本发明涉及柠檬黄的快速检测技术领域。
背景技术：
柠檬黄是一种人工合成的偶氮色素，通常被用于食品、化妆品和药品的着色剂。然而，研究表明过量摄入柠檬黄会对人体健康构成严重威胁。1964年联合国粮农组织和世界卫生组织下的食品添加剂联合专家委员会第一次评估了柠檬黄的毒理学特性。随后，科学家对柠檬黄的危害进行深入探索，发现柠檬黄对人体淋巴细胞有遗传毒性并能直接与dna结合，并且柠檬黄的摄入与焦虑、多动、睡眠失常等行为具有直接的因果关系。因此，建立一种快速、简单、准确、高灵敏的食品中柠檬黄快速检测方法对保障人类健康具有重要意义。
现有的柠檬黄检测技术主要包括电化学分析法、分光光度法、高效液相色谱法、高效薄层色谱法及毛细管电泳法。这些方法通常存在成本高、耗时长、设备贵、操作繁琐或样品制备过程复杂等不可避免的缺点，限制了它们在常规分析检测中的应用。近年来，荧光分析法因其灵敏度高、选择性好、测定速度快的特点，吸引了人们的广泛关注。目前，已有研究表明，基于金属纳米簇的荧光探针在柠檬黄检测方面展现出选择性好、灵敏度高的优势。然而，基于金属纳米材料的荧光探针不仅成本高、制备过程复杂，还存在生物毒性大、环境污染严重的问题。因此，探寻成本低、制备简单的环境友好型纳米材料用于分析检测是十分必要的。
碳量子点（cds）是一种近似球形、尺寸小于10nm的表面富有羧基和氨基的新型荧光碳纳米材料。自2004年首次发现cds以来，由于其具有高稳定性、低毒性、高水溶性和良好的生物相容性等优点，已广泛应用于生物成像、光学催化、生化传感等领域。近期研究表明，cds在食品添加剂（如姜黄素、谷胱甘肽、孔雀石绿等）快速检测方面展现出良好的应用前景。
目前，已有报道表明，cds能够作为探针用于柠檬黄的选择性检测。如mahnaz等以沙枣为原料，通过水热法制备cds，并将其用于食品样品中柠檬黄的检测，其检测限为86nm。xu等以芦荟为碳源制备氮掺杂的cds（n-cds），其在柠檬黄检测中获得了低至73nm的检测限。gumrukcuoglu等以尿素和甘三醇为原料制备氮掺杂的cds（n-cds），将其用于食品样品中柠檬黄的检测，检测限为180nm。但是，现有基于cds的荧光探针的检测性能仍有较大提升空间。因此，有必要探寻cds制备新路径以最大限度地提升cds探针对柠檬黄检测的灵敏度，从而为开发便携式柠檬黄快速检测器件提供理论依据及技术平台。
技术实现要素：
针对现有的基于cds的柠檬黄检测技术灵敏度的不足，本发明提出了一种基于氮磷掺杂碳量子点的制备方法。
本发明的技术方案是：常温下将葡萄糖、乙二胺和浓磷酸混合进行反应，反应结束并冷却后用透析膜透析，冷冻干燥后，得基于氮磷掺杂碳量子点n,p-cds。
本发明以廉价的葡萄糖、乙二胺、浓磷酸为反应前体，在不引入外源热源的情况下，通过酸碱中和自放热法制备碳量子点n,p-cds，不仅成本低，该碳量子点n,p-cds作为荧光探针还具有灵敏度高、选择性好等优势，相较于传统的柠檬黄检测方法，如电化学分析法、分光光度法、高效液相色谱法、高效薄层色谱法及毛细管电泳法，其还展现出简单、快速、低成本的优势。
碳量子点n,p-cds在检测方面具有成本低、易制备、优异的光学性能、良好的生物相容性及低毒性等优点，是一种环境友好型纳米材料，被认为具有替代传统的荧光染料和金属量子点的前景。碳量子点作为荧光探针不仅灵敏度高，选择性好，还具有简单、快速、重现性好等优势。
进一步地，所述葡萄糖、乙二胺和浓磷酸的投料比为0.2g∶3ml∶2ml。一般掺杂化碳量子点合成，需要碳源和杂原子供体。在本工作中，葡萄糖是碳源，乙二胺和浓磷酸分别为n和p原子的供体。乙二胺是碱性，与强酸混合后，由于酸碱中和作用会迅速放热，将葡萄糖碳化，能够瞬间制备出氮磷掺杂碳量子点。
进一步地，透析膜的截流分子量为500～1000da。选择透析膜是为了把反应产物中的小分子过滤掉，得到纯化的碳量子点。
进一步地，透析过程中每24h注入新的二次蒸馏水，透析时间为3天。将反应产物装入透析袋中，把透析袋口拧紧后，放入盛有1l二次蒸馏水的烧杯中，透析三天，每24h将烧杯中的二次蒸馏水倒掉，更换成新鲜的二次蒸馏水。在1l二次蒸馏水中透析3天，足以将反应产物中的小分子去除。
本发明的另一目的是提供基于氮磷掺杂碳量子点n,p-cds在柠檬黄快速检测中的应用。
本发明包括以下步骤：
1）用二次蒸馏水和基于氮磷掺杂碳量子点n,p-cds混合，得到n,p-cds溶液；
2）将柠檬黄与n,p-cds溶液混合，分别取得至少两种不同柠檬黄浓度的混合溶液，分别测得不同柠檬黄浓度的混合溶液的荧光强度，取得荧光猝灭效率f0/f与混合溶液中柠檬黄浓度的线性关系；
3）将待测样品与n,p-cds溶液混合，得到待测样品混合溶液，测得待测样品混合溶液的荧光强度；
4）根据荧光猝灭效率f0/f与混合溶液中柠檬黄浓度的线性关系得出待测样品混合溶液中柠檬黄的浓度。
本发明基于氮磷掺杂碳量子点n,p-cds的荧光方法用于柠檬黄快速检测，且其获得的灵敏度远高于现有的基于cds的荧光检测方法。另外，该方法还展现出高选择性、抗干扰性好、准确度高、操作简便、成本低等优点，可用于复杂食品基质中柠檬黄的检测。本发明解决了现有cds探针对柠檬黄检测灵敏度的不足，获得的检测限低至11.6nm，明显优于现有的基于cds的荧光检测方法。因此有着良好的应用推广价值。
进一步地，所述n,p-cds溶液中基于氮磷掺杂碳量子点n,p-cds的浓度为0.05mg/ml。经考查发现不同n,p-cds浓度对检测柠檬黄的影响结果是：随着n,p-cds浓度变化，f0/f也随之变化，当n,p-cds浓度为0.05mg/ml时，f0/f增加到最高值。因此，本发明优选浓度为0.05mg/ml的n,p-cds溶液作为检测柠檬黄的最佳n,p-cds浓度。
进一步地，所述步骤2）和3）中荧光强度在λex为370nm，λem为445nm下测定。选择这个波长是由于在激发波长λex为370nm时，发射波长强度最强，这是发射波长的中心位置，即λem为445nm。
进一步地，所述步骤2）中，在待测样品与n,p-cds溶液混合后1min时检测荧光强度。将两者混合后不同时间间隔检测反应体系的荧光强度，反复考察反应时间对检测柠檬黄的影响，向n,p-cds溶液加入柠檬黄后，f0/f在1.0min内迅速升至最高并保持稳定。因此，本发明选择1.0min为最佳荧光强度的检测时间。
同理，所述步骤3）中，在待测样品与n,p-cds溶液混合后1min时检测荧光强度。
附图说明
图1为基于氮磷掺杂碳量子点n,p-cds的tem图。
图2为基于氮磷掺杂碳量子点n,p-cds的粒径分布直方图。
图3为基于氮磷掺杂碳量子点n,p-cds的ftir图。
图4为基于氮磷掺杂碳量子点n,p-cds的紫外-可见吸收光谱、荧光激发光谱和发射光谱图。
图5为基于氮磷掺杂碳量子点n,p-cds在不同λex下的荧光λem光谱图。
图6为基于氮磷掺杂碳量子点n,p-cds吸收强度的荧光光谱强度积分图。
图7为柠檬黄浓度对基于氮磷掺杂碳量子点n,p-cds荧光强度的影响图。
图8为f0/f与柠檬黄浓度的线性关系图。
图9为硫酸奎宁和基于氮磷掺杂碳量子点n,p-cds对柠檬黄和各类小分子及阴阳离子的选择性图。
图10为基于氮磷掺杂碳量子点n,p-cds对柠檬黄和各类小分子及阴阳离子的抗干扰性图。
具体实施方式
1.制备基于氮磷掺杂碳量子点n,p-cds：
称取0.4g葡萄糖置于50.0ml玻璃烧杯中，加入6.0ml乙二胺和4.0ml浓磷酸（质量浓度85%），反应混合物在数秒内变为泡沫状。获得的反应产物自然冷却至室温，在装有1.0l二次蒸馏水的烧杯中用透析膜（mwco=500～1000da）透析3天，每24小时更换烧杯中的二次蒸馏水。在透析时，将反应产物装入透析袋中，把透析袋口拧紧后，放入盛有1l二次蒸馏水的烧杯中，透析三天，每24h将烧杯中的二次蒸馏水倒掉，更换成新鲜的二次蒸馏水。通过将反应产物在1l二次蒸馏水中，经过截流分子量500～1000da的透析膜透析3天，足以将反应产物中的小分子去除，得到深棕色含有n,p-cds的水溶液，冷冻干燥后得到深棕色n,p-cds粉末，置于干燥器中备用。
2.基于氮磷掺杂碳量子点n,p-cds的理化性质表征：
采用tem法对n,p-cds的形貌和尺寸分布进行表征。如图1所示，制备的n,p-cds分散均匀，具有类球形结构。
如图2所示，通过随机计数tem图像中50个颗粒的大小，得到的粒径分布直方图。n,p-cds的粒径分布范围为2.16‒5.11nm，平均粒径为3.49±0.3nm。
采用傅里叶红外光谱（ftir）对n,p-cds表面官能团进行表征。如图3所示，3475cm-1和3016cm-1处的宽吸收峰分别归属于‒nh伸缩振动和p‒oh弯曲振动，1652cm-1和1560cm-1处的强吸收峰分别对应c=o伸缩振动和c=n拉伸振动，1461cm-1处的吸收峰归因于‒ch3的弯曲振动。此外，在1355cm-1，1065cm-1，966cm-1处分别观察到了对应于p=o、p‒o‒c、p‒o‒h伸缩振动的吸收峰。以上结果表明，n和p被成功地掺杂进cds中。
采用紫外吸收-可见光（uv-vis）光谱法研究了n,p-cds的紫外吸收性质。如图4所示，n,p-cds的uv-vis光谱有两个吸收峰，分别位于260nm和340nm，前者是由于c=o键的n→π*跃迁，后者是n、p杂原子诱导的激发缺陷表面态。
图5为n,p-cds在不同λex下的荧光发射光谱。当λex从300nm增加至490nm时，n,p-cds的发射光谱表现出显著的λex依赖性。如图6所示，以硫酸奎宁为参考物质，测得n,p-cds的量子产率为6%,。
3.制作线性关系：
将基于氮磷掺杂碳量子点n,p-cds粉末溶于二次蒸馏水中，取得n,p-cds浓度为0.05mg/ml的n,p-cds溶液。
将柠檬黄分别与以上取得的2.0mln,p-cds溶液混合，取得柠檬黄浓度分别为0.1μm、0.2μm、0.5μm、0.7μm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm的混合溶液。
在柠檬黄与n,p-cds溶液混合后1min时检测荧光强度，在λex为370nm，λem为445nm条件下测定以上含有不同柠檬黄浓度的混合溶液的荧光强度。另外测定不加柠檬黄的空白n,p-cds溶液的荧光强度。
绘制荧光猝灭效率f0/f与混合溶液中柠檬黄浓度的线性关系图，其中f0和f分别代表添加柠檬黄前空白n,p-cds溶液、添加柠檬黄后混合溶液的荧光强度。
图7为在不同浓度柠檬黄（0.0～115.0μm）存在条件下，n,p-cds溶液荧光强度的变化。随柠檬黄浓度的增加，n,p-cds的荧光强度逐步降低，表明柠檬黄可以有效猝灭n,p-cds的荧光。
从图8可以看出，当柠檬黄浓度在0.01～10.0μm范围内时，其与f0/f呈良好线性关系，且符合stern-volmer方程，对应的检出限为11.6nm。将本发明与先前报道的基于cds的柠檬黄荧光检测方法做比较，结果显示，本发明的基于氮磷掺杂碳量子点n,p-cds的检测方法，其灵敏度远低于先前报道的基于cds的荧光检测法，表明本发明检测方法具有高灵敏度。
4.选择性：
在2.0mln,p-cds溶液（0.05mg/ml）中分别加入食品基质中可能存在的干扰物质，包含12种氨基酸（蛋氨酸，丝氨酸，精氨酸，苏氨酸，组氨酸，l-甲硫氨酸，甘氨酸，天冬氨酸，苯丙氨酸，丙氨酸，谷氨酸，亮氨酸）、5种小分子（氧化型谷胱甘肽，还原型谷胱甘肽，蔗糖，葡萄糖，d-果糖）、9种阳离子（ca2 ，na ，fe2 ，cr3 ，zn2 ，ba2 ，k ，mg2 ，cd2 ）、15种阴离子（cl-，c2o42-，br-，i-，h2po4-，co32-，s2o32-，so32-，hpo42-，hso3-，so42-，f-，ch3coo-，no3-，no2-），使其在n,p-cds溶液中的浓度为0.01mm。设置λex和λem分别为370nm和445nm，记录添加前后n,p-cds溶液的荧光强度。
如图9所示，只有向n,p-cds溶液中加入柠檬黄时，才会引起n,p-cds荧光强度的明显变化；向n,p-cds溶液中加入可能的干扰物质时，n,p-cds荧光强度未显现出明显变化，表明所制备的n,p-cds对柠檬黄检测具有高选择性。
5.抗干扰性：
向2.0mln,p-cds溶液（0.05mg/ml）中加入柠檬黄，柠檬黄在n,p-cds溶液中的浓度为0.01mm，再分别加入上述可能的干扰物质，干扰物质在n,p-cds溶液中的浓度为1.0mm。在λex为370nm，λem为445nm，记录添加干扰物质前后，n,p-cds和添加柠檬黄的混合溶液的荧光强度。
如图10所示，向n,p-cds/柠檬黄检测体系中加入上述干扰物质时，没有明显的荧光强度变化，表明基于n,p-cds对柠檬黄检测具有良好的抗干扰性。
6.实际样品测试：
以下使用的实际样品包括果冻、糖果、调料和饮料均来自当地超市。
对于固体样品，每种样品称取0.1g，转移至10.0ml离心管中，分别加入10.0ml二次蒸馏水，充分混合后以12,000rpm离心10.0min，取上层清液。
对于液体样品，量取20.0ml转移至50.0ml离心管中，超声20.0min以除去气泡，准确量取1.0ml超声后的样品至10.0ml离心管中，加入二次蒸馏水稀释至10.0ml。
上述样品提取液均通过醋酸纤维膜（0.22μm，13mm内径，天津津腾有限公司）过滤。取20.0μl过滤后的样品提取液与2.0mln,p-cds溶液（0.05mg/ml）充分混合，在待测样品与n,p-cds溶液混合后1min时检测荧光强度，在λex为370nm和λem为445nm条件下，记录加入样品提取液前后n,p-cds溶液的荧光强度。
如表1所示，果冻、糖果、饮料、鸡精、蜂蜜中柠檬黄的含量分别为0.1、0.36、0.1、0.21和0.16μm，其对应在样品中的原始浓度为0.05、0.19、0.05、0.11、0.09g/kg；加标回收率在96.08%–104.93%范围内，相对标准偏差（rsds）≤3.29%。结果表明，本方法用于复杂食品基质中柠檬黄的检测具有高准确度。
表1食品样品中柠檬黄的检测
1.基于氮磷掺杂碳量子点的制备方法，其特征在于：常温下将葡萄糖、乙二胺和浓磷酸混合进行反应，反应结束并冷却后用透析膜透析，冷冻干燥后，得基于氮磷掺杂碳量子点n,p-cds。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述葡萄糖、乙二胺和浓磷酸的投料比为0.2g∶3ml∶2ml。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述透析膜的截流分子量mwco为500～1000da。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述透析过程中每24h注入二次蒸馏水，透析时间为3天。
5.如权利要求1所述的制备方法取得的基于氮磷掺杂碳量子点n,p-cds在柠檬黄快速检测中的应用，其特征在于包括以下步骤：
1）用二次蒸馏水和基于氮磷掺杂碳量子点n,p-cds混合，得到n,p-cds溶液；
2）将柠檬黄与n,p-cds溶液混合，分别取得至少两种不同柠檬黄浓度的混合溶液，分别测得不同柠檬黄浓度的混合溶液的荧光强度，取得荧光猝灭效率f0/f与混合溶液中柠檬黄浓度的线性关系；
3）将待测样品与n,p-cds溶液混合，得到待测样品混合溶液，测得待测样品混合溶液的荧光强度；
4）根据荧光猝灭效率f0/f与混合溶液中柠檬黄浓度的线性关系得出待测样品混合溶液中柠檬黄的浓度。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述n,p-cds溶液中基于氮磷掺杂碳量子点n,p-cds的浓度为0.05mg/ml。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤2）和3）中荧光强度在λex为370nm，λem为445nm下测定。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述步骤2）中，在柠檬黄与n,p-cds溶液混合后1min时检测荧光强度。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述步骤3）中，在待测样品与n,p-cds溶液混合后1min时检测荧光强度。
技术总结