本发明属于传感器技术领域，具体涉及一种比率型荧光探针的制备方法及其应用。
技术背景
四环素类抗生素，如四环素(tc)和土霉素(otc)，作为一类用途广泛的广谱抗生素，已被广泛应用于治疗动物疾病感染或促进家畜生长的饲料添加剂。然而，在畜牧业和水产养殖中对四环素类抗生素的过度使用和滥用导致了四环素类抗生素残留物累积在牛奶、肉、蛋和其他动物食物来源的食品中。过量的四环素类抗生素残留物可以通过食物链传递给人类，从而威胁人类的健康，导致肝损伤、过敏反应和细菌耐药性等。因此，快速、准确地检测四环素类抗生素的残留量，以保障食品安全和产品消费者的健康是十分有必要的。
目前四环素类抗生素的检测主要依靠传统的技术包括毛细管电泳法、高效液相色谱法和气相色谱-质谱法等，这些技术往往因前处理方法繁琐、耗时长、费用高，同时需要专业的技能等原因造成了一定的局限性，不利于实现快速检测。近年来，荧光传感技术由于其操作简单，耗时短而备受关注。
目前报道的用于四环素类抗生素检测的荧光探针大多数是基于单荧光发射的荧光探针。单荧光发射的探针的荧光强度往往会受到环境和仪器等的干扰，从而降低了检测结果的可靠性。因此，迫切需要设计和开发一种用于四环素类抗生素检测的比率型荧光探针，提高检测结果的可靠性。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明旨在解决所述问题之一；本发明开发一种比率型的荧光探针，能够实现四环素类抗生素的简单、快速、准确及可视化检测，克服现有四环素类抗生素检测技术操作复杂、耗时长，制备复杂，检测结果不直观等缺点。
为了实现以上目的，本发明具体包括以下步骤：
步骤1、将荧光素(fss)、乙酸锌和对苯二甲酸溶于n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，超声、加热，待反应物冷却后，经洗涤、干燥，得到绿色发光的金属有机框架材料，记为fss@mof-5荧光材料；
步骤2、将步骤1制备的fss@mof-5荧光材料溶于水中，在搅拌的条件下分别加入鸟苷一磷酸和硝酸铕，经洗涤、离心、干燥，得到绿色发光的比率型荧光材料，记为fss@mof-5@gmp/eu荧光探针。
优选的，步骤1中所述荧光素、乙酸锌、对苯二甲酸和n,n-二甲基甲酰胺的用量比为0.05～0.25g：1.12～2.19g：0.25～0.4g：40～60ml。
优选的，步骤1中所述的超声功率为60～100w，时间为5～10min。
优选的，步骤1中所述的加热温度为90～120℃，时间为6～14h。
优选的，步骤1中所述洗涤是用n,n-二甲基甲酰胺和乙醇溶液分别洗涤1～3次；所述干燥的温度为60～80℃，时间为24～48h。
优选的，步骤2中所述的fss@mof-5荧光材料、鸟苷一磷酸、硝酸铕和水的用量比为0.01～0.05g：0.04～0.08g：0.05～0.09g：40～60ml。
优选的，步骤2中所述的搅拌时间为1～3h。
优选的，步骤2中所述洗涤是用水溶液洗涤1～3次；所述的离心转速为3000～5000rpm，离心时间为5～10min。
优选的，步骤2中所述的干燥温度为60～80℃，时间为24～48h。
将上述制备方法制备的比率型荧光探针应用于四环素类抗生素的检测，包括以下步骤：
s1、建立检测四环素类抗生素的线性回归方程：以四环素的检测为例，将制备的fss@mof-5@gmp/eu荧光探针加入水中，得到fss@mof-5@gmp/eu荧光探针溶液；然后配制不同浓度的四环素溶液，将不同浓度的四环素溶液加入到制备的fss@mof-5@gmp/eu荧光探针溶液中，得到混合溶液；一种浓度的四环素溶液对应加入一种fss@mof-5@gmp/eu荧光探针溶液，反应后测量上述混合溶液的荧光强度比值i617/i518，根据检测的所述荧光强度比值与所对应的四环素类抗生素浓度c之间的关系，建立检测四环素类抗生素的线性回归方程；
s2、建立半定量可视化检测四环素类抗生素的方法：将s1中添加了不同浓度四环素的fss@mof-5@gmp/eu荧光材料溶液依次放置于紫外灯下，记录上述不同四环素浓度溶液对应的荧光颜色；将得到的荧光颜色与不同浓度的四环素溶液相互对应，按照四环素浓度由小到大的顺序记录荧光颜色变化，实现四环素的半定量可视化识别；
s3、食品样品中四环素类抗生素的检测分析：根据国标《gb/t21317-2007动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法-液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法》对待测样品进行预处理，得到待测样品提取液；然后将待测样品提取液，加入到制备的fss@mof-5@gmp/eu荧光材料溶液中，得到混合液放置于紫外灯下，记录混合液的荧光颜色；将得到的荧光颜色与s2中的荧光变化对比，可以判断待测样品中四环素的浓度范围，实现可视化识别；进一步测量混合液的荧光强度比值i617/i518，将荧光强度比值带入到步骤s1中建立四环素类抗生素的线性回归方程，计算出待测样品中四环素的浓度。
优选的，步骤s1中所述fss@mof-5@gmp/eu荧光探针溶液的浓度为0.1-0.5mgml-1；所述不同浓度的四环素溶液指浓度范围为0～20μm；所述四环素溶液与fss@mof-5@gmp/eu荧光探针溶液混合时的体积比为1：(1-2)。
优选的，步骤s1中所述荧光分光光度计的狭缝宽度为0.5nm，检测的荧光溶液的激发波长为365nm，波长范围为500～660nm，检测617nm和518nm处的荧光强度值。
优选的，步骤s1中所述静置的时间为1～5min。
优选的，步骤s2中所述的紫外灯激发波长为365nm。
有益技术效果
(1)本发明制备的比率型荧光探针具有两个不同的荧光发射强度，能降低环境和仪器带来的干扰，使结果稳定可靠。
(2)本发明制备的比率型荧光探针的原料来源广泛、合成方法简单、成本低廉。
(3)本发明制备的比率型荧光探针能够实现四环素类抗生素的特异性检测，不需要特异性的生物材料，如抗原抗体或者适配体等，可以减少制备特异性荧光传感器的时间和成本。
(4)与单发射荧光探针相比，比率型荧光探针不仅可以提供内置的校正信号，同时在紫外灯下还可以产生的多种颜色变化，更易于实现待测物的可视化检测；随着四环素浓度的增加，本发明制备的比率型荧光探针的荧光颜色从绿色变成黄色，最后变成红色，可以实现四环素的半定量可视化检测。此外，本发明制备的比率型荧光探针还能够实现四环素类抗生素的快速、准确检测，操作简单且探针不易受环境的影响，有利于保障食品的质量与安全。
附图说明
图1中(a)为实施例1中fss@mof-5荧光材料的sem图；(b)为实施例1中fss@mof-5@gmp/eu荧光探针的sem图。
图2中(a)为实施例1中比率型荧光探针添加不同浓度四环素的的荧光光谱图；(b)为以比率型荧光探针的荧光强度比值i617/i518与四环素浓度c绘制的线性回归曲线(激发波长365nm)。
图3为实施例1中比率型荧光探针添加不同浓度四环素的的荧光图。
图4为实施例1中牛肉的荧光图片。
具体实施例
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1：
为了进一步阐述本发明，以制作四环素类抗生素的比率型荧光探针并用于牛肉中四环素类抗生素检测为实施例，具体步骤如下：
步骤1、制备fss@mof-5荧光材料：取0.2g的荧光素、0.5g对苯二甲酸和1.2g乙酸锌溶于60ml的dmf中，超声分散10min然后放入100ml聚四氟乙烯反应釜内，100℃反应12h，冷却至室温后用dmf和乙醇溶液分别洗涤3次，60℃干燥24h，得到fss@mof-5荧光材料；
步骤2、制备比率型荧光探针：取0.5gfss@mof-5溶于50ml的水中，在搅拌的前提下加入0.042g的鸟苷一磷酸和0.05g的硝酸铕，搅拌3h后以5000rpm的速度离心5min获得沉淀，用水洗涤3次，60℃干燥24h，得到fss@mof-5@gmp/eu比率型荧光探针。
如图1中所示，制备的fss@mof-5探针是一个轮廓清晰的立方晶体，平均边长为2.1μm，通过自组装gmp/eu在fss@mof-5探针的表面后，明显观察到比率型荧光探针fss@mof-5@gmp/eu表面覆盖一种具有网络结构的聚合物薄膜。
比率型荧光探针用于四环素类抗生素检测的用途：
s1、建立检测四环素类抗生素的标准方法：配制浓度分别为0、100nm、500nm、1μm、2μm、5μm、8μm、10μm、15μm和20μm四环素溶液，并将200μl四环素溶液加入到制备的比率型fss@mof-5@gmp/eu荧光探针溶液中，反应3min后将上述溶液置于荧光分光光度计中，得到不同浓度下的荧光光谱图，按照浓度0、100nm、500nm、1μm、2μm、5μm、8μm、10μm、15μm和20μm与对应的荧光强度比值i617/i518，建立检测四环素的线性回归方程。
fss@mof-5@gmp/eu在365nm激发下显示的荧光发射峰为518nm、580nm和617nm；518nm的峰为fss的荧光特征峰，其余均为eu3 的荧光特征峰。当没有四环素存在时，fss@mof-5@gmp/eu只显示出fss的荧光强度，在365nm的紫外灯照射下，fss@mof-5@gmp/eu显示出绿色荧光。随着四环素浓度的增加，eu3 的荧光强度逐渐增加，这是因为四环素类抗生素能与eu3 特异性结合，通过“天线效应”将其吸收的能量传递给eu3 ，增强eu3 的荧光强度，而fss的荧光强度不受四环素类抗生素的影响，荧光强度值保持不变。在365nm的紫外灯照射下，fss@mof-5@gmp/eu在存在0μm、0.1μm、0.5μm、2μm、5μm、10μm、20μm、40μm、60μm和80μm的四环素下(对应图3从左到右)的荧光颜色图如图3所示，可以明显观察到fss@mof-5@gmp/eu的荧光颜色从绿色变为黄色，最后变为红色，其中绿色对应的四环素浓度范围为0-2μm；黄色对应的四环素浓度范围为5-20μm；红色对应的四环素浓度范围为40-80μm；能实现四环素的半定量可视化检测。
根据fss@mof-5@gmp/eu的荧光强度比值i617/i518与四环素的浓度变化拟合曲线，该曲线所对应的函数为：y＝0.108x 0.205，相关系数r2＝0.997，线性范围为0～20μm。
s2、牛肉样品中四环素类抗生素的检测分析：根据国标《gb/t21317-2007动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法-液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法》对样品进行预处理；将牛肉样品绞碎，称取5g牛肉样品，经过滤、超声等步骤得到含有四环素的提取液，并定容到50ml，得到牛肉四环素提取液；将200μl牛肉四环素提取液滴加到比率型fss@mof-5@gmp/eu荧光探针溶液中，反应3min后置于365nm的紫外灯下，观察到溶液荧光为浅绿色，如图4所示；可以初步判定溶液中四环素的浓度范围为100～500nm。将上述溶液置于荧光分光光度计中，得到荧光强度比值i617/i518；将得到的荧光强度比值i617/i518带入到线性回归方程中即可判定牛肉中含有四环素类抗生素的含量为156nm。
通过加标回收法评估了本方法用于牛肉中四环素类抗生素检测的实用性，并与高效液相色谱法(hplc)进行了比较。结果如表1所示，结果表明本方法与高效液相色谱法测得的结果具有较好的一致性。
表1牛肉样品中四环素检测结果和回收率
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
1.一种比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、将荧光素、乙酸锌和对苯二甲酸溶于n,n-二甲基甲酰胺中，超声、加热，待反应物冷却后，经洗涤、干燥，得到绿色发光的金属有机框架材料，记为fss@mof-5荧光材料；
步骤2、将步骤1制备的fss@mof-5荧光材料溶于水中，在搅拌的条件下分别加入鸟苷一磷酸和硝酸铕，经洗涤、离心、干燥，得到绿色发光的比率型荧光材料，记为fss@mof-5@gmp/eu荧光探针。
2.根据权利要求1所述的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤1中所述荧光素、乙酸锌、对苯二甲酸和n,n-二甲基甲酰胺的用量比为0.05～0.25g：1.12～2.19g：0.25～0.4g：40～60ml。
3.根据权利要求1所述的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤1中所述的超声功率为60～100w，时间为5～10min；所述的加热温度为90～120℃，时间为6～14h。
4.权利要求1所述的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤1中所述洗涤是用n,n-二甲基甲酰胺和乙醇溶液分别洗涤1～3次；所述干燥的温度为60～80℃，时间为24～48h。
5.根据权利要求1所述的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤2中所述的fss@mof-5荧光材料、鸟苷一磷酸、硝酸铕和水的用量比为0.01～0.05g：0.04～0.08g：0.05～0.09g：40～60ml。
6.根据权利要求1所述的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤2中所述洗涤是用水溶液洗涤1～3次；所述的离心转速为3000～5000rpm，离心时间为5～10min。
7.根据权利要求1所述的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤2中所述的搅拌时间为1～3h；步骤2中所述的干燥温度为60～80℃，时间为24～48h。
8.根据权利要求1-7任一项所述方法制备的比率型荧光探针用于检测四环素类抗生素的用途，其特征在于，按照下述步骤进行：
s1、建立检测四环素类抗生素的线性回归方程：以四环素的检测为例，将制备的fss@mof-5@gmp/eu荧光探针加入水中，得到fss@mof-5@gmp/eu荧光探针溶液；然后配制不同浓度的四环素溶液，将不同浓度的四环素溶液加入到制备的fss@mof-5@gmp/eu荧光探针溶液中，得到混合溶液；一种浓度的四环素溶液对应加入一种fss@mof-5@gmp/eu荧光探针溶液，反应后测量上述混合溶液的荧光强度比值i617/i518，根据检测的所述荧光强度比值与所对应的四环素类抗生素浓度c之间的关系，建立检测四环素类抗生素的线性回归方程；
s2、建立半定量可视化检测四环素类抗生素的方法：将s1中添加了不同浓度四环素的fss@mof-5@gmp/eu荧光材料溶液依次放置于紫外灯下，记录上述不同四环素浓度溶液对应的荧光颜色；将得到的荧光颜色与不同浓度的四环素溶液相互对应，按照四环素浓度由小到大的顺序记录荧光颜色变化，实现四环素的半定量可视化识别；
s3、食品样品中四环素类抗生素的检测分析：根据国标《gb/t21317-2007动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法-液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法》对待测样品进行预处理，得到待测样品提取液；然后将待测样品提取液，加入到制备的fss@mof-5@gmp/eu荧光材料溶液中，得到混合液放置于紫外灯下，记录混合液的荧光颜色；将得到的荧光颜色与s2中的荧光变化对比，可以判断待测样品中四环素的浓度范围，实现可视化识别；进一步测量混合液的荧光强度比值i617/i518，将荧光强度比值带入到步骤s1中建立四环素类抗生素的线性回归方程，计算出待测样品中四环素的浓度。
9.根据权利要求8所述的比率型荧光探针用于检测四环素类抗生素的用途，其特征在于，步骤s1中所述fss@mof-5@gmp/eu荧光探针溶液的浓度为0.1-0.5mgml-1；所述不同浓度的四环素溶液指浓度范围为0～20μm；所述四环素溶液与fss@mof-5@gmp/eu荧光探针溶液混合时的体积比为1：(1-2)；所述荧光分光光度计的狭缝宽度为0.5nm，检测的荧光溶液的激发波长为365nm，波长范围为500～660nm，检测617nm和518nm处的荧光强度值；所述静置的时间为1～5min。
10.根据权利要求8所述的比率型荧光探针用于检测四环素类抗生素的用途，其特征在于，步骤s2中所述的紫外灯激发波长为365nm。
技术总结