本发明涉及一种增强型荧光碳点及制备方法和在镉离子检测中的应用，属于荧光碳纳米材料制备技术领域。
背景技术：
随着现代工业的发展，重金属污染已严重威胁着人类健康和环境安全，在各种重金属离子中，镉离子是最严重的污染源之一。cd2 在人体内有10-30年的半衰期，被列为强致癌物。cd2 可对人的肺、肾、骨和神经系统造成严重损伤，引发骨病、心脏病和糖尿病等。因此，对于镉离子的检测在疾病的诊断、环境监测等方面具有十分重要的意义。目前，研究人员开发了一系列镉离子的检测方法，如循环伏安法、原子吸收光谱法、电感耦合等离子光谱法等。这些技术需要复杂的样品制备过程和昂贵仪器的使用，不适合实时监测，而在荧光检测方法中，以荧光强度的增强或猝灭作为输出信号来指示镉离子的动态变化，不仅简单方便，响应快速，而且灵敏度高，选择性好，易于实时监测。荧光素-喹啉、联吡啶、噻吩酰肼等有机小分子为骨架，被设计成荧光探针来检测镉离子，但是这些有机分子不仅难溶于水而且对人体有害，不能长期存在于体内，因此限制了其推广和应用。
碳点以其高水溶性、耐光漂白、优异的生物相容性、易于合成和化学修饰等优点，已被人们所熟知，广泛应用于生物成像、传感、药物传递、光催化等领域。目前，用碳点来检测铁离子、铝离子、汞离子、铜离子等的报道已经有很多，但是用碳点来检测镉离子的却很少，gu等以大葱为碳源，制备了一种蓝色碳点，对cd2 离子进行检测。但是，该碳点发射波长较短(450nm)，容易受到细胞内自荧光干扰，不仅组织穿透能力差，而且与镉离子的响应为荧光猝灭型，大大降低了细胞内镉离子检测的灵敏度。因此，检测细胞内cd2 的材料在实际应用中面临着一些问题亟需解决：(1)生物毒性大；(2)多为猝灭型，灵敏度低，选择性差；(3)多为短波长发射，缺乏长波长发射的碳点。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供了一种增强型荧光碳点的合成方法，以及基于增强型荧光碳点检测cd2 的方法。本发明利用煅烧法制备的荧光碳点作为增强型荧光探针，其简单的制备方法具有大量合成的特点，制备的荧光碳点不仅生物毒性小，而且对cd2 有很好的选择性和灵敏度。
本发明的第一个目的是提供一种增强型荧光碳点的制备方法，所述方法包括：将碳源a和碳源b混合，然后进行煅烧即制备得到增强型荧光碳点，其中，所述碳源a包括水杨酸、邻苯二甲酸、苯甲酸中的一种或几种；所述碳源b为邻二氮杂菲或其衍生物，其中，邻二氮杂菲的衍生物为带有氨基、羧基或羟基的一种或几种基团的衍生物。
在本发明的一种实施方式中，所述氨基、羧基或羟基直接连接在邻二氮杂菲的环上。
在本发明的一种实施方式中，所述衍生物的取代基团(氨基、羧基或羟基)包括一个或多个。
在本发明的一种实施方式中，所述碳源a和碳源b的质量比为100:(3-15)。
在本发明的一种实施方式中，所述充分混合的方式优选为研磨混合。
在本发明的一种实施方式中，所述煅烧的操作参数为：180-220℃下煅烧2-6h。
在本发明的一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：
(1)将碳源a和碳源b充分研磨；
(2)将所得的混合粉末于180-220℃下煅烧2-6h，冷却后溶于水后进行纯化，干燥后即得增强型荧光碳点。
在本发明的一种实施方式中，所述纯化是利用以下任意一种或两种方式进行：微孔滤膜过滤或透析。
在本发明的一种实施方式中，所述微孔滤膜过滤的微孔直径为0.22μm-0.45μm。
在本发明的一种实施方式中，所述透析是在500da-3500da下透析24-72h。
在本发明的一种实施方式中，所述干燥是进行真空冷冻干燥或旋转蒸发干燥。
本发明的第二个目的是提供上述方法制备得到的增强型荧光碳点。
本发明的第三个目的是提供一种检测镉离子的方法，所述方法采用上述增强型荧光碳点来进行检测。
在本发明的一种实施方式中，所述方法用于检测细胞内的镉离子。
本发明具有以下有益的技术效果：
1)本发明的荧光碳点是通过简单的研磨后煅烧合成的，邻二氮杂菲或其衍生物的基团(氨基、羧基或羟基)能够在和苯甲酸，水杨酸，邻苯二甲酸在碳化的过程形成稳定的共轭体系，与镉离子反应时，使体系的刚性增加，导致荧光增强。本发明方法简单，可以大量制备，成本低。
2)本发明所得的荧光碳点对cd2 有很高的选择性，其荧光强度与镉离子的浓度在5μm-100μm内呈现良好的线性关系，检测限为0.304μmol/l。因此该探针可以灵敏的定量检测cd2 ，此外，该荧光碳点的细胞毒性小，因此，可以利用荧光增强的信号来检测细胞内的镉离子。
附图说明
图1为实施例1的红色碳点的透射电子显微镜(tem)照片；
图2为实施例1的红色碳点的紫外光谱图；
图3为实施例1的红色碳点傅里叶变换红外光谱图；
图4为实施例1的红色碳点的荧光谱图；
图5为实施例1的红色碳对不同金属离子以及生物小分子的响应图；
图6为实施例1的红色碳点在加入不同浓度的镉离子后的荧光光谱图(a)及标准曲线图(b)；
图7为实施例1的红色碳点细胞存活率图；
图8为实施例1的红色碳点的细胞成像图；
图9为对比例1制备得到的碳点的荧光光谱图；
图10为对比例2制备得到的碳点的荧光光谱图；
图11为对比例3制备得到的碳点的荧光光谱图；
图12为对比例4制备得到的碳点的荧光光谱图；
图13为对比例5制备得到的碳点的荧光光谱图；
图14为对比例6制备得到的碳点的荧光光谱图；
图15为对比例7制备得到的碳点的荧光光谱图；
图16为实施例5制备得到的碳点的荧光光谱图；
图17为实施例6制备得到的碳点的荧光光谱图；
图18为实施例7制备得到的碳点的荧光光谱图；
图19为实施例8制备得到的碳点的荧光光谱图；
图20为实施例9制备得到的碳点的荧光光谱图；
图21为实施例10制备得到的碳点的荧光谱图；
图22为实施例11制备得到的碳点的荧光谱图；
图23为实施例12制备得到的碳点的荧光谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
将0.5g的水杨酸和0.025g的5-氨基-1,10-邻二氮菲研磨，使其充分混合，然后将粉末转移到25ml的坩埚中，将管式炉温度升至200℃，升温速率为5℃/min，保温2h。冷却至室温后，将产物溶于超纯水，用0.22μm微孔滤膜过滤，将滤液装入3500da的透析袋中，透析48h，将外液冷冻干燥即得到红色荧光碳点粉末。
将所得红色荧光碳点粉末溶解在超纯水中，滴在超薄铜网上，观察其形貌。碳点透射电子显微镜(tem)图如图1所示，可见，制备的碳点颗粒分散均匀，平均粒径为2.46nm。
将所制备的红色荧光碳点进行紫外光谱测试，结果如图2所示。红色荧光碳点在240nm处和290nm处有强的吸收，分别归因于芳香环的c＝c发生的π-π*跃迁，和c＝n/c＝o发生的n-π*跃迁，说明碳核有大的sp2共轭体系。
将所制备的红色荧光碳点表面基团通过傅里叶变换红外进行分析，结果如图3所示。所制备的红色碳点在1653cm-1和1484cm-1处有明显的吸收峰，分别归因于酰胺键的c＝o和n-h的伸缩振动。这表明水杨酸与5-氨基-1,10-邻菲罗啉碳化过程中，通过酰胺键结合在一起，形成了具有大共轭体系的碳点。
将所制备的红色荧光碳点的发光性能通过荧光光谱仪进行测试，结果如图4所示。红色荧光碳点的最大激发波长为450nm，发射峰位于605nm。
为了检测红色荧光碳点对cd2 的选择性，cd2 、其他干扰离子和生物小分子的荧光测试如图5所示。结果表明，常见的金属离子与生物小分子对红色荧光碳点的荧光强度影响都不大，镉离子的加入会使红色荧光碳点的荧光强度明显增加，说明所制备的碳点对cd2 具有特异性的响应。
所制备的红色荧光碳点对不同浓度的cd2 的响应结果如图6所示。图6a的结果表明，随着cd2 的不断增加，红色荧光碳点605nm处的荧光强度逐渐增强，图6b的结果表明cd2 的浓度在5-100μm内有良好的线性关系，检测限为304μmol/l。
利用cck-8试剂测试所制备的红色荧光碳点的细胞毒性，选用a549细胞株，用不同溶度的碳点(10μg/ml，20μg/ml，40μg/ml，60μg/ml，80μg/ml，100μg/ml，200μg/ml)与细胞进行培养，共孵育24h后，结果如图7所示。可见，细胞存活率仍然高于92％，说明所制备红色荧光碳点的细胞毒性很小，可用于细胞内的cd2 的检测。
利用所制备的红色荧光碳点检测细胞内的cd2 ，利用激光共聚焦显微镜进行观察。结果如图8所示。当细胞中不含镉离子时，红色荧光通道有微弱的信号，当细胞中含有50μm的镉离子时，红色通道显示出明亮的红色荧光，说明所制备的碳点能灵敏的检测细胞内的cd2 。
实施例2
称取0.5g的水杨酸和0.015g的5-氨基-1,10-邻二氮菲粉末放置于石英研钵中进行充分研磨，将混合均匀的粉末转移到25ml的石英坩埚中煅烧，管式炉温度升至200℃反应2h，升温速率5℃/min。冷却至室温后，得到的产物溶于超纯水，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，再经过1000da透析24h。最后经过冷冻干燥得到红色荧光碳点粉末。
利用实施例1的方式检测本实施例制备得到的红色荧光碳点粉末，可以发现制备的红色荧光碳点颗粒分散均匀，最大激发波长为450nm、发射峰位于605nm，对cd2 的选择性高、抗干扰能力强，细胞毒性很小，cd2 的浓度在5-100μm内有良好的线性关系，能灵敏的检测细胞内的cd2 。
实施例3
称取0.5g的水杨酸和0.05g的5-氨基-1,10-邻二氮菲粉末放置于石英研钵中进行充分研磨，转移到25ml的石英坩埚中煅烧，将管式炉温度升至220℃反应4h，升温速率5℃/min。冷却至室温，得到的产物溶于超纯水后，用0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液，再经过3500da透析36h。最后经过冷冻干燥得到红色荧光碳点粉末。
利用实施例1的方式检测本实施例制备得到的红色荧光碳点粉末，可以发现制备的红色荧光碳点颗粒分散均匀，最大激发波长为450nm、发射峰位于605nm，对cd2 的选择性高、抗干扰能力强，细胞毒性很小，cd2 的浓度在5-100μm内有良好的线性关系，能灵敏的检测细胞内的cd2 。
实施例4
称取0.5g的水杨酸和0.075g的5-氨基-1,10-邻二氮菲粉末放置于石英研钵中进行充分研磨，转移到25ml的石英坩埚中煅烧，将管式炉温度升至180℃反应6h，升温速率5℃/min。冷却至室温，得到的产物溶于超纯水后，用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液，再经过3500da透析24h。最后经过冷冻干燥得到红色荧光碳点粉末。
利用实施例1的方式检测本实施例制备得到的红色荧光碳点粉末，可以发现制备的红色荧光碳点颗粒分散均匀，最大激发波长为450nm、发射峰位于605nm，对cd2 的选择性高、抗干扰能力强，细胞毒性很小，cd2 的浓度在5-100μm内有良好的线性关系，能灵敏的检测细胞内的cd2 。
对比例1
参考实施例1，称取0.5g的丁二酸和0.025g的5-氨基-1,10-邻二氮菲研磨，使其充分混合，其他反应条件不变，所得到的碳点基本没有荧光。光谱如图9所示。
对比例2
参考实施例1，称取0.5g的酒石酸和0.025g的5-氨基-1,10-邻二氮菲研磨，使其充分混合，其他反应条件不变，所得到的碳点没有荧光。光谱如图10所示。
对比例3
参考实施例1，称取0.5g的柠檬酸和0.025g的5-氨基-1,10-邻二氮菲研磨，使其充分混合，其他反应条件不变，所得到的碳点没有荧光。光谱如图11所示。
对比例4
参考实施例1，称取0.5g的戊二酸和0.025g的5-氨基-1,10-邻二氮菲研磨，使其充分混合，其他反应条件不变，所得到的碳点发出蓝色荧光，且对cd2 不响应。光谱如图12所示。
对比例5
参考实施例1，称取0.5g的水杨酸和0.025g的二联吡啶研磨，使其充分混合，其他反应条件不变，得到的碳点发出蓝色荧光，且对cd2 不响应。光谱如图13所示。
对比例6
参考实施例1，称取0.5g的水杨酸和0.025g的4,4’二羧基-2,2’-二联吡啶研磨，使其充分混合，其他反应条件不变，得到的碳点发出蓝色荧光，且对cd2 呈现猝灭型响应。光谱如图14所示。
对比例7
参考实施例1，称取0.5g的水杨酸和0.025g的5,5’二羧基-2,2’-二联吡啶研磨，使其充分混合，其他反应条件不变，得到的碳点发出绿色荧光，且对cd2 呈现猝灭型响应。光谱如图15所示。
对比例8
参考实施例1，称取0.5g的水杨酸和0.025g的5-甲基-1,10-邻二氮菲研磨，使其充分混合，其他反应条件不变，不能得到的荧光碳点。
对比例9
参考实施例1，称取0.5g的水杨酸和0.025g的4,4-二苯基-1,10-邻二氮菲研磨，使其充分混合，其他反应条件不变，不能得到的荧光碳点。
对比例10
参考实施例1，称取0.5g的水杨酸和0.025g的2,9-二甲醇-1,10-邻二氮菲研磨，使其充分混合，其他反应条件不变，不能得到的荧光碳点。
实施例5
称取0.5g的邻苯二甲酸和0.025g的5-氨基-1,10-邻二氮菲粉末放置于石英研钵中进行充分研磨，转移到25ml的石英坩埚中煅烧，将管式炉温度升至200℃反应2h，升温速率5℃/min。冷却至室温，得到的产物溶于超纯水后，用0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液，再经过1000da透析72h。最后经过冷冻干燥得的碳点发出绿色的荧光，加入cd2 后，碳点荧光增强。光谱如图16所示，可见，制备得到的碳点能够用于检测cd2 。
利用实施例1的方式检测本实施例制备得到的荧光碳点粉末，可以发现制备的荧光碳点颗粒分散均匀，对cd2 的选择性高、抗干扰能力强，细胞毒性很小，cd2 的浓度在5-100μm内有良好的线性关系，能灵敏的检测细胞内的cd2 。
实施例6
称取0.5g的苯甲酸和0.015g的5-氨基-1,10-邻二氮菲粉末放置于石英研钵中进行充分研磨，转移到25ml的石英坩埚中煅烧，将管式炉温度升至200℃反应4h，升温速率5℃/min。冷却至室温，得到的产物溶于超纯水后，用0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液，再经过3500da透析48h。最后经过冷冻干燥得到碳点发出橙色荧光。加入cd2 后，碳点荧光增强。光谱如图17所示，可见，制备得到的碳点能够用于检测cd2 。
利用实施例1的方式检测本实施例制备得到的荧光碳点粉末，可以发现制备的荧光碳点颗粒分散均匀，对cd2 的选择性高、抗干扰能力强，细胞毒性很小，cd2 的浓度在5-100μm内有良好的线性关系，能灵敏的检测细胞内的cd2 。
实施例7
称取0.5g的水杨酸和0.025g的1,10-邻二氮菲粉末放置于石英研钵中进行充分研磨，转移到25ml的石英坩埚中煅烧，将管式炉温度升至200℃反应3h，升温速率5℃/min。冷却至室温，得到的产物溶于超纯水后，用0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液，再经过1000da透析48h。最后经过冷冻干燥得到碳点发出蓝色荧光。加入cd2 后，碳点荧光增强。光谱如图18所示，可见，制备得到的碳点能够用于检测cd2 。
利用实施例1的方式检测本实施例制备得到的荧光碳点粉末，可以发现制备的荧光碳点颗粒分散均匀，对cd2 的选择性高、抗干扰能力强，细胞毒性很小，cd2 的浓度在5-100μm内有良好的线性关系，能灵敏的检测细胞内的cd2 。
实施例8
称取0.5g的水杨酸和0.025g的5-羧基-1,10-邻二氮菲粉末放置于石英研钵中进行充分研磨，转移到25ml的石英坩埚中煅烧，将管式炉温度升至200℃反应4h，升温速率5℃/min。冷却至室温，得到的产物溶于超纯水后，用0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液，再经过3500da透析36h。最后经过冷冻干燥得到碳点发出绿色荧光。加入cd2 后，碳点荧光增强。光谱如图19所示，可见，制备得到的碳点能够用于检测cd2 。
利用实施例1的方式检测本实施例制备得到的荧光碳点粉末，可以发现制备的荧光碳点颗粒分散均匀，对cd2 的选择性高、抗干扰能力强，细胞毒性很小，cd2 的浓度在5-100μm内有良好的线性关系，能灵敏的检测细胞内的cd2 。
实施例9
称取0.5g的水杨酸和0.025g的4,4’-二羟基-1,10-邻二氮菲粉末放置于石英研钵中进行充分研磨，转移到25ml的石英坩埚中煅烧，将管式炉温度升至200℃反应5h，升温速率5℃/min。冷却至室温，得到的产物溶于超纯水后，用0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液，再经过1000da透析24h。最后经过冷冻干燥得到碳点发出蓝色荧光。加入cd2 后，碳点荧光增强。光谱如图20所示，可见，制备得到的碳点能够用于检测cd2 。
利用实施例1的方式检测本实施例制备得到的荧光碳点粉末，可以发现制备的荧光碳点颗粒分散均匀，对cd2 的选择性高、抗干扰能力强，细胞毒性很小，cd2 的浓度在5-100μm内有良好的线性关系，能灵敏的检测细胞内的cd2 。
实施例10
称取0.5g的水杨酸和0.025g的5-羟基-1,10-邻二氮菲粉末放置于石英研钵中进行充分研磨，转移到25ml的石英坩埚中煅烧，将管式炉温度升至200℃反应2h，升温速率5℃/min。冷却至室温，得到的产物溶于超纯水后，用0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液，再经过3500da透析36h。最后经过冷冻干燥得到碳点发出绿色荧光。加入cd2 后，碳点荧光增强。光谱如图21所示，可见，制备得到的碳点能够用于检测cd2 。
利用实施例1的方式检测本实施例制备得到的荧光碳点粉末，可以发现制备的荧光碳点颗粒分散均匀，对cd2 的选择性高、抗干扰能力强，细胞毒性很小，cd2 的浓度在5-100μm内有良好的线性关系，能灵敏的检测细胞内的cd2 。
实施例11
称取0.5g的水杨酸和0.025g的5,5’-二氨基-1,10-邻二氮菲粉末放置于石英研钵中进行充分研磨，转移到25ml的石英坩埚中煅烧，将管式炉温度升至180℃反应4h，升温速率5℃/min。冷却至室温，得到的产物溶于超纯水后，用0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液，再经过500da透析36h。最后经过冷冻干燥得到碳点发出蓝色荧光。加入cd2 后，碳点荧光增强。光谱如图22所示，可见，制备得到的碳点能够用于检测cd2 。
利用实施例1的方式检测本实施例制备得到的荧光碳点粉末，可以发现制备的荧光碳点颗粒分散均匀，对cd2 的选择性高、抗干扰能力强，细胞毒性很小，cd2 的浓度在5-100μm内有良好的线性关系，能灵敏的检测细胞内的cd2 。
实施例12
称取0.5g的水杨酸和0.025g的2,2’-二羧基-1,10-邻二氮菲粉末放置于石英研钵中进行充分研磨，转移到25ml的石英坩埚中煅烧，将管式炉温度升至220℃反应4h，升温速率5℃/min。冷却至室温，得到的产物溶于超纯水后，用0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液，再经过1000da透析36h。最后经过冷冻干燥得到碳点发出蓝色荧光。加入cd2 后，碳点荧光增强。光谱如图23所示，可见，制备得到的碳点能够用于检测cd2 。
利用实施例1的方式检测本实施例制备得到的荧光碳点粉末，可以发现制备的荧光碳点颗粒分散均匀，对cd2 的选择性高、抗干扰能力强，细胞毒性很小，cd2 的浓度在5-100μm内有良好的线性关系，能灵敏的检测细胞内的cd2 。
当实施例7-12中的水杨酸替换为邻苯二甲酸或苯甲酸时，同样能够获得增强型荧光碳点，能够灵敏的检测细胞内的cd2 。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
1.一种增强型荧光碳点的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将碳源a和碳源b混合，然后进行煅烧即制备所得所述增强型荧光碳点，其中，所述碳源a包括水杨酸、邻苯二甲酸、苯甲酸中的一种或几种；所述碳源b为邻二氮杂菲或其衍生物，其中，邻二氮杂菲的衍生物为带有氨基、羧基或羟基的一种或几种基团的衍生物。
2.根据权利要求1所述的一种增强型荧光碳点的制备方法，其特征在于，所述碳源a和碳源b的质量比为100:(3-15)。
3.根据权利要求1或2所述的一种增强型荧光碳点的制备方法，其特征在于，所述煅烧的操作参数为：180-220℃下煅烧2-6h。
4.根据权利要求1～3任一所述的一种增强型荧光碳点的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将碳源a和碳源b充分研磨；
(2)将所得的混合粉末于180-220℃下煅烧2-6h，冷却后溶于水后进行纯化，干燥后即得增强型荧光碳点。
5.根据权利要求4所述的一种增强型荧光碳点的制备方法，其特征在于，所述纯化是利用以下任意一种或两种方式进行：微孔滤膜过滤或透析。
6.根据权利要求5所述的一种增强型荧光碳点的制备方法，其特征在于，所述微孔滤膜过滤的微孔直径为0.22μm-0.45μm，所述透析是在500da-3500da下透析24-72h。
7.根据权利要求4所述的一种增强型荧光碳点的制备方法，其特征在于，所述干燥是进行真空冷冻干燥或旋转蒸发干燥。
8.根据权利要求1～7任一项所述的一种增强型荧光碳点的制备方法制备得到的增强型荧光碳点。
9.一种检测镉离子的方法，其特征在于，所述方法采用权利要求8所述的增强型荧光碳点来进行检测。
10.根据权利要求9所述的一种检测镉离子的方法，其特征在于，所述方法用于检测细胞内的镉离子。
技术总结