本发明属于生物医药领域，具体涉及对映-贝壳杉烷二萜weisiensinb和leukamenine在制备治疗皮肤疾患药物中的应用，特别涉及对映-贝壳杉烷二萜weisiensinb和leukamenine在制备治疗角蛋白k14相关皮肤疾患药物中的应用。
背景技术：
角蛋白是一类由角蛋白基因编码的聚合多肽组成的蛋白质，其不仅对上皮细胞和组织的完整性具有重要的机械稳定作用，还参与组织细胞分化和发育，细胞内信号转导，细胞凋亡以及伤口愈合，并具有防御保护等监管职能。目前，已有至少8种不同的皮肤疾患被证实与角蛋白的高表达相关。
角蛋白k14是一种分子量为53kd的蛋白，其功能异常会导致皮肤疾患，现已明确，k14高表达将导致银屑病、扁平苔藓、尖锐湿疣等（chinesejournalofmedicinalguide,2010volume12no.8）疾患。
角蛋白纤维(keratinintermediatefilaments)是上皮细胞中主要的中间纤维类型，共有54个保守的功能基因编码不同的角蛋白。包括28种i型角蛋白和26种ii型角蛋白。在人类物种中，除角蛋白18(keratin18，k18)外，所有的i型角蛋白由17号染色体编码，而所有的ii型角蛋白，包括编码k18的基因，都出现在12号染色体的长臂上。
在正常上皮细胞中，角蛋白纤维提供了关键的结构和机械支持，以保护上皮细胞和组织免受机械和非机械应力损伤。这种结构和机械支持作用的异常会导致细胞组织脆性，并导致许多角质细胞相关疾病。目前为止，对于中间纤维有缺陷导致的皮肤疾患还没有有效的治疗药物。
对映-贝壳杉烷(ent-kaurane)二萜是一类具有多种生物活性的天然产物，对该化合物的研究多集中在抗菌、抗炎、抗肿瘤等方面，尚无治疗皮肤疾患方面的报道。
技术实现要素：
基于以上所述，本发明的目的是提供对映-贝壳杉烷二萜化合物在制备治疗皮肤疾患药物中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
对映-贝壳杉烷二萜化合物在制备治疗皮肤疾患药物中的应用，所述对映-贝壳杉烷二萜化合物是指weisiensinb和leukamenine。
进一步地，通过mtt法、台盼蓝排染法以及ao/eb双染色法检测发现，weisiensinb和leukamenine可浓度-时间依赖性地抑制人永生化表皮细胞hacat的增殖。
进一步地，利用免疫荧光技术和蛋白质免疫印迹技术发现，weisiensinb和
leukamenine可显著减少或抑制已铺展hacat细胞内角蛋白k14纤维的组装并增加纤维可溶性，即weisiensinb和leukamenine通过抑制角蛋白k14纤维组装抑制表皮细胞的增殖及铺展。
进一步地，利用间接免疫荧光技术对角蛋白k14和k14的二硫键进行共定位以及蛋白质免疫印记技术检测k14的含量变化发现，weisiensinb和leukamenine可抑制已铺展细胞内角蛋白k14纤维二硫键的形成从而抑制角蛋白k14纤维组装，即weisiensinb和leukamenine通过抑制角蛋白k14纤维组装过程中二硫键的形成而抑制hacat细胞的增殖及铺展。
进一步地，通过合成生物素标记的weisiensinb探针分子以及亲和柱层析法分离提纯与weisiensinb作用的蛋白并进行检测发现，weisiensinb与角蛋白k14具有直接靶向作用。
更进一步地，所述皮肤疾患包括但不限于银屑病、扁平苔藓、尖锐湿疣。
识别生物活性分子的细胞靶点是药物开发中的一个重大挑战和关键所在。蛋白质为细胞生命活动功能的执行者，研究生物活性分子与靶蛋白的相互作用极其重要。
本发明提供了对映-贝壳杉烷二萜weisiensinb和leukamenine在制备治疗表皮细胞角蛋白k14相关皮肤疾患药物中的用途，weisiensinb和leukamenine可浓度-时间依赖性地抑制人永生化表皮细胞hacat中的角蛋白k14二硫键的形成，从而抑制hacat细胞角蛋白k14纤维的组装，且weisiensinb具有靶向结合角蛋白k14的特性；二者对hacat细胞角蛋白k14二硫键的破坏作用直接抑制细胞铺展导致细胞生长的抑制效应，可用于由表皮细胞角蛋白k14异常表达导致的相关皮肤疾患的病理机制研究，对于治疗角蛋白k14相关皮肤疾患的药物研发具有非常重要的价值。
附图说明
图1是实施例1中weisiensinb或leukamenine抑制hacat细胞增殖的结果；
图2、3是实施例2中weisiensinb与leukamenine抑制hacat细胞内角蛋白纤维组装的结果；
图4、5、6、7、8是实施例2中weisiensinb与leukamenine抑制hacat细胞铺展以及各个时间段铺展中hacat细胞内角蛋白纤维组装的结果；
图9是实施例3中bpw探针分子的合成路线；
图10是实施例3中weisiensinb与bpw活性的检测的比较分析结果；
图11是实施例3中bpw分别处理已铺展和铺展中hacat细胞4h、6h、8h、10h、12h后的细胞总蛋白的链霉亲和素-辣根过氧化物酶印迹显影以及k14单抗印迹显影；
图12是实施例3中利用bpw-亲和柱钓取目标蛋白并分别以链霉亲和素-辣根过氧化物酶和k14单抗进行印迹显影的结果；
图13、14是实施例4中weisiensinb抑制已铺展和铺展中hacat细胞内k14的二硫键形成的结果；
图15是实施例4中weisiensinb和leukamenine抑制已铺展hacat细胞内k14多聚物形成的结果。
具体实施方式
下面将通过实施例及附图的形式对本发明的上述内容进行详细的阐述，但本发明的保护范围并不仅限于以下实施例。
实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
对映-贝壳杉烷二萜化合物weisiensinb和leukamenine单体是由本实验室分别从甘肃产维西香茶菜和产毛叶香茶菜的干茎叶中采用常规方法提取分离得到。
本实验所用化合物weisiensinb和leukamenine均以dmso为溶剂，配制成10mm母液储存液于4℃冰箱保存。
实施例1：weisiensinb和leukamenine可浓度依赖性地抑制hacat细胞增殖
1.1)mtt法检测细胞增殖率
取对数生长期的hacat细胞，浓度为10×104个/ml接种于96孔板(100μl/孔)，每组设3个平行。在培养箱中预培养24h后，加入含不同浓度weisiensinb和leukamenine的培养基，继续培养24h后，每孔加入20μl的mtt(5mg/ml)，孵育4h后弃去培养基，加入150μl的dmso，震荡10min，490nm处测量od值，并做出各药物浓度下的柱状图。
1.2)实验结果
mtt检测发现(如图1)，随药物浓度增加，细胞增殖率下降。3.2μm的weisiensinb处理细胞24h后，其细胞增殖率为对照组的81%；3μm的leukamenine处理细胞24h后，其细胞增殖率为52%。spss软件分析显示，前者的ic50=5.1μm，后者的ic50=3.2μm。表明weisiensinb和leukamenine对hacat细胞均表现出浓度依赖性的增殖抑制作用，且hacat细胞对leukamenine更敏感。
实施例2：weisiensinb和leukamenine抑制hacat细胞角蛋白k14纤维组装
2.1)已铺展细胞药物处理
取对数生长期的hacat细胞，制成浓度为10×104个/ml的细胞悬浮爬片，接种于6孔板中，培养24h后，加入含不同浓度weisiensinb和leukamenine的培养基，继续培养24h，取出细胞爬片，pbs(ph7.4)洗3次/5min；用预冷的甲醇在-20℃固定5min后用pbs(ph8.0)洗3次/5min；室温下封闭1h(封闭缓冲液：5%山羊血清，0.3%tritonx-100的pbs液)后，加一抗置于4℃冰箱孵育过夜；pbs(ph8.0)洗3次后加二抗避光孵育2h，最后pbs(ph8.0)洗3次后封片，在荧光显微镜下用同样的拍摄参数进行观察、拍照。
取对数生长期的hacat细胞，制成浓度为10×104个/ml的细胞悬浮，接种于直径6mm培养皿中，培养24h后，加入含不同浓度weisiensinb和leukamenine的培养基，继续培养24h，预冷的pbs(ph7.4)洗3次，加入细胞裂解液，250μl/皿，经裂解后收集裂解液，离心(4℃，14000g，30min)后，取上清液检测可溶性低聚k14，取沉淀（加入裂解液，用超声仪使其溶解）检测非可溶性高聚k14。将上清液及沉淀溶解液进行蛋白定量后，分别加入上清缓冲液(2.3%sds，12.5mmtris-hcl，10%甘油，1%β-巯基乙醇，0.004%溴酚蓝)和沉淀缓冲液(0.05%溴酚蓝，10%甘油，1%sds)，煮沸10min待用。然后通过sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(polyacrylamidegelelectrophoresis，sds-page)分离上清液及沉淀的蛋白质，半干法转膜，经5%脱脂奶粉封闭2h，一抗(anti-cytokeratin14antibody，1:10000)4℃低速震荡孵育过夜，次日用二抗室温孵育2h后hrp化学发光液显影并拍照。
2.2)细胞铺展中药物处理
将含不同终浓度weisiensinb和leukamenine的hacat细胞悬液(10×104个/ml)爬片接种于6孔板，分别培养4h、10h、24h、32h后。荧光制片，处理方法与“2.1)”处理方法相同。
将含不同终浓度weisiensinb和leukamenine的hacat细胞悬液(10×104个/ml)接种于直径6mm培养皿中，分别培养16h、24h、48h后。可溶性和非可溶性k14的westernblotting检测方法与“2.1)”处理方法相同。
2.3)实验结果
2-4μm的weisiensinb或0.8-1.5μm的leukamenine分别作用于已铺展hacat细胞24h后，利用间接免疫荧光技术对hacat细胞k14染色，经激光共聚焦显微镜拍照(如图2)，结果显示：已铺展细胞对照组k14在核周分布均匀，且呈致密的网络结构，处理组细胞随药物浓度升高，k14网络密度降低，细丝状纤维显著减少，尤其在细胞质的边缘区，k14纤维减少程度最高，而核周区域的k14纤维分布则呈现出较粗状纤维的不均一聚集。
将hacat细胞接种于含不同浓度weisiensinb或leukamenine的完全培养基中，可见处理组细胞的角蛋白纤维网络组装大大延迟，表明角蛋白纤维重构被抑制，细胞平均铺展面积也相应减小(如图4、图5、图6、图7)。当细胞铺展24-32h后，较高浓度处理组角蛋白纤维重构几乎完全被抑制。
角蛋白纤维组装是一个动态循环过程，可溶性低聚物不断整合于需要正在组装形成的角蛋白纤维网络中，某些角蛋白纤维网络又不断解聚形成可溶性低聚物，并在细胞内被重新利用。用westernblotting法检测到经过weisiensinb或leukamenine处理的已铺展细胞或铺展中细胞其可溶性k14低聚物增加，同时非可溶性k14高聚物减少（图3，图8）。该结果支持了上述免疫荧光实验中所观察到的结果。
以上结果表明，weisiensinb或leukamenine抑制已铺展和铺展中hacat细胞角蛋白k14纤维网络的组装，进而减少细胞内k14纤维分布，抑制细胞铺展，且呈浓度-时间依赖性。
实施例3：weisiensinb可与k14相结合，两者具有直接靶向作用
4.1)生物素标记的weisiensinb探针分子的合成
为了研究受试化合物抑制hacat细胞k14组装的作用机制，本申请特设计合成了探针分子biotin-peg-cooh-weisiensinb（bpw），去“钓取”与weisiensinb相互作用的蛋白。由于需要在weisiensinb分子上连接生物素基团，为保证生物素与药物之间的连接效应，采用分子量为2000的聚乙二醇羧基为连接子合成探针分子(biotin-peg-cooh-weisiensinb，bpw)，其合成路线如图9所示。weisiensinb与探针的分子结构经核磁共振氢谱分析，认为探针分子bpw成功合成，并进一步利用mtt法检测探针分子bpw和weisiensinb分别对hacat、huvec、hela细胞生长的影响，比较两者的抑制效应，评估连接于探针分子bpw上的weisiensinb活性是否改变（图10）。
4.2)靶标蛋白的“钓取”与检测
基于链霉亲和素与生物素的高亲和性，被探针分子bpw中weisiensinb钓取的结合蛋白质可被固定于琼脂糖珠之上的链霉亲和素留滞，以达到分离纯化靶向蛋白的目的。为确定k14(53kd)与weisiensinb是否存在直接作用，本申请进一步以亲和柱层析法分离提纯与weisiensinb作用的蛋白并进行检测。
首先，取15μmbpw分别处理已铺展和铺展中细胞4h、6h、8h、10h、12h后，提取细胞总蛋白，用sds-page电泳分离后，链霉亲和素-辣根过氧化物酶印记并显影，或用k14抗体—辣根过氧化物酶印迹显影，对比其定位，以检测是否存在疑似靶标蛋白（图11）。
其次，同时装两个亲和素琼脂糖珠层析柱，亲和素琼脂糖珠自然沉降后，取hacat细胞裂解液多次通过其中一个亲和柱，以吸附除去裂解液中能与亲和素或琼脂糖珠结合的杂蛋白。收集除去吸附物的裂解液(此为样品1)。
将探针bpw反复多次通过另一个亲和柱，以最大限度将bpw探针固定在亲和素琼脂糖珠上，冲洗之后取一半样品1反复多次通过此亲和柱，以形成亲和素-生物素-weisiensinb-靶标蛋白复合物，冲洗后用上样缓冲液洗脱靶标蛋白并收集洗脱液(此为样品2)。
将样品1和样品2经sds-page分离后进行免疫印迹，以链霉亲和素—辣根过氧化物酶印迹显影，或用k14抗体—辣根过氧化物酶印迹显影，确定靶标蛋白（图12）。
4.3)实验结果
bpw抑制细胞增殖的活性与weisiensinb相近(如图10)，表明探针分子bpw保留了weisiensinb的生物活性，因此bpw可用来钓取weisiensinb的靶标蛋白。
靶标蛋白“钓取”结果显示(如图11)，化合物作用已铺展细胞8h时，可明显观察到与weisiensinb作用的蛋白分子，其中在53kd处，蛋白丰度较高，继续培养至12h时，与weisiensinb作用的蛋白含量逐渐降低。铺展中细胞随培养时间延长，与weisiensinb作用的蛋白质含量逐渐增加，这可能与角蛋白纤维的动态组装有关系，但是，无论铺展中还是已铺展细胞处理结果均显示，分子量为53kd处存在与weisiensinb作用的蛋白质。
样品1和样品2经sds-page分离纯化后进行免疫印迹，以链霉亲和素—辣根过氧化物酶或k14—辣根过氧化物酶印迹显影，结果如图12所示，样品1未显示蛋白条带，表明样品1经亲和素琼脂糖珠吸附后没有生物素结合蛋白；样品2显示多种不同分子量蛋白条带，也即多种生物素-weisiensinb-靶标蛋白复合物，进而说明weisiensinb与hacat细胞中多个蛋白分子存在相互作用，其中包括53kd蛋白。以k14单抗印迹显影结果显示，样品1显示蛋白条带，说明样品经亲和素琼脂糖珠吸附后保留了hacat细胞中的k14蛋白；经探针分子纯化的样品2显示了k14条带，说明与weisiensinb作用的蛋白分子中包含k14蛋白，即化合物与hacat细胞中k14蛋白在空间结构上有接触，两者具有直接靶向作用。
实施例4：两种化合物抑制hacat细胞k14二硫键的形成
5.1)差异染色法定位k14与二硫键
为了研究weisiensinb和leukamenine与k14的作用机制，利用nem阻断不参与合成二硫键的游离巯基，再利用三(2-羧乙基)膦（tcep）还原二硫键暴露巯基，选用巯基特异性红色荧光染料c5-马来酰亚胺进行染色；同时采用间接免疫荧光技术对k14进行标记，两种染色结果共定位的部分即为k14形成的二硫键。
hacat细胞经药物处理后，弃去培养基，pbs(ph7.0)洗3次，5min/次，经预冷的甲醇与-20℃固定5min后，pbs(ph7.0)洗3次，5min/次，加入5mmnem室温孵育2h后，tbs(ph7.4)洗3次，5min/次，经10mmtcep室温孵育1h，pbs(ph7.0)洗3次，5min/次，加入20μmalexaflour594c5-maleimide室温避光孵育2h，预冷的tbs(ph7.4)洗3次，5min/次，一抗(anti-cytokeratin14antibody，1：1000)4℃孵育过夜，次日用pbs(ph8.0)洗3次，5min/次，置于37℃恒温箱二抗(alexafluor488goatanti-rabbit，1：200)，pbs(ph8.0)洗3次，5min/次，封片后置于荧光显微镜下观察、拍照。
5.3)westernblotting测定k14形成的二硫键多聚物的含量
hacat细胞经药物处理后，预冷的pbs(ph7.4)洗3次，将hacat细胞置于尿素裂解缓冲液中裂解后离心(4℃，14000rpm，30min)，用bca蛋白试剂盒测定蛋白浓度。取一半蛋白样品加入含20mmtcep)的十二烷基硫酸锂(lithiumdodecylsulfate，lds)上样缓冲液，室温下孵育1h；另一半蛋白样品加入lds上样缓冲液，70℃水浴10min。经sds-page分离后进行免疫印迹。
5.4)实验结果
2μm、4μmweisiensinb分别处理已铺展和铺展中hacat细胞后，经上述方法检测结果显示(如图13、图14)：已铺展和铺展中细胞角蛋白纤维网络随着药物浓度增加逐渐变得稀疏；同时对照组细胞中具有二硫键的纤维在胞质及核周均匀分布，但随着化合物浓度增加，逐渐向核周聚集，将其共定位后发现，对照组细胞k14和二硫键共定位区域主要集中在核周，随化合物浓度增加共定位区域逐渐减少，并向核周一侧偏移。说明weisiensinb减少(破坏)hacat细胞k14二硫键的形成。
为进一步验证并量化hacat细胞内二硫键相关的k14二硫键多聚物的含量是否减少，本申请利用蛋白质印迹法检测已铺展细胞中形成而二硫键的k14含量。结果显示(如图15)，随着weisiensinb或leukamenine药物浓度增加，k14单体(m，53kd蛋白)含量与对照组比较无显著性变化，但包括二聚体k14(d)在内(110kd-300kd之间)的k14多聚物含量逐渐减少(图15-a，c)；进一步的灰度值统计结果显示，较高浓度处理组与对照组比，k14多聚物的含量变化具有显著性差异(图15-b，d)。如果加入巯基还原剂tcep，消除二硫键形成，k14多聚物则难以检出(图15-a)，这说明110kd-300kd之间的k14为二硫键结合的多聚物。以上结果说明，weisiensinb和leukamenine通过抑制hacat细胞中k14组装过程中二硫键的形成而抑制角蛋白纤维的组装。
综上所述，对映-贝壳杉烷二萜weisiensinb和leukamenine可通过抑制人永生化表皮细胞hacat中角蛋白k14组装的二硫键的形成从而抑制细胞增殖，这对角蛋白k14表达异常相关皮肤疾患药物开发具有很好的指导意义。
应当理解，具体实施方式部分而非发明内容和摘要部分，旨在用于解释权利要求。以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。
1.对映-贝壳杉烷二萜化合物在制备治疗皮肤疾患药物中的应用，其特征在于，所述对映-贝壳杉烷二萜化合物为weisiensinb和leukamenine。
2.如权利要求1所述的对映-贝壳杉烷二萜化合物在制备治疗皮肤疾患药物中的应用，其特征在于，所述weisiensinb和leukamenine可以抑制表皮细胞的增殖。
3.如权利要求2所述的对映-贝壳杉烷二萜化合物在制备治疗皮肤疾患药物中的应用，其特征在于，所述weisiensinb和leukamenine通过抑制角蛋白k14纤维组装抑制表皮细胞的增殖。
4.如权利要求3所述的对映-贝壳杉烷二萜化合物在制备治疗皮肤疾患药物中的应用，其特征在于，所述weisiensinb和leukamenine通过抑制角蛋白k14纤维组装过程中二硫键的形成而抑制hacat细胞的增殖。
5.如权利要求3所述的对映-贝壳杉烷二萜化合物在制备治疗皮肤疾患药物中的应用，其特征在于，所述weisiensinb可与角蛋白k14靶向结合。
6.如权利要求1-5任一项所述的对映-贝壳杉烷二萜化合物在制备治疗皮肤疾患药物中的应用，其特征在于，所述皮肤疾患至少包括银屑病、扁平苔藓、尖锐湿疣。
技术总结