一种利用血中IL-2、SOD、IL-6和GSH-Px检测奶牛铜、硒缺乏的方法与流程

一种利用血中il
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2、sod、il
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6和gsh
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px检测奶牛铜、硒缺乏的方法
技术领域：
1.本发明涉及泌乳奶牛微量元素检测技术领域，具体涉及一种利用血中il
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2、sod、il
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6和gsh
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px检测奶牛铜、硒缺乏的方法。


背景技术：
：
2.随着我国奶牛养殖业集约化和规模化发展，为了提高奶牛的生产性能，一些高发病率和死亡率的重大疫病由于其经济损耗巨大受到了管理者的高度重视，而一些慢性损耗性疾病对奶牛生产性能的影响往往被忽略，但其造成的奶牛自身免疫力和抵抗力下降、饲料转化率降低等问题对奶牛的日常管理和经济效益产生了严重的影响。奶牛微量元素铜、硒缺乏症是牛场常见的营养性疾病，通常是由于长期饲喂单一饲料，日粮中微量元素不足而导致的代谢性疾病。奶牛微量元素铜、硒缺乏临床上常以营养性肌萎缩、生产缓慢、发育不良、成年母牛繁殖障碍等为主要征状的一种群发性疾病。目前对于奶牛体内微量元素通常采用icp等离子体发射光谱仪(icp
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oes)进行检测，该方法据有良好的精密度，因此准确率较高，但该仪器设备价格十分昂贵，检测费用相对高昂，且需要专业人员操作，因此不适合牛场日常管理中的诊断与筛选，导致牛群微量元素缺乏症诊断难的现状。


技术实现要素：
：
3.本发明的目的是为了克服上述现有技术存在的不足之处，而提供一种利用血中il
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2、sod、il
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6和gsh
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px检测奶牛铜、硒缺乏的方法，所述血清中il
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2、sod、il
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6、gsh
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px对血清中微量元素铜、硒含量的改变比较敏感，通过检测血清中il
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2、sod、il
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6、gsh
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px的表达量来诊断奶牛微量元素铜、硒缺乏，表明血清中il
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2、sod、il
‑
6、gsh
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px均与奶牛微量元素铜、硒缺乏呈显著相关。
4.本发明的一种利用血中il
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2、sod、il
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6和gsh
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px检测奶牛铜、硒缺乏的方法，应用酶联免疫吸附试验测定奶牛血清中il
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2、sod、il
‑
6、gsh
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px的表达水平，利用统计学分析出il
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2、sod、il
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6、gsh
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px与奶牛微量元素铜、硒缺乏呈显著相关性，当血清中il
‑
2＜395.26pg/ml且sod＜358.27u/ml时，即检测出泌乳奶牛微量元素铜缺乏；当血清中il
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6＞562.34pg/ml且gsh
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px＜186.84u/ml时，即检测出泌乳奶牛微量元素硒缺乏。
5.作为本发明的进一步改进，所述的统计学分析的具体方法如下：
6.(1)样本分组：将奶牛根据血清铜水平由低到高进行分组，依次为实验组1、实验组2、实验组3、实验组4、实验组5；根据血清硒水平由低到高进行分组，依次为低硒组、对照组1、对照组2、对照组3；
7.(2)血清检测：使用肝素抗凝管在清晨奶牛空腹状态下颈静脉采集血液30ml，1200g离心10分钟分离血清；血清样本主要检测il
‑
2、il
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6、sod、gsh
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px，利用elisa试剂盒进行检测；用酶标仪在450nm波长下测定吸光度，通过绘制标准曲线来计算样品浓度；
8.(3)数据分析：所有数据均采用spss 19.0软件进行统计分析处理，用均值加减标
准差表示；采用单因素方差分析组间均值差异显著性；采用pearson直线相关性分析各指标与微量元素铜、硒缺乏的相关性，p＜0.05为显著相关；采用roc曲线分析显著性指标的预警值，曲线下面积大于0.5表示指标具有预警意义，在0.7
‑
0.9之间表示具有一般的预警作用，大于0.9可以作为标准进行判断。
9.本发明的一种利用血中il
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2、sod、il
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6和gsh
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px检测奶牛铜、硒缺乏的方法，通过对微量元素铜、硒缺乏奶牛与健康对照组奶牛血清il
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2、sod、il
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6、gsh
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px表达量进行pearson相关系数分析与roc曲线分析，确定当血清中il
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2＜395.26pg/ml和sod＜358.27u/ml时，可诊断泌乳奶牛微量元素铜缺乏；当血清中il
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6＞562.34pg/ml和gsh
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px＜186.84u/ml时，可诊断泌乳奶牛微量元素硒缺乏。此方法可简单快速高效的监测牛群内微量元素铜、硒缺乏症的发病情况，为疾病的防控提供有效便捷的手段，减少牛场损失。
附图说明：
10.图1是本发明不同水平的奶牛血清铜含量对机体中il
‑
2的影响；
11.图2是本发明不同水平的奶牛血清铜含量的il
‑
2含量变化趋势；
12.图3是本发明不同水平的奶牛血清铜含量对机体中sod的影响；
13.图4是本发明不同水平的奶牛血清铜含量的sod含量变化趋势；
14.图5是本发明不同水平的奶牛血清硒含量对机体中il
‑
6的影响；
15.图6是本发明不同水平的奶牛血清硒含量的il
‑
6含量变化趋势；
16.图7是本发明不同水平的奶牛血清硒含量对机体中gsh
‑
px的影响；
17.图8是本发明不同水平的奶牛血清硒含量的gsh
‑
px含量变化趋势。
具体实施方式：
18.一种利用血中il
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2、sod、il
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6和gsh
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px检测奶牛铜、硒缺乏的方法，下面结合试验对本发明进一步说明：
19.试验动物：在黑龙江省某规模化牧场分别随机选取年龄、胎次、体况相近的泌乳的中国荷斯坦奶牛50头，根据血清铜水平由低到高进行分组，依次为实验组1(0.87
‑
0.99mg/l)[12头，0.95
±
0.037mg/l]，实验组2(0.99
‑
1.06mg/l)[9头，(1.03
±
0.020mg/l)]，实验组3(1.07
‑
1.16mg/l)[15头，(1.11
±
0.033mg/l)]，实验组4(1.17
‑
1.29mg/l)[8头，(1.23
±
0.039mg/l)]，实验组5(1.30
‑
1.56mg/l)[6头，(1.39
±
0.088mg/l)]；根据血清硒水平由低到高进行分组，依次为低硒组(0
‑
0.05mg/l)[19头，(0.045
±
0.004mg/l)]，对照组1(0.05
‑
0.06mg/l)[20头，(0.055
±
0.0029mg/l)]，对照组2(0.06
‑
0.07)[7头，(0.064
±
0.0028mg/l)]，对照组3(0.07
‑
0.08mg/l)[4头，(0.077
±
0.0047mg/l)]。采集血液并分离血清。
[0020]
血液样本采集于检测：使用肝素抗凝管在清晨奶牛空腹状态下颈静脉采集血液30ml，1200g离心10分钟分离血清。血清样本主要检测白细胞介素2(il
‑
2)、白细胞介素6(il
‑
6)、超氧化物歧化酶(sod)、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh
‑
px)利用elisa试剂盒进行检测。以il
‑
2为例进行说明：试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(elisa)。往预先包被il
‑
2抗体的包被微孔中依次加入标本、标准品、hrp标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物tmb显色，tmb在过氧化物酶的催化下转化成蓝，在酸的作用下最终转化成黄色。颜色的深浅和样品中il
‑
2呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(od值)，通过绘制
标准曲线来计算样品浓度。
[0021]
数据分析：所有数据均采用spss 19.0软件进行统计分析处理，用均值加减标准差表示。采用单因素方差分析组间均值差异显著性；采用pearson直线相关性分析各指标与微量元素铜、硒缺乏的相关性，p＜0.05为显著相关；采用roc曲线分析显著性指标的预警值，曲线下面积大于0.5表示指标具有预警意义，在0.7
‑
0.9之间表示具有一般的预警作用，大于0.9可以作为金标准进行判断。
[0022]
表1 il
‑
2与奶牛血清铜的相关性
[0023][0024]
试验结果：结果如表1、图1和图2所示，血清铜含量低水平组(实验组1)奶牛的血清il
‑
2水平显著低于血清铜含量高水平组(实验组5)，通过pearson分析可知泌乳奶牛血清铜水平与il
‑
2呈显著正相关，泌乳奶牛血清中的il
‑
2会随铜水平的升高而有所升高。
[0025]
表2 sod与血清铜的相关性
[0026][0027]
如表2、图3和图4所示，血清铜含量低水平组(实验组1)奶牛的血清sod水平显著低于血清铜含量高水平组(实验组5)，通过pearson分析可知泌乳奶牛血清铜水平与sod呈显著正相关，泌乳奶牛血清中的sod会随铜水平的升高而有所升高。
[0028]
表3 il
‑
6与血清硒的相关性
[0029][0030]
如表3、图5和图6所示，低硒组奶牛的血清il
‑
6水平显著高于对照组3，通过pearson分析可知泌乳奶牛血清硒水平与il
‑
6呈显著负相关，泌乳奶牛血清中的il
‑
6会随硒水平的降低而有所升高。
[0031]
表4 gsh
‑
px与血清硒的相关性
[0032][0033]
如表4、图7和图8所示，低硒组奶牛的血清gsh
‑
px水平显著低于对照组2和对照组3，通过pearson分析可知泌乳奶牛血清硒水平与gsh
‑
px呈显著正相关，泌乳奶牛血清中的gsh
‑
px会随硒水平的升高而有所升高。
[0034]
表5血清il
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2、sod、il
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6、gsh
‑
px诊断参数
[0035][0036]
利用roc曲线分析血清中il
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2、sod、il
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6、gsh
‑
px对奶牛微量元素铜、硒缺乏的预警作用，结果如表5所示，血清中il
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2、sod曲线下面积分别为0.642和0.833，表明血清中il
‑
2、sod对奶牛微量元素铜缺乏具有较好的预警作用；血清中il
‑
6、gsh
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px的曲线系面积分别为0.630、0.774，表明血清中il
‑
6、gsh
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px对奶牛微量元素硒缺乏具有较好的预警作用。当血清il
‑
2＜395.26pg/ml时诊断奶牛微量元素铜缺乏的敏感度为76.40％，特异性为63.50％；当血清sod＜358.27u/ml时诊断奶牛微量元素铜缺乏的敏感度为85.20％，特异性为73.60％；当血清il
‑
6＞562.34pg/ml时诊断奶牛微量元素硒缺乏的敏感度为89.80％，特异性为64.20％；当血清gsh
‑
px＜186.84u/ml时诊断奶牛微量元素硒缺乏的敏感度为77.90％，特异性为83.70％。

技术特征：
1.一种利用血中il
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2、sod、il
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6和gsh
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px检测奶牛铜、硒缺乏的方法，其特征在于，应用酶联免疫吸附试验测定奶牛血清中il
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2、sod、il
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6、gsh
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px的表达水平，利用统计学分析出il
‑
2、sod、il
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6、gsh
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px与奶牛微量元素铜、硒缺乏呈显著相关性，当血清中il
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2＜395.26pg/ml且sod＜358.27u/ml时，即检测出泌乳奶牛微量元素铜缺乏；当血清中il
‑
6＞562.34pg/ml且gsh
‑
px＜186.84u/ml时，即检测出泌乳奶牛微量元素硒缺乏。2.根据权利要求1所述的一种利用血中il
‑
2、sod、il
‑
6和gsh
‑
px检测奶牛铜、硒缺乏的方法，其特征在于所述的统计学分析的具体方法如下：(1)样本分组：将奶牛根据血清铜水平由低到高进行分组，依次为实验组1、实验组2、实验组3、实验组4、实验组5；根据血清硒水平由低到高进行分组，依次为低硒组、对照组1、对照组2、对照组3；(2)血清检测：使用肝素抗凝管在清晨奶牛空腹状态下颈静脉采集血液30ml，1200g离心10分钟分离血清；血清样本主要检测il
‑
2、il
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6、sod、gsh
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px，利用elisa试剂盒进行检测；用酶标仪在450nm波长下测定吸光度，通过绘制标准曲线来计算样品浓度；(3)数据分析：所有数据均采用spss 19.0软件进行统计分析处理，用均值加减标准差表示；采用单因素方差分析组间均值差异显著性；采用pearson直线相关性分析各指标与微量元素铜、硒缺乏的相关性，p＜0.05为显著相关；采用roc曲线分析显著性指标的预警值，曲线下面积大于0.5表示指标具有预警意义，在0.7
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0.9之间表示具有一般的预警作用，大于0.9可以作为标准进行判断。
技术总结
本发明的一种利用血中IL


技术研发人员：王建发 武瑞 耿子健 连帅 贾大庆 王晓雅 王迪 纪铭 周琦珺
受保护的技术使用者：黑龙江八一农垦大学
技术研发日：2021.03.19
技术公布日：2021/6/29