本发明属于医药领域。具体涉及淫羊藿素在制备防治骨髓抑制的药物中的应用。
背景技术：
放化疗目前仍然是治疗恶性肿瘤主要的手段之一，但其存在骨髓抑制这一严重的副作用。临床主要表现为患者外周血中的白细胞、血小板甚至全血细胞的减少，严重影响了患者放化疗的继续进行。目前治疗骨髓抑制的药物主要有生物制剂和化学药，生物制剂在治疗骨髓抑制的同时也能产生骨痛或过敏等严重的副作用，而化学药的疗效不稳定且作用机制不明确。近年来，中药以其疗效显著、毒副作用小等优势在治疗骨髓抑制中逐渐受到推崇。但目前临床治疗骨髓抑制的中药大多为复方制剂，主要成分和作用机制均不明确，从而极大的限制了其应用。因此阐明中药在治疗骨髓抑制中的主要成分和作用机制能够大大的提高中药在治疗骨髓抑制中的应用。
技术实现要素：
本发明的目的旨在提供淫羊藿素的新的医药用途。
具体地说，本发明首先提供了淫羊藿素在制备防治骨髓抑制的药物中的应用。
在一优选例中，所述淫羊藿素是作为唯一的活性成分应用于防治骨髓抑制的药物的制备中。
本发明的第二方面是提供了淫羊藿素在制备升白细胞和/或血小板的药物中的应用。
在一优选例中，所述淫羊藿素是作为唯一的活性成分应用于升白细胞和/或血小板的药物的制备中。
本发明的第三方面是提供了淫羊藿素在制备促进骨髓造血干细胞增殖的药物中的应用。
在一优选例中，所述淫羊藿素是作为唯一的活性成分应用于促进骨髓造血干细胞增殖的药物的制备中。
本发明的第四方面是提供了淫羊藿素在制备促进骨髓间充质干细胞增殖的药物中的应用。
在一优选例中，所述淫羊藿素是作为唯一的活性成分应用于促进骨髓间充质干细胞增殖的药物的制备中。
本发明的第五方面是提供了淫羊藿素在制备促进骨髓间充质干细胞成骨分化的药物中的应用。
在一优选例中，所述淫羊藿素是作为唯一的活性成分应用于促进骨髓间充质干细胞成骨分化的药物的制备中。
本发明还提供了淫羊藿素在制备抑制骨髓间充质干细胞成脂分化的药物中的应用。
在一优选例中，所述淫羊藿素是作为唯一的活性成分应用于抑制骨髓间充质干细胞成脂分化的药物的制备中。
本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。
附图说明
图1为淫羊藿素对骨髓抑制小鼠外周血的影响
(a)为不同给药剂量在第9天的检测结果
(b)为3mg/kg淫羊藿素组在第9，11，13，15，17天的检测结果
图2为淫羊藿素对骨髓抑制小鼠造血干祖细胞的影响
(a)为淫羊藿素对骨髓抑制小鼠造血干祖细胞比例和绝对数的影响
(b)为淫羊藿素对骨髓抑制小鼠造血干细胞周期的影响
(c)为淫羊藿素对骨髓抑制小鼠骨髓细胞集落形成的影响
(d)为淫羊藿素对骨髓抑制小鼠造血干细胞的造血重建和自我更新功能的影响
图3为淫羊藿素对骨髓抑制小鼠骨髓微环境的影响
(a)为基于单细胞转录组测序技术研究淫羊藿素对骨髓抑制小鼠骨髓微环境细胞数量影响
(b)为基于流式细胞仪研究淫羊藿素对骨髓抑制小鼠骨髓间充质干细胞和成骨细胞数量及绝对数的影响
(c)为淫羊藿素对骨髓抑制小鼠间充质干细胞成脂分化影响
(d)为淫羊藿素对骨髓抑制小鼠间充质干细胞成骨分化影响
(e)为淫羊藿素对骨髓抑制小鼠骨髓造血支持因子表达的影响
图4为淫羊藿素体外对受损骨髓间充质干细胞的影响
(a)为淫羊藿素体外对受损骨髓间充质干细胞增殖的影响
(b)为淫羊藿素体外对受损骨髓间充质干细胞成脂分化的影响
(c)为淫羊藿素体外对受损骨髓间充质干细胞成骨分化的影响
(d)为淫羊藿素体外对受损骨髓间充质干细胞表达造血支持因子的影响
(e)为淫羊藿素体外对受损骨髓间充质干细胞造血支持功能的影响
具体实施方式
本发明的问世部分是基于这样一个意外发现：淫羊藿素可用于防治骨髓抑制。
进而，本发明提供了淫羊藿素在制备防治骨髓抑制的药物中的应用。
本发明的淫羊藿素的分子式为：c21h22o7，分子量为：372.369，其结构式如下：
本发明的淫羊藿素可通过本领域的常规方法从淫羊藿根中提取获得。亦可通过商业途径购买获得。其纯度均符合药用标准。淫羊藿素的纯度以>98％最佳。
本发明的淫羊藿素可以单独使用或以药物组合物的形式使用。药物组合物包括作为活性成分的本发明的淫羊藿素及可药用载体。较佳地，本发明的药物组合物含有0.1-99.9％重量百分比的作为活性成分的本发明的淫羊藿素。“可药用载体”不会破坏本发明的淫羊藿素的药学活性，同时其有效用量，即能发挥药物载体作用时的用量对人体无毒。
所述可药用载体包括但不限于：软磷脂、硬脂酸铝、氧化铝、离子交换材料、自乳化药物传递系统、吐温或其他表面活化剂、血清蛋白、缓冲物质如磷酸盐、氨基乙酸、山梨酸、水、盐、电解质如硫酸盐精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅酸镁、饱和脂肪酸部分甘油酯混合物等。
其他常用的药物辅料如粘合剂(如微晶纤维素)、填充剂(如淀粉、葡萄糖、无水乳糖和乳糖珠粒)、崩解剂(如交联pvp、交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素)、润滑剂(如硬脂酸镁)以及吸收促进剂、吸附载体、香味剂、甜味剂、赋形剂、稀释剂、润湿剂等。
本发明的淫羊藿素以及其药物组合物可按本领域常规方法制备并可以通过胃肠道或非胃肠道或局部皮肤途径给药。口服制剂包括胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等；非胃肠道给药制剂包括注射液等；局部皮肤给药制剂包括软膏剂、膏药、橡胶膏剂、糊剂、搽剂、洗剂、涂膜剂、离子透入剂等。优选为局部皮肤给药制剂。
本发明的淫羊藿素以及其药物组合物的给药途径可以为口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜等。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
实施例一、淫羊藿素能够增加骨髓抑制小鼠外周血中白细胞和血小板数
实验材料：
1.c57bl/6j小鼠(白细胞抗原表型为cd45.2):b6-ly5.2以下简称c57，由中国医学科学院血液学研究所动物房提供。
所有小鼠均饲养于中国医学科学院血液学研究所spf级动物房。本实验所有的小鼠均在8-10w周龄，置于无菌鼠笼内，饲料、饮水等均经高温高压灭菌处理，且饲用时不予以限制。腹腔注射环磷酰胺后的小鼠用含有抗生素(取800μl拜诺欣加入300ml饮用水中)的水喂养，以防小鼠感染。
实验方法：
1.溶液的配制
a.0.5％cmc-na溶液配制：称取1.0gcmc-na，溶解于200ml超纯水中，微波溶解10分钟，室温静置24h，4℃保存。
b.ict混悬液配制：分别称取0.3、1和3mgict,溶于400μldmso中，待充分溶解后，分别将其加入20ml0.5％cmc-na中，涡旋均匀后得到0.015mg/ml、0.05mg/ml和0.15mg/mlict混悬液，避光4℃保存。
c.利可君混悬液配制：将利可君片置于研钵中充分研磨，称取50mg利可君粉末，溶于50ml0.5％cmc-na溶液，超声助溶，配制成1mg/ml的利可君混悬液，避光4℃保存。
d.环磷酰胺溶液配制：在超净台中分别称量400和1000mg环磷酰胺，分别溶于50ml0.9％生理盐水或pbs中，涡旋助溶，得到8mg/ml和20mg/ml的环磷酰胺溶液，避光4℃保存。
e.pbs(磷酸盐缓冲液ph8.0或7.4)配制：粉末购于北京金杉生物公司，用蒸馏水溶解后定容至2l，经高温高压灭菌后无菌分装成500ml/瓶，放置于4℃备用。
f.pbe配制：pbs粉末用蒸馏水溶解后加入2mmedta定容至2l，经高温高压灭菌后无菌分装成500ml/瓶，放置于4℃，用时加入10mlfbs(2％)。
2.给药方案：50只雌性8-10wc57小鼠被随机分成7组，control组(6只)、control 3mg/kgict组(6只)、model组(8只)、model 0.3mg/kgict组(6只)、model 1mg/kgict组(8只)、model 3mg/kgict组(8只)、model 20mg/kg利可君组(8只)，随后分别进行指定的灌胃给药处理，给药体积均为0.2ml/10g，每天给药一次，连续9天。
3.骨髓抑制小鼠模型的建立：实验开始后的第5-7天，除control组外，其他组小鼠每天腹腔注射80mg/kg环磷酰胺(即8mg/ml环磷酰胺溶液给药体积为0.1ml/10g)，control组小鼠腹腔注射等量体积的生理盐水。
4.取材及外周血检测：在最后一次给药12h后(即从第一次给药后的第9天)，各小组小鼠进行如下处理：每组小鼠取20μl尾血，加入480μlpbe，涡旋均匀后，进行外周血象的检测，统计后筛选出ict药效最佳的剂量。在第一次给药后的第11，13，15，17天采集control组、model组和ict药效最佳的一组小鼠的尾血进行外周血象的检测。
5.统计学处理
本实验中所有实验数据均采用graphpadprism7统计软件进行统计分析。两组之间比较采用student’t-test；多组之间比较采用anovatest。实验数据以均值±标准差(mean±sd)表示。
实验结果：
如图1(a)所示，口服淫羊藿素能剂量依赖性增加骨髓抑制小鼠外周血中白细胞数量。且在第15天时，口服3mg/kg淫羊藿素能够同时增加骨髓抑制小鼠外周血中白细胞和血小板(图1(b)所示)。结果表明淫羊藿素能够有效的升高骨髓抑制后出现的白细胞以及血小板降低，有望成为治疗骨髓抑制的药物。
实施例二、淫羊藿素能够增加骨髓抑制小鼠骨髓中造血干祖细胞比例，增强造血干细胞造血和自我更新能力
实验材料：
1.c57bl/6j小鼠(白细胞抗原表型为cd45.2)：b6-ly5.2以下简称c57，由中国医学科学院血液学研究所动物房提供。
2.b6.sjl小鼠(白细胞抗原表型为cd45.1)：b6-ly5.1以下简称b6，由中国医学科学院血液学研究所动物房提供。
饲养条件同实施例一，骨髓移植后的小鼠用含有抗生素的水(取800μl拜诺欣加入300ml饮用水中)喂养2周，以防小鼠感染。
实验方法：
1.给药方案：将c57小鼠被随机分成model组和3mg/kgict组，随后分别进行指定的灌胃给药处理，给药体积均为0.2ml/10g，每天给药一次，连续9天，在灌胃给药的第5-7天同时每天腹腔注射80mg/kg环磷酰胺造模，于第一次给药后的第15天进行表型检测。
2.小鼠骨髓造血干祖细胞分析
a.将model和3mg/kgict组小鼠脱颈处死，用75％乙醇浸泡；
b.取下小鼠的后肢骨(髂骨、股骨和胫骨)，用无菌纱布剥去肌肉组织，将骨头放入装有2％fbs的提前预冷的pbe中，用1ml注射器吸取pbe将全骨髓细胞冲到装有3ml2％fbs的pbe流式管中，用移液枪吹散细胞，将细胞悬液用100目尼龙膜过滤，计数，1500rpm，4℃离心5min；
c.倒掉上清，剩余80-100μl缓冲液，混匀细胞，标记下列抗体；
【lineagecocktail配方】如下
d.每管样品管加入1×107/80μl，同时配7个单阳管，单阳管每管1×106/80μl；
e.样品管中加入抗体，单阳管加入对应单个抗体0.5μl，4℃孵育30min；
f.加入1mlpbe洗一遍，4℃1500rpm离心5min；
g.加500μlpbe重悬，过膜，流式检测。
3.小鼠脾脏造血干祖细胞分析
a.将model和3mg/kgict组小鼠脱颈处死，用75％乙醇浸泡；
b.取下小鼠的脾脏，用无菌纱布剥去周围组织，将脾脏放入10cm2装有提前预冷的pbe的培养皿中，用5ml注射器活塞柄将其尽量磨碎，悬浊液装入15ml离心管中，1500rpm，4℃离心5min；
c.倒掉上清液，加入1ml红细胞裂解液，4℃裂解8min，1500rpm，4℃离心5min；
d.倒掉上清液，加入1mlpbe，1500rpm，4℃离心5min；
e.倒掉上清液，加入1mlpbe，混匀，计数，取出1×107细胞/80μl标抗体。
f.抗体标记同上述小鼠骨髓造血干祖细胞分析一致。
4.小鼠骨髓细胞集落形成实验
a.提前将m3434培养基涡旋均匀，分装于10ml的管子中，每管3ml，冻于-20℃备用；
b.取model组和ict组小鼠各5只，通过脱臼法牺牲后，在75％乙醇中浸泡2分钟，剪下每只小鼠的一只后肢，剥离胫骨和股骨上的肌肉，放入装有3ml的pbe中，用吸有1ml的pbe的注射器冲出骨髓，装于提前装有3mlpbe的流式管中，吹打均匀细胞；
c.过100目尼龙膜，4℃1500rpm离心5min；
d.倒掉上清液，加入3mlpbe,混悬均匀；
e.取出10μl细胞悬液，加入10μl白细胞稀释液，混匀，置于室温裂解1min，加入480μlpbe，涡旋均匀，准确计数；
f.调整细胞浓度，6×104全骨髓细胞/150ul，取出150ul加入提前分装好的3mlm3434培养基中，充分涡旋均匀，放于室温，静置30min，使培养基中的气泡散尽；
g.将混匀的细胞种于12孔板中，每孔1ml，于37℃，5％co2培养箱中培养7-10天；
h.取出细胞，计数细胞集落。
5.小鼠骨髓造血干细胞竞争性移植实验
【第一次移植】
a.致死剂量照射野生型cd45.1受体小鼠，每次4.75gy，一共照射两次，中间间隔3个小时，4个小时后进行尾静脉移植；
b.取model组和ict组小鼠(cd45.2)各5只，通过脱臼法牺牲后，在75％乙醇中浸泡2分钟，剪下每只小鼠的一只后肢，剥离胫骨和股骨上的肌肉，放入装有3ml的pbe中，用吸有1ml的pbe的注射器冲出骨髓，装于提前装有3mlpbe的流式管中，吹打均匀细胞；
c.过100目尼龙膜，4℃1500rpm离心5min；
d.倒掉上清液，使用磁珠富集小鼠c-kit 造血干/祖细胞；
e.每管样品管加入5×106/80μlc-kit 细胞，加入下列表格中的抗体，4℃敷育30min；
f.样品管中加入下列表中的抗体，4℃孵育30min；
g.加入1mlpbe洗一遍，4℃1500rpm离心5min；
h.倒掉上清液，加300-500μlpbe重悬细胞，过膜，加入0.5μldapi，上机分选lt-hscs(cd45.2)；
i.将lt-hscs(cd45.2)1500个和5×105全骨髓竞争细胞(cd45.1)混合均匀，体积为300ul，尾静脉移植入受体小鼠(cd45.1)中；
j.每隔4周取一次小鼠尾血，标记下列抗体检测供体来源的细胞比例和各系分化的情况；
k.16周后，通过脱臼牺牲小鼠，标记下列抗体检测骨髓中各系分化和造血重建情况。
【第二次移植】
a.致死剂量照射野生型cd45.1受体小鼠，每次4.75gy，一共照射两次，中间间隔3个小时，4个小时后进行尾静脉注射移植；
b.第一次移植16周后，通过脱臼牺牲第一次移植的受体小鼠，冲出小鼠后肢胫骨、股骨以及髂骨的全骨髓细胞，准确计数；
c.取第一次移植受体小鼠的1×106全骨髓细胞，体积为300ul，通过尾静脉移植入第二次移植的受体小鼠体内；
d.每隔4周取一次小鼠尾血，检测供体来源的细胞比例和各系分化的情况，抗体配方同第一次移植一致；
e.16-20周后，通过脱臼牺牲小鼠，检测二次移植小鼠骨髓中各系分化和造血重建情况，抗体配方同第一次移植一致。
6.小鼠骨髓造血干细胞周期实验(使用bdintrasuretmkit破膜剂)
a.取model组和ict组小鼠各6只，通过脱臼法牺牲后，在75％乙醇中浸泡2分钟，剪下每只小鼠的一只后肢，剥离胫骨和股骨上的肌肉，放入装有3ml的pbe中，用吸有1ml的pbe的注射器冲出骨髓，装于提前装有3mlpbe的流式管中，吹打均匀细胞；
b.过100目尼龙膜，4℃1500rpm离心5min；
c.倒掉上清液，使用磁珠富集小鼠c-kit 造血干/祖细胞；
d.每管样品管加入5×106/80μlc-kit 细胞；
e.加入下列抗体，在4℃敷育30min；
5×106bmc-kit cells
f.样品管中加入1mlpbe洗一遍，4℃1500rpm离心5min；
g.倒掉上清液，加入50μlreagenta，混匀，室温敷育5min；
h.加入1mlpbe洗一遍，4℃1500rpm离心5min；
i.倒掉上清液，加入100μlreagentb和5μlki-67apc，混匀后，放于室温敷育30min；
j.取出样品管，加入1mlpbe洗去非特异性标记抗体，4℃1500rpm离心5min；
k.倒掉上清液，加入500μlpbe重悬细胞，加入hoechst33342,使其终浓度为20μg/ml,混匀，过膜，上机。
实验结果：
如图2(a)所示，口服3mg/kg淫羊藿素能显著性增加小鼠骨髓中造血干祖细胞比例和绝对数。同时，如图2(b)所示，口服3mg/kg淫羊藿素能够显著性使化疗损伤小鼠骨髓中的造血干细胞更多的处于静息期。如图2(c)，口服3mg/kg淫羊藿素能够显著性增强骨髓抑制小鼠骨髓细胞集落形成能力。图2(d)所示，口服3mg/kg淫羊藿素能够显著性增强骨髓抑制小鼠骨髓造血干细胞的造血能力和自我更新能力。以上结果提示，淫羊藿素能够增加能够改善骨髓抑制后出现的白细胞以及血小板减少是由造血干细胞数量增加和功能增强引起。
实施例三、淫羊藿素能够增加骨髓抑制小鼠骨髓中间充质干细胞数量，促进其造血支持能力，促进其成骨分化能力，抑制其成脂分化能力
实验材料：
1.c57bl/6j小鼠(白细胞抗原表型为cd45.2)：b6-ly5.2以下简称c57，由中国医学科学院血液学研究所动物房提供。
饲养条件同实施例一。
实验方法：
1.分选单细胞转录组测序的小鼠骨髓微环境细胞
a.将小鼠脱颈处死，用75％乙醇浸泡；
b.取下小鼠的后肢的股骨和胫骨，用无菌纱布剥去肌肉组织，将骨头放入的提前预冷的pbs中；
c.使用精细剪刀平整的剪开股骨的近端，1ml注射器内吸取pbs，由近端进入股骨后迅速冲出plug；平整的剪开胫骨的远端，1ml注射器内吸取pbs，由远端进入股骨后迅速冲出plug；上述操作均在1.5mlep管中进行；
d.小心的吸走ep管内的pbs，每管内加入1ml的下列消化酶，37℃，200rpm水浴摇动消化25-35min，期间每隔5min取出上下颠倒20次并观察消化情况；
e.将c步剩下的骨放入研钵中，加入1ml的下列消化酶，研碎骨，使骨内膜暴露出来，收集研钵中的消化酶和骨片，装于1.5mlep管中，37℃，200rpm水浴摇动消化30-35min；
f.待消化完成，将d和e步的样品取出水浴锅，每管中加入5mlpbe终止消化，100目尼龙膜过滤；
g.4℃，1500rpm，离心5min，加入80μlpbe重悬，加入混匀的40μllineage-biotincocktail，混匀，放于4℃敷育10min；
h.使用1mlpbe洗去非特异性结合cocktail，4℃，1500rpm，离心5min，加入80μlpbe重悬，加入40μl混匀的anti-biotin磁珠和细胞混合均匀，放于-20℃敷育15min；
i.使用1mlpbe洗去非特异性结合磁珠，4℃，1500rpm，离心5min，加入500μlpbe重悬细胞团块；
j.将mscolumn安装在macsseparator上的凹槽中，加入1mlpbebuffer润湿柱子，将细胞悬液吹打均匀后，通过100目尼龙膜加入到柱子中，将流出的液体收集于15ml离心管中(提前用pbe润湿管壁)，用0.5mlpbe充分洗涤column3次，收集流出液体；
k.将流出液4℃，1500rpm，离心5min，倒掉上清液，使用80μlpbe重悬细胞得到lineage-骨髓微环境细胞；
l.加入下列抗体，4℃敷育30min；
m.使用1mlpbe洗去非特异性结合抗体，4℃，1500rpm，离心5min；
n.倒掉上清液，使用200μlpbe重悬细胞团块，加入100μlcalceinam工作液，37℃，敷育15min，加入1/1000dapi，过100目尼龙膜，上机分选dapi-calceinam cd71-ter119-cd45-的细胞。
2.流式检测小鼠骨髓间充质细胞
a.将小鼠脱颈处死，用75％乙醇浸泡；
b.取下小鼠的后肢的股骨和胫骨，用无菌纱布剥去肌肉组织，将骨头放入的提前预冷的pbs中；
c.使用精细剪刀平整的剪开股骨的近端，1ml注射器内吸取pbs，由近端进入股骨后迅速冲出plug；平整的剪开胫骨的远端，1ml注射器内吸取pbs，由远端进入股骨后迅速冲出plug；上述操作均在1.5mlep管中进行；
d.小心的吸走ep管内的pbs，每管内加入1ml的下列消化酶，37℃，200rpm水浴摇动消化25-35min，期间每隔5min取出上下颠倒20次并观察消化情况；
e.待消化完成，将样品取出水浴锅，每管中加入5mlpbe终止消化，过膜；
f.4℃，1500rpm，离心5min，加入80μlpbe重悬；
g.加入3μllepr-biotin抗体，4℃敷育30min；
h.使用1mlpbe洗去非特异性结合的抗体，4℃，1500rpm，离心5min，加入80μlpbe重悬；
i.加入下列抗体，4℃敷育30min；
j.使用1mlpbe洗去非特异性结合抗体，4℃，1500rpm，离心5min；
k.倒掉上清液，使用500μlpbe重悬细胞团块，加入1/1000dapi,过100目尼龙膜，上机检测。
3.流式检测小鼠骨髓成骨细胞
a.将小鼠脱颈处死，用75％乙醇浸泡；
b.取下小鼠的后肢的股骨和胫骨，用无菌纱布剥去肌肉组织，将骨头放入的提前预冷的pbs中；
c.使用1mlpbs冲出髓腔内容物，加入1ml的下列消化酶，研碎骨，使骨内膜暴露出来，收集研钵中的消化酶和骨片，装于1.5mlep管中，37℃，200rpm水浴摇动消化30-35min；
d.待消化完成，将样品取出水浴锅，每管中加入5mlpbe终止消化，100目尼龙膜过滤；
e.4℃，1500rpm，离心5min，加入80μlpbe重悬；
f.加入下列抗体，4℃敷育30min；
g.使用1mlpbe洗去非特异性结合抗体，4℃，1500rpm，离心5min；
h.倒掉上清液，使用200μlpbe重悬细胞团块，加入100μlcalceinam工作液，37℃，敷育15min；
i.过100目尼龙膜，上机检测。
4.小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化实验
a.参考上述方法消化提取小鼠微环境mscs细胞；
b.按照每孔4×106细胞接种于六孔板中，放于37℃，5％co2孵箱中培养；
c.之后每3天换培养基，每次换培养基之前用无菌pbs洗涤细胞2次；
d.当每孔细胞融合达70％左右时，按照cyagen小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化试剂盒诱导分化；
e.小心的吸走孔中的培养基，加入3ml小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化完全培养基；
f.之后每隔3天换用新鲜的成骨诱导培养基(使用之前需要预热至37℃)；
g.诱导2-4周后，观察细胞的形态，准备使用茜素红进行染色；
h.吸走六孔板中的诱导剂，使用2mlpbs洗1遍；
i.吸走pbs，使用2ml4％多聚甲醛室温固定2h；
j.吸走六孔板中的多聚甲醛，使用2mlpbs洗2遍；
k.吸走pbs，每孔加入1ml茜素红染液室温作用3-5分钟；
l.吸走茜素红，使用2mlpbs洗2遍。
5.小鼠骨髓间充质干细胞成脂分化实验
a.参考上述方法消化提取小鼠微环境mscs细胞；
b.按照每孔6×106细胞接种于六孔板中,放于37℃，5％co2孵箱中培养；
c.之后每3天换培养基，每次换培养基之前用无菌pbs洗涤细胞2次；
d.当每孔细胞融合达80-90％时，按照cyagen小鼠骨髓间充质干细胞成脂诱导分化试剂盒诱导分化；
e.小心的吸走孔中的培养基，加入3ml小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化完全培养基a液(使用之前需要预热至37℃)；
f.诱导3天后，小心吸走六孔板中的液体，加入成脂诱导培养基b液(使用之前需要预热至37℃)；
g.24h后，吸走b液，换回a液；
h.如此重复，当a、b液交替作用3次左右后，用b液维持培养4-7天直到脂滴变大、变圆；
i.小心吸走六孔板中的诱导剂，使用2mlpbs洗1遍；
j.小心吸走pbs，使用2ml4％多聚甲醛室温固定2h；
k.吸走六孔板中的多聚甲醛，使用2mlpbs洗2遍；
l.吸走pbs，每孔加入1ml油红o染液室温作用30分钟；
m.吸走油红o染液，使用2mlpbs洗2遍；
n.置于显微镜下观察、拍照。
6.小鼠骨髓中scf和cxc12表达的检测
a.将model组和ict组小鼠脱颈处死，按照上述方法取下小鼠股骨和胫骨；
b.每只小鼠用1mlpbs冲出股骨和胫骨的全骨髓细胞；
c.1500rpm，4℃，离心5min；
d.小心的吸取上清液，冻于4℃；
e.按照abcamscf/cxcl12elisa试剂盒进行检测。
实验结果：
单细胞转录组(图3a)所示和流式(图3b)结果同时显示，口服3mg/kg淫羊藿素能够显著增加化疗损伤小鼠骨髓的间充质干细胞和成骨细胞数。另外，口服3mg/kg淫羊藿素能够抑制化疗损伤小鼠骨髓间充质干细胞向成脂分化(图3c)，促进其向成骨细胞分化(图3d)。另外，如图3(e)所示，淫羊藿素能够显著性增加骨髓抑制小鼠骨髓中scf和cxcl12的表达。
实施例四、淫羊藿素体外能够提高受损骨髓间充质干细胞cfu形成能力，促进其造血支持能力，促进其成骨分化能力，抑制其成脂分化能力
实验材料：
1.原代受损骨髓间充质干细胞：从化疗损伤c57小鼠骨髓中提取获得。
2.c57bl/6j小鼠(白细胞抗原表型为cd45.2)：b6-ly5.2以下简称c57，由中国医学科学院血液学研究所动物房提供。
3.b6.sjl小鼠(白细胞抗原表型为cd45.1)：b6-ly5.1以下简称b6，由中国医学科学院血液学研究所动物房提供。
饲养条件同实施例一，骨髓移植后的小鼠用含有抗生素的水(取800μl拜诺欣加入300ml饮用水中)喂养2周，以防小鼠感染。
实验方法：
1.化疗损伤骨髓间充质干细胞的获取
a.取10w雌性c57小鼠，腹腔一次性注射200mg/kg环磷酰胺(10g小鼠/0.1ml)；
b.48h后处死小鼠，取下小鼠的后肢的股骨和胫骨，用无菌纱布剥去肌肉组织，将骨头放入的提前预冷的pbs中；
c.使用精细剪刀平整的剪开股骨的近端，1ml注射器内吸取pbs，由近端进入股骨后迅速冲出plug；平整的剪开胫骨的远端，1ml注射器内吸取pbs，由远端进入股骨后迅速冲出plug；上述操作均在1.5mlep管中进行；
d.小心的吸走ep管内的pbs，每管内加入1ml的下列消化酶，37℃，200rpm水浴摇动消化25-35min，期间每隔5min取出上下颠倒20次并观察消化情况；
e.待消化完成，将样品取出水浴锅，每管中加入5mlpbe终止消化，100目尼龙膜过膜，4℃，1500rpm，离心5min，加入1mlpbe重悬，获得细胞。
2.化疗损伤骨髓间充质干细胞体外cfu-f实验
a.按照上述方法消化获取受损mscs；
b.按照每孔1×105细胞接种于六孔板中，放于37℃，5％co2孵箱中培养；
c.第4天换培养基(高糖dmem，20％fbs，1％penicillin-streptomycin)并加入1μmict或dmso；
d.之后每3天换培养基，每次换培养基之前用无菌pbs洗涤细胞2次；
e.培养8-10天时，待肉眼能够看到孔中的集落时，使用4％多聚甲醛室温固定2h；
f.使用移液枪移走多聚甲醛，使用pbs小心清洗2遍；
g.使用结晶紫(0.5％)室温染色3分钟；
h.使用流动的水快速冲走结晶紫染料；
i.使用显微镜计数，当细胞聚集且计数超过40个时计为一个cfu-f。
3.化疗损伤骨髓间充质干细胞成骨分化实验
a.按照上述方法消化提取化疗损伤mscs细胞；
b.按照每孔3×106细胞接种于六孔板中，放于37℃，5％co2孵箱中培养；
c.前三天每天换液，每次换培养基之前用无菌pbs洗涤细胞2次；
d.第四天换液的同时，加入1μmict或dmso；
e.第十天时，按照cyagen小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化试剂盒诱导分化；
f.小心的吸走孔中的培养基，加入3ml小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化完全培养基；
g.之后每隔3天换用新鲜的成骨诱导培养基(使用之前需要预热至37℃)；
h.诱导2-4周后，观察细胞的形态，准备使用茜素红进行染色；
i.吸走六孔板中的诱导剂，使用2mlpbs洗1遍；
j.吸走pbs，使用2ml4％多聚甲醛室温固定2h；
k.吸走六孔板中的多聚甲醛，使用2mlpbs洗2遍；
l.吸走pbs，每孔加入1ml茜素红染液室温作用3-5分钟；
m.吸走茜素红，使用2mlpbs洗2遍，置于显微镜下观察、拍照。
4.化疗损伤骨髓间充质干细胞成脂分化实验
n.按照上述方法消化提取受损mscs细胞；
o.按照每孔5×106细胞接种于六孔板中，放于37℃，5％co2孵箱中培养；前三天每天换液，每次换培养基之前用无菌pbs洗涤细胞2次；
p.第四天换液的同时，加入1μmict或dmso；
q.第十天时，按照cyagen小鼠骨髓间充质干细胞成脂诱导分化试剂盒诱导分化；
r.小心的吸走孔中的培养基，加入3ml小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化完全培养基a液(使用之前需要预热至37℃)；
s.诱导3天后，小心吸走六孔板中的液体，加入成脂诱导培养基b液(使用之前需要预热至37℃)；
t.24h后，吸走b液，换回a液；
u.如此重复，当a、b液交替作用3次左右后，用b液维持培养4-7天直到脂滴变大、变圆；
v.小心吸走六孔板中的诱导剂，使用2mlpbs洗1遍；
w.小心吸走pbs，使用2ml4％多聚甲醛室温固定2h；
x.吸走六孔板中的多聚甲醛，使用2mlpbs洗2遍；
y.吸走pbs，每孔加入1ml油红o染液室温作用30分钟；
z.吸走油红o染液，使用2mlpbs洗2遍，置于显微镜下观察、拍照。
5.造血支持因子检测scf、cxcl12、angpt1、vcam1的mrna表达检测
a.将种有mscs的6孔板取出孵箱，每孔加入1mltrizol，立即反复吹打约20次，使细胞充分裂解，室温下静置5min；
b.将6孔板中的样本移入无核酶的1.5mlep管中，加入200μl氯仿，剧烈震荡15-20次，使rna与蛋白质充分分离开来，室温静置10min；
c.2000rpm，4℃，离心15min；
d.溶液分层，小心的吸出上层500μl，移入新的ep管中，勿吸中间层及下层，加入等体积的异丙醇，同时加入5-10μg的糖原以及50μl3m的氯化钠，使得沉淀更为显著，室温下静置10min；
e.12000rpm，4℃，离心15min；
f.小心的吸走上清，在沉淀中加入1ml75％乙醇，7500rpm，4℃，离心5min，该步骤重复两次；
g.弃上清，空离10-20s，去上清，室温下静置2min，加30μl无rna酶水溶解；
h.用nanodrop测rna浓度；-80保存或立即进行逆转录pcr；
i.逆转录pcr(本实验采用20ul体系)：【按照takararr036a试剂盒操作】取无核酶8连管，加入5×primescriptrtmastermix4μl，每管加入rnasample1000ng，使用无rna酶水，补足20ul，盖紧盖子，放入pcr仪，按照下列程序进行逆转录；
j.逆转录程序
k.取出8连管，cdna冻存于-20℃备用；
l.实时荧光定量pcr(本实验采用10ul体系)：【按照takararr430a试剂盒操作】
按照下列组分配制pcr反应液(在冰上进行)
m.qpcr反应程序：采用三步法
◆holdingstage
reps：1
95℃30s
◆cyclingstage
numberofcycles：4095℃5s
60℃34s
◆meltcurvestage
n.引物序列
cxcl12：5’-ccagagccaacgtcaagcat-3’(seqidno.1)
5’-cagccgtgcaacaatctgaa-3’(seqidno.2)
scf：5’-aggcagttaggtgtagttgggt-3’(seqidno.3)
5’-gtggcataagggctcactcc-3’(seqidno.4)
angpt1：5’-acaggaggttggtggttcgat-3’(seqidno.5)
5’-gggaacatgcccagctttctt-3’(seqidno.6)
vcam1：5’-tgaactgattatccaagtctctcca-3’(seqidno.7)
5’-tggtgtacgagccatccaca-3’(seqidno.8)
gapdh：5’-gatcgtggaagggctaatga-3’(seqidno.9)
5’-gagctctgggatgactttgc-3’(seqidno.10)
6.体内竞争性移植实验
a.按照上述方法获取化疗损伤mscs；
b.将细胞1×106/孔铺于6孔板；
c.前三天每天换液，换液前使用pbs轻柔的清洗细胞；
d.第四天换液时，加入对应浓度的ict或dmso；
e.药物作用6天后，吸走原有培养基；
f.加入sfem培养基，同时按照上述方法获取受损c-kit 细胞，每孔加入2×105c-kit 细胞，培养基中加入10ng/mltpo和10ng/mlscf，共培养6天；
g.收取每孔所有细胞，标记下列抗体，4℃标记30min；
h.取出流式管，加入1mlpbe洗去非特异性的抗体，1500rpm，4℃，离心5min；
i.倒掉上清液，加入400μlpbe及0.1％dapi，流式分选dapi-cd45 (背景为cd45.2)的细胞；
j.加入2×105cd45.1全骨髓细胞，体积调整为300μl，尾静脉注射至致死剂量照射的cd45.1受体小鼠中；
k.每4周取小鼠外周血进行供体来源的细胞比例检测。
实验结果：
如图4(a)所示，1μm淫羊藿素体外能够增加受损骨髓间充质干细胞的cfu-f形成能力。同时，1μm淫羊藿素体外能够显著性抑制受损骨髓间充质干细胞向成脂细胞分化(图4b所示)，促进其向成骨细胞分化(图4c所示)。如图4(d)所示，1μm淫羊藿素体外能够显著性促进受损骨髓间充质干细胞中scf、cxcl12、angpt1、vcam1的mrna表达。同时，如图4(e)所示，c-kit 细胞与1μm淫羊藿素体外预处理6天后的骨髓间充质干细胞共培养后，其造血重建功能增强。以上结果显示，1μm淫羊藿素体外能够增强受损骨髓间充质干细胞造血支持能力。
本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明精神之前提下，本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰，所述改变和修饰同样落入本申请所附权利要求的覆盖范围。
序列表
<110>上海中医药大学
<120>淫羊藿素的医药用途
<130>jsp12103986
<160>10
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
ccagagccaacgtcaagcat20
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
cagccgtgcaacaatctgaa20
<210>3
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
aggcagttaggtgtagttgggt22
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
gtggcataagggctcactcc20
<210>5
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
acaggaggttggtggttcgat21
<210>6
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
gggaacatgcccagctttctt21
<210>7
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
tgaactgattatccaagtctctcca25
<210>8
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>8
tggtgtacgagccatccaca20
<210>9
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>9
gatcgtggaagggctaatga20
<210>10
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>10
gagctctgggatgactttgc20
1.淫羊藿素在制备防治骨髓抑制的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述淫羊藿素是作为唯一的活性成分应用于防治骨髓抑制的药物的制备中。
3.淫羊藿素在制备升白细胞和/或血小板的药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述淫羊藿素是作为唯一的活性成分应用于升白细胞和/或血小板的药物的制备中。
5.淫羊藿素在制备促进骨髓造血干细胞增殖的药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述淫羊藿素是作为唯一的活性成分应用于促进骨髓造血干细胞增殖的药物的制备中。
7.淫羊藿素在制备促进骨髓间充质干细胞增殖的药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述淫羊藿素是作为唯一的活性成分应用于促进骨髓间充质干细胞增殖的药物的制备中。
9.淫羊藿素在制备促进骨髓间充质干细胞成骨分化的药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述淫羊藿素是作为唯一的活性成分应用于促进骨髓间充质干细胞成骨分化的药物的制备中。
11.淫羊藿素在制备抑制骨髓间充质干细胞成脂分化的药物中的应用。
12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述淫羊藿素是作为唯一的活性成分应用于抑制骨髓间充质干细胞成脂分化的药物的制备中。
技术总结