本发明属于纳米材料生物效应研究领域，具体涉及一种镁氮掺杂碳点及其制备方法和在提高植物光合作用中的用途。
背景技术：
光合作用是植物生长过程中重要的生理过程，对粮食产量具有重要意义。通过调控光合作用提高农作物的产量已成为众多研究人员关注的热点课题。目前植物光合作用效率远低于其理论值，主要限制因素包括：(1)植物本身有限的光捕获的能力和(2)有限的光合系统活性。作为光捕获者，光合色素几乎参与植物光合作用的所有生理过程，包括：光捕获、能量传递、能量转化等。镁和氮是植物光合色素、光合蛋白以及光合酶等的重要组成成分。植物叶片中叶绿素、镁和氮的含量已经被广泛用于评价植物光合作用的主要参考指标。
纳米材料的快速发展为许多社会问题提供了更好的解决方案，包括农业和环境领域。碳点(cds)是一种荧光碳纳米材料，粒径<10nm，具有优异的光学性能、良好的水溶性、低毒性、环境友好性、生物相容性、原料来源广、制备成本低等诸多优点。cds既是电子供体，也是电子受体，可以作为一种良好的能量传递中间体。在植物光合作用中，研究人员发现cds的荧光发射光谱与叶绿体的光吸收谱重合时，cds的激发能可以被叶绿体捕获，进而加快类囊体膜上的光合电子传递速率，促进植物的光合作用和生长速率。此外，cds十分易于修饰，可通过特定物质进行功能化。
技术实现要素：
为了解决现有技术中存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种镁氮掺杂碳点(mg,n-cds)的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种上述制备方法制备而成的镁氮掺杂碳点及其制备方法。
本发明的再一目的在于提供一种上述镁氮掺杂碳点的应用。本发明通过将植物光合系统所需的镁和氮元素掺杂到cds中，使其在光合作用中发挥能量传递之外，还可以通过提高植物光合系统的活性，促进其光合效率和生长发育。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种镁氮掺杂碳点的制备方法，包括以下操作步骤：将柠檬酸、乙醇胺和氢氧化镁溶解于超纯水中，超声处理后所得混合液倒入反应釜中，于200℃反应6h；反应结束后降至室温，将产物利用孔径为0.22μm的滤头过滤，然后用透析袋透析12h；经过冷冻干燥后，得到镁氮掺杂碳点(mg,n-cds)。
优选的，所述柠檬酸、乙醇胺、氢氧化镁的摩尔比为1:0.2:0.35。
优选的，所述超声处理的时间为30min。
优选的，所述透析袋的截留分子量mw100～500；所述透析是采用超纯水为透析液。
一种由上述的制备方法制备得到的镁氮掺杂碳点。
上述的镁氮掺杂碳点在提高植物光合作用中的用途。
本发明mg,n-cds提高植物光合作用的机理：(1)加快叶绿素的代谢速率，提高活性；(2)提高叶绿体的光吸收能力(更高、更宽)；(3)光合电子传递速率；(4)co2同化。叶绿素分子在光合作用中参与多个重要生理过程，包括：光的捕获、能量传递和光能的转化。在叶绿素的生物合成中有两个关键的中间过程：(1)镁螯合酶(又称为镁-原卟啉ix螯合酶)催化镁离子与原卟啉ix的结合；(2)叶绿素合成酶催化叶绿素酸酯与牻牛儿基焦磷酸反应生成叶绿素a，进而转化为叶绿素b。叶绿素酶负责催化降解叶绿素。本发明研究中，叶绿素合成酶ch1g、镁螯合酶的两个亚基ch1i和ch1d以及叶绿素酶-2的基因的表达量均可以被mg,n-cds显著提高，从而可以加快水稻叶片中叶绿素分子的合成与代谢。因此，叶绿素在光合作用中可以发挥更高的活性，提高对光能的捕获能力，促进能量的转化。叶绿素a和b的含量之比随着mg,n-cds的处理浓度的升高而降低，说明水稻叶片对蓝光的吸收能力逐渐增强，使得mg,n-cds的蓝色荧光可以被叶绿体重吸收用于光合作用，进一步加快光合电子的传递速率，提高光合活性。光合作用中的卡尔文循可以利用光反应中生成的atp和nadph将co2转化为碳水化合物。rubisco是其中的一个关键酶，直接决定了co2的同化速率。mg,n-cds提高了水稻中rubisco的酶活性，进而可以加快co2的同化。在所有这些功能的同时作用下，植物的光合作用速率被加快，进而促进了其生长。但是，试验中发现水稻幼苗体内的碳水化合物的含量被mg,n-cds处理所抑制，并随处理浓度的升高而降低。因此，我们推断mg,n-cds或许还可以调控植物体内碳水化合物后续向其他物质的转化过程，这需要将来的进一步研究证明。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
本发明镁氮掺杂碳点中，mg和n分别以类似碳酸镁和石墨氮的结构存在于mg,n-cds中。mg的掺杂改变了mg,n-cds激发电子的跃迁途径，使其荧光发射红移。与叶绿体复合后，mg,n-cds的激发能会被叶绿体吸收用于光合作用，提高光合活性。通过叶面喷施应用于水稻植株后，mg,n-cds可以均匀分布于叶片细胞内。在300μg·ml-1的处理浓度下，mg,n-cds可以调控相关酶基因的表达，促进叶片中叶绿素的合成与代谢，使叶绿素分子的活性保持在较高水平，从而提高了叶片的光合活性。同时，mg,n-cds还可以上调rubisco酶活性，促进co2的同化。最终mg,n-cds处理的水稻植株的生长加快。
附图说明
图1是mg,n-cds水溶液日光和365nm光照射下的照片(a)；mg,n-cds的uv-vis光吸收谱、最佳荧光激发谱和发射谱(b)；mg,n-cds的荧光发射3d图(c)；mg,n-cds的荧光寿命衰减曲线(d)。
图2是mg,n-cds的tem图，插图为粒径分布图(a)、高分辨tem图(b和c)、xrd曲线(d)、afm图和对应的颗粒高度曲线(e和f)以及zeta电位结果(g)。
图3是mg,n-cds的ftir图谱(a)、xps总谱(b)、c1s(c)、o1s(d)、n1s(e)、mg1s(f)、mg2s(g)和mg2p(h)的高分辨图谱图。
图4是mg,n-cds的热重曲线(tg)(a)、热重积分曲线(dtg)(b)和差示扫描量热曲线(dsc)(c)；mg,n-cds热重分析溢出气体的质谱分析(d)；mg,n-cds在不同温度条件中的xrd图谱(e)图。
图5是对照组和50、100和300μg·ml-1的mg,n-cds处理组中水稻幼苗的照片(a)和对应的株高(b)、鲜重(c)、叶绿素含量(d)和碳水化合物的含量(e)。图a中白色条块的长度为5cm。b-e中的误差棒为标准偏差(n≥5)。标有不同字母表示处理间具有差异差异(p<0.05)。
图6是对照和50、100和300μg·ml-1的mg,n-cds处理的水稻叶片中(a和b)镁螯合酶亚基chli和chld，(c)叶绿素合成酶和(d)叶绿素酶基因的想对表达量。数据表示为平均值±标准差(n≥5)，标有不同字母表示处理间具有差异差异(p<0.05)。
图7是对照组(a)和mg,n-cds处理(b)水稻叶片的tem图；对照组和不同浓度mg,n-cds处理的水稻叶片的npq(c)，qp(d)，etr(e)，y(npq)(f)，y(no)(g)，andy(ii)(h)。误差棒表示数据的标准差(n≥5，p<0.05)。
图8是(a)300μg·ml-1的mg,n-cds处理水稻叶片在461μmol·m-2·s-1时的npq、qp、y(npq)、、y(no)、、y(ii)和etr。(b)mg,n-cds(50、100和300μg·ml-1)处理水稻的rubisco活性。数据表示为平均值±标准差(n≥5)，标有不同字母表示处理间具有差异差异(p<0.05)。
图9是对照组(a)和300μg·ml-1mg,n-cds复合叶绿体(b)的sem图；mg,n-cds复合叶绿体的荧光图：明场(c)、361-389nm激发(d)、515-565nm激发(e)、d和e的叠加图(f)；mg,n-cds和mg,n-cd复合叶绿体的荧光寿命(g)；叶绿体和mg,n-cd复合叶绿体在1000lux(h)和9000lux(j)氙灯照射下的希尔反应，以及3000lux氙灯照射下对贴氰化物的还原活性(i)。误差棒代表数据的标注差(n＝3，p<0.05)。
图10是mg,n-cds调控植物光合作用的机理图。
具体实施方法
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
制备镁氮掺杂碳点(mg,n-cds)：利用一步水热法，以柠檬酸、乙醇胺和氢氧化镁为原料制备了mg,n-cds，将摩尔比为1:0.2:0.35的柠檬酸、乙醇胺和氢氧化镁溶解于超纯水中，超声处理30min。由于柠檬酸的螯合作用，微溶于水的氢氧化镁可以完全溶解。然后将超声处理所得混合液倒入50ml聚四氟乙烯的反应釜内衬中，装入反应釜内，于200℃反应6h。待反应釜降至室温后，将褐色的产物利用孔径为0.22μm的滤头过滤，然后用透析袋(mw100～500)透析12h，透析液为超纯水。经过冷冻干燥后，即可得到镁氮掺杂碳点(mg,n-cds)。
为了研究mg在mg,n-cds中的存在形式和mg掺杂对其荧光发射的影响，利用等量的柠檬酸和乙醇胺，以上述相同的方法制备了单独n掺杂的cds(n-cds)。所得cds的相对qy以硫酸奎宁(溶于0.1m硫酸溶液中，qy＝54％)为参比测定(测定方法参考文献：rscadvances,2017,7,70,44144-44153)。
实施例2
对实施例1所得镁氮掺杂碳点(mg,n-cds)进行表征：
表征方法：mg,n-cds的形貌通过jem-2100f场发射投射电子显微镜(tem)和spa-400原子力显微镜(afm)进行观察。利用thermoscientificnicolet6700ftir光谱仪和thermoscientifick-alphax-射线光电子能谱(xps)进行表征。mg,n-cds的荧光发射光谱和荧光寿命衰减曲线分别利用f-7000hitachi和fls1000-stm荧光光谱仪测定。perkinelmeruv–vis分光光度计(lambda750)用于测定mg,n-cds的uv-vis光吸收曲线。同时，我们还利用tga-dsc热重(labsyssta)与质谱(lc-dzoompro)(tg-ms)联用系统测定了mg,n-cds从室温到800℃的热分解曲线和产物成分。最后，利用xpertprompdx-射线衍射仪(xrd)记录了mg,n-cds在不同温度下的xrd曲线，用于分析其分解残留物的成分。
mg,n-cds的光学性质表征：在uv光(365nm，16w)照射下，mg,n-cds的水溶液发出蓝色荧光(图1的a)。图1的b中的uv/vis线表示mg,n-cds的uv-vis光吸收谱，从中观察到两个吸收峰，分别位于320nm和370nm处，对应mg,n-cds表面官能团和共轭结构之间的n-π*电子跃迁。mg,n-cds的最大荧光激发光谱和发射光谱分别位于374nm和485nm(图1的b中flexcitation和flemission线)，二者均可以分峰拟合出两个小峰，分别位于343nm、378nm(激发峰)和483nm、519nm(发射峰)。从图1的c可以看出，随着激发光波长的红移，mg,n-cds的荧光发射峰位置从400nm红移至550nm。从荧光衰减曲线(图1的d)计算得到mg,n-cds的两个荧光寿命分别为2.41ns(96.50％)和20.49ns(3.50％)，其平均荧光寿命为3.04ns。
mg,n-cds的形貌表征：图2中的a为mg,n-cds的tem图，从图中可以看出mg,n-cds为均匀分布的近球形颗粒，平均粒径为2.53nm。高分辨tem图(图2中的b和c)展示了mg,n-cds的0.21nm和0.24nm的晶格间距，分别对应于石墨的(100)和(1120)晶面。图2中的d为mg,n-cds的xrd图谱，在2θ18.8°和34.5°处有两个宽的衍射峰，证明了mg,n-cds中无定形碳的存在。mg,n-cds的afm图说明其颗粒高度约为2nm(图2中的e和f)，再次说明mg,n-cds为近球形颗粒。通过表面电位分析，发现mg,n-cds表面带负电性(-5.8±0.66mv)(图2中的g)，有利于其在生物应用中进入生物体和生物细胞内。
mg,n-cds的化学成分表征：利用ftir和xps分析mg,n-cds的化学成分。图3的a为mg,n-cds的ftir图谱。在3390cm-1处的峰对应于羟基或n-h键的伸缩振动，1585cm-1处的峰说明mg,n-cds表面具有烷基伯酰胺，1417cm-1处的峰是由于羟基的面内弯曲振动或伯酰胺中c-n的伸缩振动引起的，1278cm-1和1076cm-1处的峰分别归于c-o和c-n伸缩振动特征峰。ftir的结果表明mg,n-cds表面具有丰富的亲水官能团，有助于其在生物领域的应用。
利用xps对mg,n-cds的元素组成和元素化学态进行表征。从图3的b中可以看出，mg,n-cds的xps总谱中有c1s(284.4ev)、n1s(400.6ev)、o1s(531.86ev)、mg1s(1304.25ev)、mg2s(89.52ev)、mg2p(50.79ev)和mg的螺旋峰(mgkll，306.2ev)。c1s的高分别图显示了三种c元素的存在形式：284.8ev处的c-c、286.3ev处的c-o-c、和288.7ev处的o-c＝o(图3的c)。o1s的高分辨图说明mg,n-cds中的氧元素以金属碳酸盐(531.8ev)和c＝o键(533.3ev)的形式存在(图3的d)，说明mg掺杂进入mg,n-cds后以类似碳酸镁的结构存在。该结果与ftir的结果一致。n1s的特征峰仅分峰拟合出了石墨氮一种形式(图3的e)。而mg1s和mg2p峰分别归于镁的氧化物和mg-co3结构(图3的f-h)。此外，伴随mg1s的mgkll峰说明部分mg被包裹在碳核中。根据xps数据，可以计算出，mg和n在mg,n-cds中的含量分别为6.39％和3,83％。
为了进一步研究mg,n-cds的结构和组成，利用热重与质谱联用和高温xrd测试其热分解过程与产物。图4的a-c显示，随着温度的升高，mg,n-cds共表现出三个分解过程，分别为：(1)25–220℃，吸热反应，质量损失27.92％；(2)220–500℃，放热反应，质量损失38.26％；(3)500–545℃，放热反应，质量损失24.75％。图4中的d显示，25–220℃和220–500℃mg,n-cds的质量损失是由于水分子的蒸发和酰胺基团分解逸出nh3、co2和no2造成的。而500–545℃的热分解过程主要是mg,n-cds的碳骨架结构和掺杂的石墨氮的分解过程，释放出nh3、h2o、co2、no2和少量的no气体。图4中的e是mg,n-cds在不同温度条件下的xrd曲线。当mg,n-cds在800℃完全分解后，其残留物为mgo晶体，其特征峰是在550℃时开始出现的，该温度对应mgco3的分解温度，再次说明mg在mg,n-cds中以类似碳酸镁的形式存在。根据热重分析中8.96％的残留物可以计算出mg,n-cds中mg的含量约为5.58％，与xps分析的结果近似。
根据以上表征结果，可以分析出mg,n-cds的生成过程以及mg掺杂对其荧光发射的影响。在反应过程中，乙醇胺和氢氧化镁首先各自与柠檬酸通过分子间脱水缩合结合在一起形成初级聚合物，随着反应的进行，反应温度持续升高，这些初级产物之间继续发生脱水缩合反应，生成了更大的聚合物。当碳化结束后便得到了mg,n-cds，并在其内部和表面形成了类似碳酸镁和石墨氮的结构。适当的石墨氮可以提高cds的qy。本研究中n-cds的qy高达57.37％，而mg,n-cds仅为19.58％。mg的掺杂似的mg,n-cds对光的吸收能力增强，荧光寿命降低，最大荧光发射峰红移。根据这些结果，mg的掺杂通过与含氧结构的结合，引入了较低的能级，并使原有的能级降低，进而改变了电子的跃迁。当被光激发后，大部分的激发电子被新形成的mg能级捕获，一少部分被相对较高的n能级捕获，进而发射出波长更长的蓝色荧光。由于mg能级较强的振动弛豫，造成了能量以热的形式散失，降低了qy值。
实施例3
实施例1所得镁氮掺杂碳点(mg,n-cds)对水稻植株生长的影响：
镁氮掺杂碳点对水稻植株的处理方法：首先利用75％乙醇溶液对水稻种子(华航31号)消毒，经去离子水彻底清洗后，均匀铺在发芽盘中，加入50％浓度的营养液，置于30℃避光培养。3天后，将发芽盘盖子揭开，种子以基本完全发芽，放置于温室(22-30℃，70％的相对湿度，400μmolm-2·s-1的光照强度，光周期为16h光照/8h黑暗)中继续培养至第7天。选生长状态均匀的水稻幼苗移植到黑色方形塑料盒中，每盒12株，盒中的营养液每周更换2次。不同浓度的mg,n-cds(50、100和300μg·ml-1)通过叶面喷施的方式处理水稻幼苗，于移植后第二天开始第一次处理，每盒喷施5ml，以后每两天喷施一次，共处理16天。各浓度处理设置3个平行重复，并以喷施等量去离子水的水稻幼苗作为对照处理。处理结束后，按照后续测定指标的需要收集水稻样品，并记录水稻幼苗的株高和鲜重以对比不同浓度处理之间的生长差异。水稻叶片中叶绿素的含量参照文献报道的方法测定(journalofhazardousmaterials,2020,394,122551)。利用tem，经过标准方法制样后观察mg,n-cds在水稻叶片中的分布情况(rscadvances,2017,7,62,38853-38860)。
镁氮掺杂碳点对水稻植株生长的影响：通过叶面喷施处理50、100和300μg·ml-1的mg,n-cds16天后，记录了水稻幼苗的生长参数。从图5的a可以看出，与对照相比mg,n-cds显著促进了水稻幼苗的生长。50、100和300μg·ml-1的mg,n-cds分别使水稻幼苗的株高比对照提高了19.87％、22.55％和22.34％(图5的b)，鲜重提高了33.90％、55.25％和70.60％(图5的c)。除此之外，mg,n-cds还提高了水稻叶片中叶绿素a(11.52％、12.06％和14.39％)和叶绿素b(15.57％、20.31％和26.54％)的含量(图5的d)。叶绿素a与b含量的比值随着处理浓度的升高从对照组中的4.39降至3.95(图5的d)。通过测定水稻植株中碳水化合物的含量发现，50、100和300μg·ml-1的mg,n-cds使之显著降低了6.50％、21.37％和34.12％(图5的e)。考虑到叶绿素在植物光合作用中发挥的重要作用，我们测定了水稻幼苗中叶绿素代谢相关酶的基因表达量。
实施例4
实施例1所得镁氮掺杂碳点(mg,n-cds)对水稻植株光合作用的影响：
叶绿素合成与代谢相关基因的表达量测试方法：通过nationalcenterforbiotechnologyinformation(ncbi)网站查找水稻叶绿素合成与代谢相关酶的基因序列，包括两个mg螯合酶亚基(chld：loc4334537和chli：loc4333259)、叶绿素合成酶(chlg：loc4338498)和叶绿素酶-2(loc4348648)，利用实时荧光定量pcr(qrt-pcr)技术测定基因的表达量。引物通过primerpremier5软件设计(表1)。处理后的水稻叶片取样后立即放入液氮中保存。样品中rna的提取和cdna的逆转录分别利用planttotalrnaisolationkit(biobase，成都，中国)andturescript1ststandcdnasynthesiskit(aidlab，北京，中国)试剂盒进行操作。qrt-pcr测试利用qtower2.2realtimepcr系统(analytikjena，德国)执行，反应体系为：5μl
表1qrt-pcr扩增中的引物表
水稻植株的叶绿素荧光测试方法：利用叶绿素荧光仪(phyto-pamed，walz，germany)测定处理水稻幼苗的光合作用参数。测试开始之前将所有的水稻幼苗放置在黑暗条件下过夜，使其光合反应达到平衡状态。测试时选取水稻幼苗顶部第二篇叶子，用浸湿的脱脂棉包裹切口后，置于测试台上测试。测定的光合有效辐射强度为0、36、81、146、231、396、461、611、801、1076和1251μmol·m-2·s-1。每个处理测试6片水稻叶片，每片叶子选定10个测试点。测试参数包括：非光化学应该淬灭(npq)(表示叶片的光保护能力)、光化学荧光淬灭(qp)(表示光合作用活性)、psii中调节性非光化学能量损失[y(npq)]、非调节性非光化学能量损失[y(no)]、光化学能量转化[y(ii)](表示叶片的实际光合效率)和电子传递速率(etr)。
rubisco酶活性测试方法：收集的水稻样品用液氮研磨成粉末。称取0.1g水稻样品加入1ml0.04m的tris-hcl(ph7.6)(包含10mm的mgcl2、0.25mm的edta和5mm的谷胱甘肽)，冰浴超声10min，于10000g、4℃离心10min后，收集上清液为酶提取液。将6μl酶提取液、7μl甘油醛-3-磷酸脱氢酶、7μl磷酸甘油酸激酶和180μl反应液(包含：1mmatp、4mmnadh、10mmrubp和100mm磷酸肌酸)充分混合，立即测定混合液在340nm处的吸光度，已记录混合液中nadh的氧化程度。1单位的rubisco酶活性定义为1g水稻样品在1min内氧化nadh的纳摩尔数。
mg,n-cds与叶绿体的复合及光合活性的测定方法：选用叶片较大、叶绿体含量丰富的生菜(lactucasatival.)叶片进行叶绿体的提取。取10g新鲜叶片置于研磨机中，加入20ml蔗糖缓冲液，将样品研磨成泥浆后，经4层纱布过滤，滤液经1000rpm离心10min后弃去沉淀，上清液再经3000rpm离心10min后，取沉淀重悬于蔗糖缓冲液中即得到叶绿体悬浮液。以上操作均在冰浴或4℃进行。通过提取液叶绿体中叶绿素，用于确定其浓度(advancedfunctionalmaterials,2018,28,44,1804004)。将10μg叶绿素每毫升的叶绿体悬浮液与mg,n-cds溶液(终浓度为10、50和100μg·ml-1)混合，黑暗条件下于4℃孵育1h。将混合液于3000rpm、4℃离心3min收集mg,n-cds与叶绿体的复合物(mg,n-cds@chl)。利用feiverios460扫描电子显微镜(sem)和倒置荧光显微镜(nikon,eclipseti2-u)观察mg,n-cds@chl的形貌和荧光发射分布。随后，测定了mg,n-cds@chl的uv-vis光吸收谱、荧光发射光谱和荧光寿命。
利用dcpip和铁氰化钾测定mg,n-cds@chl与单独叶绿体的希尔反应活性，对比二者的光合活性。将终浓度为60μm的dcpip溶液或400μm的铁氰化钾溶液与mg,n-cds@chl和单独叶绿体悬浮液混合。然后将混合液放置于氙灯下照射引发dcpip和铁氰化钾还原反应的开始。通过测定混合液在600nm(dcpip)或420nm(铁氰化钾)处的吸光度记录二者的还原程度，进而反应出mg,n-cds@chl和单独叶绿体光合活性。每处理设置三个平行重复。
镁氮掺杂碳点对水稻植株叶绿素合成与代谢相关基因的表达量的影响：测定的基因包括：两个mg螯合酶亚基(chld：loc4334537和chli：loc4333259)、叶绿素合成酶(chlg：loc4338498)和叶绿素酶-2(loc4348648)。分别负责叶绿素合成过程中mg的螯合、叶绿素分子的组装和叶绿素分子的降解。由图6可以看出，300μg·ml-1的mg,n-cds使chli、chld、chlg和叶绿素酶基因的想对表达量分别提高了93.55％、15.26％、115.02％和29.75％。但是50和100μg·ml-1的mg,n-cds对ch1i的表达量无显著影响，降低了ch1d(33.86％和34.42％)和叶绿素合成酶(33.33％和33.10％)的表达量。对于ch1g的表达量，50μg·ml-1的mg,n-cds使之降低了31.58％，100μg·ml-1的mg,n-cds却无显著影响。这些数据说明，合适的处理浓度条件下，mg,n-cds可以促进水稻叶片中叶绿素的合成与代谢，进而加快叶绿素的更新，使之保持较高的活性。
mg,n-cds对水稻幼苗光合作用的影响：利用tem观察了mg,n-cds在水稻叶片中的分布情况。与对照处理相比(图7的a)，mg,n-cds处理的水稻叶片中观察到了大量均匀分布的黑色颗粒物，包括细胞质和叶绿体中(图7的b)，说明mg,n-cds通过叶面喷施可以进入水稻叶片细胞内部。处理水稻叶片的光合作用参数利用叶绿素荧光仪进行测试。qp和npq分别表示叶片的光合活性和在强光下的为了自我保护而散失多余能量的能力。y(npq)、y((no)和y(ii)分别表示植物叶片中调节性非光化学转化的量子效率、非调节性非光化学转化的量子效率和进行光合作用的实际光化学能量转换的量子效率。etr代表叶片中psii系统的光合电子传递速率。结果显示，mg,n-cds对水稻叶片光合作用的影响具有浓度依赖性和光合辐射强度依赖性(图7的c-h)。当光合辐射强度低于81μmol·m-2·s-1时，mg,n-cds的所有处理浓度均会降低水稻叶片的npq、qp、etr、y(npq)和y(ii)，提高y(no)。说明在低光照强度下mg,n-cds不利于植物叶片的光合作用。随着光合辐射强度的提高，mg,n-cds对水稻叶片的光合作用显示出浓度依赖性。50μg·ml-1的mg,n-cds在光合辐射强度达到和高于146μmol·m-2·s-1时，显著提高了水稻叶片的npq，在光合辐射强度达到和高于611和461μmol·m-2·s-1时，才可以显著提高qp和etr。在光合能量转换中，50μg·ml-1的mg,n-cds在光合辐射强度处于231～611μmol·m-2·s-1时，显著提高了y(npq)，降低了y(no)，但是并没有对y(ii)造成显著影响。但是当光合辐射强度达到和超过146μmol·m-2·s-1时，100和300μg·ml-1的mg,n-cds即可以显著提高水稻叶片的qp、etr和y(ii)，降低y(npq)和y(no)。对于npq，100和300μg·ml-1的mg,n-cds分别可以在光合辐照强度231～611和461～611μmol·m-2·s-1时对其产生显著提高作用。综合所有的光合参数，300μg·ml-1的mg,n-cds在光合辐照强度461μmol·m-2·s-1时，对水稻叶片光合作用促进效果最佳，对qp、etr和y(ii)的提高率达到了109.54％、104.48％和127.16％(图8的a)。而100μg·ml-1的mg,n-cds在光合辐照强度611μmol·m-2·s-1时对水稻叶片的npq的促进效果最佳。基于以上结果，mg,n-cds可以提高水稻叶片的光合活性(qp)、光保护能力(npq)和电子传递速率(etr)，进而降低了光合作用中的非光合作用的能量转化[y(npq)和y(no)]，提高了光合作用的能量转化[y(ii)]。
光反应为co2的同化提供能量(atp和nadph)(raines,ca,2003)，将co2转化为碳水化物，直接决定了光合速率。rubisco是负责co2同化的卡尔文循环中的一个关键酶。图8的b可以看出mg,n-cds可以显著提高水稻幼苗的rubisco酶活性，并且具有浓度依赖性。300μg·ml-1的mg,n-cds使之提高了46.62％。因此，mg,n-cds处理可以提高水稻co2的同化速率。
mg,n-cds对叶绿体光合活性的影响：对比单独的叶绿体和mg,n-cds@chl的sem图(图9的a和b)，发现mg,n-cds对叶绿体的形貌和结构没有造成明显的影响。利用荧光显微镜观察，发现在361～389nm激发下，mg,n-cds@chl发出蓝色荧光，在515～565nm激发下发出红色荧光，并且二者的分布位置一致(图9c～f)。说明mg,n-cds进入叶绿体内部，分布在类囊体膜上，与叶绿素分子直接接触，为二者之间的能量传递提供了可能。图9的g显示，mg,n-cds在叶绿体中的荧光寿命从3.04ns下降为2.00ns，证明了mg,n-cds的激发能可能被叶绿体重吸收了。利用dcpip和铁氰化钾还原测定了mg,n-cds@chl的光合活性的变化。结果发现，在合适的复合浓度下，mg,n-cds@chl比单独的叶绿体对dcpip和铁氰化钾表现出更高的还原活性(图9的h和i)。并且在饱和光照(9000lux)条件下，mg,n-cds@chl依然可以表现出对dcpip更高的还原活性(图9的j)。dcpip和铁氰化钾均可以接受psii系统产生的光合电子而被还原，其还原程度与光合电子的传递速率有关，反映了psii系统的光合活性。基于以上数据，叶绿体可以捕获mg,n-cds的激发能，加快光合系统中电子的传递速率，进而提高光合活性性，并且mg,n-cds还可以打破叶绿体光合作用光饱和的限制。
实施例5
实施例1所得镁氮掺杂碳点(mg,n-cds)调控植物光合作用的方式
综合本文所有数据，我们可以得到mg,n-cds提高植物光合作用的机理：(1)加快叶绿素的代谢速率，提高活性；(2)提高叶绿体的光吸收能力(更高、更宽)；(3)光合电子传递速率；(4)co2同化(图10)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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<110>华南农业大学
<120>一种镁氮掺杂碳点及其制备方法和在提高植物光合作用中的用途
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1.一种镁氮掺杂碳点的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将柠檬酸、乙醇胺和氢氧化镁溶解于超纯水中，超声处理后所得混合液倒入反应釜中，于200℃反应6h；反应结束后降至室温，将产物利用孔径为0.22μm的滤头过滤，然后用透析袋透析12h；经过冷冻干燥后，得到镁氮掺杂碳点。
2.根据权利要求1所述的一种镁氮掺杂碳点的制备方法，其特征在于：所述柠檬酸、乙醇胺、氢氧化镁的摩尔比为1:0.2:0.35。
3.根据权利要求1所述的一种镁氮掺杂碳点的制备方法，其特征在于：所述超声处理的时间为30min。
4.根据权利要求1所述的一种镁氮掺杂碳点的制备方法，其特征在于：所述透析袋的截留分子量mw100～500；所述透析是采用超纯水为透析液。
5.一种由权利要求1～4任一项所述的制备方法制备得到的镁氮掺杂碳点。
6.根据权利要求5所述的镁氮掺杂碳点在提高植物光合作用中的用途。
技术总结