本发明属于医药领域，尤其涉及麦黄酮在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
肺癌是一种严重威胁人类健康的癌症，具有很高的发病率和死亡率，其中非小细胞肺癌(nsclc)是一种较常见的肺癌类型。现有研究表明，非小细胞肺癌的发生与癌症基因kras突变密切相关。科学家们长期以来一直致力于开发靶向kras突变的药物，但目前仍没有治愈kras突变的方法，已报道的新型小分子抑制剂均可能存在一些严重的副作用。
prkca是蛋白激酶c家族的10个成员之一，在包括nsclc在内的多种肿瘤类型中，prkca在调节细胞侵袭、增殖和凋亡中发挥了重要作用。prkca在nsclc患者中也会有高表达的现象，因此抑制prkca被认为是治疗nsclc的一种方法。
鞘氨醇-1-磷酸(s1p)在鞘脂代谢中受鞘氨醇激酶1和2(sphk1和sphk2)的调控，被认为是一种具有生物活性的脂质分子，参与细胞增殖、免疫调节等不同的细胞过程。s1p参与了许多疾病的进展，如败血症、类风湿性关节炎和癌症，sphk1、sphk2和s1p的减少可导致症状的减轻。
因此，希望提出一种抗肿瘤效果更好，尤其是对肺癌治疗效果明显的药物。
技术实现要素：
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出麦黄酮具有抑制prkca/sphk/s1p信号通路和抗凋亡信号通路的效果，能有效对多种肿瘤，尤其是kras肺癌突变型肿瘤细胞生长的起到明显的抑制作用。
本发明提供了麦黄酮在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤为肺癌、神经胶质瘤和胰腺癌。
麦黄酮是一种黄酮类天然成分，可提取自水稻、小麦或植物芦根，具有抗炎、预防糖尿病、抗血管生成和抗病毒的作用。所述麦黄酮的分子式为c17h14o7，分子量为330.29，结构式如下所示：
本发明通过试验发现，麦黄酮对多种不同组织的肿瘤细胞有明显的选择性细胞毒性，其中对于肺癌细胞的增殖、抗凋亡、迁移和克隆形成有着明显的抑制作用。
优选的，所述肺癌为非小细胞肺癌。本发明中的试验表明，麦黄酮对h358细胞、h2122细胞和llc细胞等三种肺癌细胞株的生长均具有很好的抑制作用，麦黄酮对上述三种肺癌细胞株的毒性排名为：h358>h2122>llc，其中h358细胞和h2122细胞均为人非小细胞肺癌细胞，表明麦黄酮对非小细胞型肺癌细胞的抑制和杀灭作用更强。
本发明还提供了一种抗肿瘤药物，用于治疗肺癌、神经胶质瘤和胰腺癌，所述抗肿瘤药物包含有麦黄酮。
优选的，所述抗肿瘤药物还包含有在药学上可接受的辅料。
更优选的，所述在药学上可接受的辅料包括溶剂、填充剂、润滑剂、崩解剂、缓冲剂、助溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、粘合剂或助悬剂中的至少一种。
优选的，所述抗肿瘤药物的剂型包括注射剂、粉针剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、散剂、滴丸剂、口服液或栓剂。
本发明还提供了一种kras突变抑制剂，所述kras突变抑制剂包含麦黄酮。
本发明还提供了一种prkca抑制剂，所述prkca抑制剂包含麦黄酮。
本发明还提供了一种s1p调节剂，所述s1p调节剂包括麦黄酮。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明指出天然产物麦黄酮对肿瘤细胞的的增殖、抗凋亡、迁移和克隆形成有明显的抑制作用，尤其对krasg12c肺癌突变型肿瘤细胞有明显的细胞毒性，且对正常人肺成纤维细胞无明显细胞毒性。并且，本发明指出麦黄酮能够对prkca/sphk/s1p信号通路和抗凋亡信号通路产生抑制作用，因此还可作为kras突变抑制剂、prkca抑制剂或s1p调节剂，调节细胞生长和凋亡进程。
附图说明
图1表示麦黄酮对lewis肺癌细胞异种移植瘤的生长抑制结果；
图2表示麦黄酮对不同细胞的mtt试验结果；
图3表示麦黄酮对llc细胞的克隆形成实验结果；
图4表示麦黄酮对llc细胞的凋亡试验结果；
图5表示麦黄酮对llc细胞的prkca、sphk1和sphk2基因表达结果；
图6表示prkca对麦黄酮诱导细胞凋亡的影响。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
试剂与细胞培养
麦黄酮(pubchemcid：5281702，cas#：520-32-1)和顺铂(cas#：15663-27-1)都购买自medchemexpress。体内实验：麦黄酮溶解于由10％dmso，10％peg400,10％tween-80和70％pbs组成的溶液中；顺铂溶解于去离子水中。体外实验：麦黄酮溶解于dmso中。
以llc(鼠源性lewis肺癌细胞)、h2122(人krasg12c突变肺癌细胞)、h358(人krasg12c突变肺癌细胞)、hepg2(人肝癌细胞)、hct-8(人结肠癌细胞)、u-87mg(人神经胶质瘤细胞)、miapaca-2(人胰腺癌细胞)和ccd-19lu(正常人肺成纤维细胞)为试验材料，以上细胞均购买于美国模式培养物集存库(atcc)。将上述细胞置于37℃、5％co2培养箱中培养，其中u-87mg、miapaca-2和llc细胞在dmem培养基中培养。ccd-19lu细胞在mem培养基中培养。hepg2、hct-8、h2122和h358细胞在rpmi1640培养基中培养。
以下实施例中数据用平均值±标准差表示，利用graphprism7.0软件进行处理，采用单因素方差分析(anova)或t检验比较各组间的数据差异，*p<0.05表示有显著差异，**p<0.01和***p<0.001表示有极显著差异。
实施例1：荷瘤小鼠模型的建立与干预
制备肺癌皮下移植瘤模型：肺癌细胞株llc培养，传代。在细胞对数期收集细胞，配成浓度为5×105个/100μl的细胞悬液，皮下注射进入c57bl/6j小鼠的右前肢，约7天后待肿瘤长至体积>50mm3，即为接瘤成功。
接种肿瘤成功后，小鼠随机均分为4组，每组6-7只，各具体组别为：1)对照组(pbs组)；2)阳性对照顺铂组(2毫克/千克)；3)麦黄酮高剂量组(50毫克/千克)；4)麦黄酮低剂量组(25毫克/千克)。pbs对照组和麦黄酮高剂量、低剂量用药组都是分别每天一次腹腔注射，每次0.2毫升，每3天测量一次肿瘤体积，称量体重。顺铂组每三天腹腔注射一次，每次0.2毫升。其中肿瘤体积＝((长×宽×宽)/2)。当体重减轻>20％或者肿瘤任一直径>20毫米时，则将小鼠处死并称量瘤体重量。给药15天后，处死所有小鼠并称量瘤体重量。肿瘤抑制率计算公式：抑制率(％)＝(对照组瘤体重量-实验组瘤体重量)/对照组瘤体重量×100％。
测试结果如图1所示，麦黄酮能明显抑制lewis肺癌细胞异种移植瘤的生长。与对照组相比，麦黄酮组可延缓llc肿瘤生长(图1中a所示)；在治疗期间，麦黄酮组中小鼠体重无明显减轻，阳性对照顺铂组可抑制肿瘤生长，但小鼠体重有明显减轻(图1中b所示)；图1中c为各组肿瘤的代表性照片，肿瘤体积大小与图1中a所显示的结果吻合；如图4所示，15天实验结束后，称量各组肿瘤重量，得出顺铂组、麦黄酮低剂量组、麦黄酮高剂量组的抑瘤率分别为54.49％(p<0.001)，43.55％(p<0.01)和65.03％(p<0.001)。
实施例2：mtt试验
将hepg2、hct-8、u-87mg、miapaca-2、llc、h2122、h358和ccd-19lu细胞接种于96孔微孔板(3000-5000个/孔)中。等细胞粘附后，加入100微升不同浓度(150、75、37.5、18.75和9.375微摩尔/升)的麦黄酮作为试验组，并以dmso作为对照组；孵育72小时，再加入10微升浓度为0.5毫克/毫升的mtt溶液，在37℃培养箱孵育4小时。4小时后，吸去上层清液，加入100微升二甲亚砜(sds)，用吸光度仪在570nm和650nm波长测量吸光度。ic50采用graphpadprism7.0软件计算，以上实验均独立进行三次。
测试结果如图2所示，其中a-h分别表示llc(鼠源性lewis肺癌细胞)、h2122(人krasg12c突变肺癌细胞)、h358(人krasg12c突变肺癌细胞)、hepg2(人肝癌细胞)、hct-8(人结肠癌细胞)、u-87mg(人神经胶质瘤细胞)、miapaca-2(人胰腺癌细胞)和ccd-19lu(正常人肺成纤维细胞)细胞的mtt试验结果，得出麦黄酮对不同细胞的ic50值为：llc：77.98±1.21微摩尔/升；h2122：38.46±1.12微摩尔/升；h358：30.78±1.21微摩尔/升；hepg2：88.69±1.17微摩尔/升；hct-8：149.90±1.10微摩尔/升；u-87mg：58.91±1.08微摩尔/升；miapaca-2：82.20±1.10微摩尔/升；ccd-19lu：＞300微摩尔/升。结果表明麦黄酮对多种肿瘤细胞具有生长抑制作用，其中对于人krasg12c突变肺癌细胞(h2122和h358)的抑制效果最好。
实施例3：克隆形成实验
将llc细胞接种于6孔板中，每孔500个细胞。细胞粘附后，分别孵育于含不同浓度(0、12.5、25、50、100微摩尔/升)的麦黄酮培养基约10天，培养基每三天更换一次。当菌落形成明显时，用4％多聚甲醛(pfa)在4℃下固定llc细胞30分钟。然后用结晶紫溶液染色至少30分钟。洗去结晶紫溶液后，对菌落进行拍照。
结果如图3所示，图3中a表明麦黄酮对llc细胞的克隆形成显示出剂量依赖性；图3中b表明麦黄酮对llc细胞的迁移显示出剂量依赖性；图3中c表示llc细胞的迁移距离统计结果，所有的实验都独立进行了三次，数据以均数±标准差表示(*p<0.05，**p<0.01)，与麦黄酮0微摩尔/升的迁移距离作比较。以上结果表明麦黄酮以剂量依赖性的方式抑制llc细胞的克隆形成能力，并以剂量依赖性的方式对llc细胞迁移有明显的抑制作用。
实施例4：凋亡实验
llc细胞(2×105细胞/孔)被接种在6孔板24小时后，用指定浓度(0、50、100和150微摩尔/升)的麦黄酮孵育llc细胞24小时。接着用100微升1×binding缓冲液重悬后，llc细胞用2微升annexin-vfitc和4微升pi试剂避光染色15分钟。使用bdariaiii流式细胞仪计算凋亡细胞数，使用flowjov10软件分析数据。
结果如图4所示，图4中a表示流式细胞仪计算不同浓度的麦黄酮作用于llc细胞的凋亡百分比；图4中b表示细胞凋亡的统计结果。所有的实验都独立进行了三次，数据以均数±标准差表示(**p<0.01，***p<0.001)，与麦黄酮0微摩尔/升的凋亡百分比作比较；图4中c表示经麦黄酮处理24小时后，蛋白印迹法检测p-akt、t-akt、bcl-xl、full-lengthparp和cleavedparp的蛋白表达水平；流式细胞仪检测结果显示，麦黄酮使llc细胞凋亡率显著增加。蛋白印迹结果显示，在llc细胞中，麦黄酮可使cleavedparp的表达水平升高，使full-lengthparp、bcl-xl和akt磷酸化的表达水平降低，且呈剂量依赖性，但麦黄酮对总akt的影响很小。
实施例5：蛋白印迹实验和定量实时pcr实验
蛋白印迹实验
分别用0、50、100、150微摩尔/升的麦黄酮处理llc细胞(每孔2×105个细胞)。24小时后，加入1×ripa缓冲液。15分钟后，从培养皿表面刮下细胞，裂解后的悬浮液离心(12000rpm，4℃，10分钟)，收集上清液。采用piercebca蛋白检测试剂盒测定总蛋白浓度。蛋白质在100℃下煮10分钟。将2微升分子量标记物和平均量(约40微克)的蛋白质加入10％sds-丙烯酰胺凝胶中。电泳完成后，将蛋白在300ma下转移到硝基纤维素膜(nc)上2小时。膜在5％的脱脂牛奶里孵育1小时。然后将膜与相关一抗(1:1000稀释)在4℃摇床中孵育过夜。第二天，膜在以1:10000稀释的荧光素结合兔抗体中避光孵育2小时。最后，使用li-corodessy成像扫描仪检测每个条带的灰度值。
定量实时pcr实验
分别用不同浓度(0、50、100、150微摩尔/升)的麦黄酮处理llc细胞24小时。然后通过trizol试剂提取细胞总rna。将rna反转录为cdna后，采用viiatm7高效实时定量pcr技术。采用2-△△ct法计算基因表达量。引物购自genepharma，引物序列如下所示：
prkca-f：5’-tggtctctcagtctctcgca-3’(seqidno.1)；
prkca-r：5’-acaaagtgggctggataggc-3’(seqidno.2)；
sphk1-f：5’-cttgatagtgttccctggggg-3’(seqidno.3)；
sphk1-r：5’-ggggacgaagtcgagatgag-3’(seqidno.4)；
sphk2-f：5’-atgatcggagcttgctggac-3’(seqidno.5)；
sphk2-r：5’-gccaggccaagtgttgaaag-3’(seqidno.6)；
gapdh-f：5’-tgacctcaactacatggtctaca-3’(seqidno.7)；
gapdh-r：5’-cttcccattctcggccttg-3’(seqidno.8)。
为了验证麦黄酮抑制llc细胞增殖的作用机制，本发明进行了一系列的分子研究。研究结果如图5所示，图5中a-c分别表示采用定量pcr法检测麦黄酮处理24小时llc后prkca、sphk1和sphk2的rna表达情况(**p<0.01，***p<0.001)，与麦黄酮0微摩尔/升的rna表达作比较；图5中d表示经麦黄酮处理24h后，蛋白印迹法检测p-prkca、t-prkca、sphk1和sphk2蛋白表达量的结果。
定量pcr结果显示，不同浓度的麦黄酮处理后prkca、sphk1和sphk2基因的表达均显著降低。同时，蛋白印迹检测结果表明，蛋白水平结果与基因水平结果一致。麦黄酮显著降低了磷酸化prkca、sphk1和sphk2的蛋白水平，但麦黄酮对总prkca的影响较小。
实施例6：稳定转染试验
llc细胞接种到6孔板(大约1.8×105-2.0×105个/孔)。24小时后，1微克质粒(sh-control或sh-prkca)和2微克脂质体2000与800微升opti-mem培养基混合孵育细胞。4-6小时后，换为dmem培养基。llc细胞培养48小时后，用96孔板和1微克/毫升嘌呤霉素筛选并构建稳定的sh-prkca敲除llc细胞系，采用蛋白印迹法验证该基因是否已被成功敲除。待敲除成功后，然后用100微摩尔/升麦黄酮处理转染的llc细胞24小时，用流式细胞仪检测细胞凋亡。
结果如图6所示，图6中a为prkca基因的敲除结果；图6中b为转染后的llc细胞经麦黄酮处理后的流式细胞仪检测结果；图6中c为细胞凋亡的统计结果。所有的实验都独立进行了三次，数据以均数±标准差表示(**p<0.01，***p<0.001)。以上结果显示，敲除prkca的llc细胞经麦黄酮处理后，凋亡细胞明显减少，证明prkca是麦黄酮诱导细胞凋亡的重要介质。
实施例7：胶囊剂
取麦黄酮400g，加入乳糖1000g、淀粉1200g混合均匀，使用淀粉浆作为粘合剂，湿法制粒，烘干，加入硬脂酸镁20g混匀，填充至胶囊中，制得胶囊剂。
sequencelisting
<110>澳门科技大学
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1.麦黄酮在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌、神经胶质瘤和胰腺癌。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肺癌为非小细胞肺癌。
3.一种抗肿瘤药物，其特征在于，用于治疗肺癌、神经胶质瘤和胰腺癌，所述抗肿瘤药物包含有麦黄酮。
4.根据权利要求3所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物还包含有在药学上可接受的辅料。
5.根据权利要求4所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述在药学上可接受的辅料包括溶剂、填充剂、润滑剂、崩解剂、缓冲剂、助溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、粘合剂或助悬剂中的至少一种。
6.根据权利要求4所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物的剂型包括注射剂、粉针剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、散剂、滴丸剂、口服液或栓剂。
7.一种kras突变抑制剂，其特征在于，所述kras突变抑制剂包含麦黄酮。
8.一种prkca抑制剂，其特征在于，所述prkca抑制剂包含麦黄酮。
9.一种s1p调节剂，其特征在于，所述s1p调节剂包括麦黄酮。
技术总结