加入使用浓度为50μg/ml的5-hmf作用raw264.7细胞30min后，以vsv(moi＝1)感染raw264.7细胞；在vsv感染raw264.7细胞后的0h、6h、12h和24h的时刻通过real-timepcr技术检测raw264.7细胞内ifn-β编码基因ifnb的mrna转录水平。实验结果如图4。
图4的结果表明5-hmf可明显增强vsv感染的小鼠原代腹腔巨噬细胞和raw264.7细胞中ifn-β的产生。
将上述对照组和实验组的巨噬细胞分别进行处理，得细胞上清液，通过elisa检测细胞培养液上清中ifn-β的分泌水平。实验结果如图5。
将上述对照组和实验组的raw264.7细胞分别进行处理，得细胞上清液，通过elisa检测细胞培养液上清中ifn-β的分泌水平。实验结果如图5。
图4和图5的结果表明：5-hmf可明显增强vsv感染的小鼠腹腔巨噬细胞和raw264.7细胞中ifn-β的编码基因ifnb的mrna转录水平，促进ifn-β的产生。
实施例4
4-6周龄的c57bl/6健康雄性小鼠。小鼠的饲养条件：室温20±2℃，湿度55-65％，明暗交替，光度适度，通风洁净良好。
(1)5-hmf对vsv感染小鼠肺部病理结构及炎症细胞浸润的影响情况。
取上述小鼠若干，随机分成4组，每组5只小鼠，分别标记为第1-4组。
第1组先空腹注射240μlpbs，1h后再注射240μlpbs，18h后处死小鼠；
第2组先空腹注射240μlpbs，1h后再注射浓度为108pfu/g的vsv病毒悬液，18h后处死小鼠；
第3组先空腹注射质量浓度为12mg/kg的5-hmf溶液，1h后再注射240μlpbs，18h后处死小鼠；
第4组先空腹注射质量浓度为12mg/kg的5-hmf溶液，1h后再注射浓度为108pfu/g的vsv病毒悬液，18h后处死小鼠；
取上述处死小鼠并取上述小鼠的肺部组织用10％的甲醛溶液浸泡固定过夜后用he染色后检测小鼠肺部组织的炎症浸润情况，he染色结果如图6，第1组和第3组小鼠气管上皮纤毛整齐排列，肺泡腔内无炎性分泌物，肺泡结构完好；第2组组小鼠肺组织病理改变明显，支气管管腔狭窄，充满炎性渗出物，肺泡壁充血增厚，肺泡腔内存在炎性细胞浸润，气管上皮纤毛脱落，部分纤毛消失；第4组小鼠肺组织与第2组小鼠肺组织比较，基本无炎性渗出物，部分肺泡及间质有炎性细胞分布，肺组织结构清晰，炎症明显减轻。
(2)5-hmf处理对vsv感染小鼠肝、脾、肺组织中vsvmrna水平的影响。
取上述小鼠10只，随机分成2组，每组5只，一组记为对照组，则另一组记为实验组。
对照组：先空腹注射240μlpbs，1h后再注射按照108pfu/g注射总体积为250μl的vsv病毒悬液，18h后处死小鼠；
实验组：先空腹注射质量浓度为12mg/kg的5-hmf溶液，1h后再注射浓度为108pfu/g的vsv病毒悬液，18h后处死小鼠；
取上述处死小鼠的外周血、肝、脾和肺备用，取其中的部分肝、脾、肺组织分别进行研磨后，分别向研磨后的肝、脾、肺组织中加入rna提取液进行rna提取，提取的rna进行逆转录，然后用real-timeq-pcr技术检测小鼠的肝、脾、肺等组织中的vsv复制情况，实验结果如图7，结果表明实验组5-hmf处理组小鼠的肝、脾、肺组织中vsv的mrna水平明显低于pbs对照组。
取上述外周血在4℃的条件下静置过夜后以4000rpm/min的转速离心5分钟，取上层清液进行elisa实验检测外周血的血清中ifn-β含量，实验结果如图8，结果显示，在5-hmf处理组vsv感染小鼠的血清中，ifn-β的表达水平明显高于pbs对照组。
实施例5
5-hmf对vsv感染小鼠生存期的影响。
实验组：用质量浓度为12mg/kg的5-hmf腹腔注射小鼠1h；
对比组：用pbs缓冲溶液腹腔注射小鼠1h；
然后将实验组和对照组的小鼠分别按照108pfu/g注射总体积为250μl的vsv病毒悬液，使小鼠感染vsv，然后连续观察小鼠4天，实验结果如图9所示，结果表明，5-hmf可以显著提高被vsv感染小鼠的72h存活率。
序列表
<110>杭州师范大学
<120>5-羟甲基糠醛在制备抗病毒药物中的应用
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
acggcgtacttccagatgg19
<210>2
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
ctcggttcaagatccaggt19
<210>3
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
agctccaagaaaggacgaaca21
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
gccctgtaggtgaggttgat20
<210>5
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
aggtcggtgtgaacggatttg21
<210>6
<211>23
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
tgtagaccatgtagttgaggtca23
1.5-羟甲基糠醛在制备抗病毒药物中的应用，病毒为水疱性口炎病毒。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为药学上认可的任何一种剂型。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括粉剂、颗粒剂、片剂、冲剂、软胶囊、滴丸剂、口服剂、软膏剂或注射剂。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的给药途径为静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、口服给药、舌下给药、鼻腔给药或经皮给药中的任意一种或至少两种的组合。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，5-羟甲基糠醛的给药浓度为12mg/kg。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，5-羟甲基糠醛通过促进i型干扰素ifn-β表达来抑制水疱性口炎病毒的复制。
技术总结