本发明属于生物医药领域，涉及一种巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术：
全世界有3亿人患有哮喘，估计到2025年将影响4亿，过敏性哮喘(aa)占儿童哮喘病例的90％，占成人哮喘病例的50％。巨噬细胞是肺中最丰富的免疫细胞(约占所有免疫细胞的70％)，它们在环境变应原引起的气道炎症中起着重要的作用。过继转移m2巨噬细胞可加重小鼠过敏性气道炎症，表明m2巨噬细胞的极化在aa发作过程中起重要作用。因此，开发针对m2巨噬细胞的新策略被认为是治疗aa的一种有前途的方法。
在我们先前的研究中，成千上万个lncrna在m1/m2极化的骨髓源性巨噬细胞(bmdm)中差异表达。其中，dnmt3aos(dna甲基转移酶3a，相反链)是一种已知的lncrna，位于dnmt3a的反义链上。并且我们已经证明dnmt3aos在m2巨噬细胞中高表达并且参与调节dnmt3a的表达。dnmt3aos和dnmt3a的表达是协调一致的，在巨噬细胞极化中起关键作用。因此，m2巨噬细胞中的dnmt3aos可能是aa的良好治疗靶标，但其在过敏性哮喘中的作用尚不清楚。
由3个小干扰rna(sirna)和3个反义寡核苷酸(aso)组成的smartsilencer在介导靶基因特异性沉默中起着重要作用。由于其不稳定性，有限的细胞摄取和不充分的血液循环，游离的aso/sirna在临床治疗中几乎不可能应用。为了克服aso/sirna传递的障碍，更高效并且更安全的传递载体对于aso或sirna治疗剂的研究和生产至关重要，例如脂质基颗粒和纳米颗粒(np)。由于其良好的生物降解性和生物相容性，欧洲药品管理局(ema)和美国食品药物管理局(fda)已批准将聚乳酸-乙醇酸共聚物(plga)用于药物和生物分子的输送，可生物吸收的缝合线，生物成像和光疗和组织再生。特别是，载有sirna的plganps表现出持续释放的特性，如先前报道的那样，在第一天释放35％，并显示超过10天的持续释放。因此，plga包裹dnmt3aos的smartsilencer对靶细胞的持续调控是值得研究的。
由于纳米载体的迅速发展，新的药物/基因递送载体也正在出现，例如细胞来源的外泌体，尤其是外泌体的膜，它们表现出优异的靶向性。从亲代细胞自然遗传的器官嗜性赋予外泌体以一系列表面粘附蛋白和特定的载体配体，以实现精确的货物穿梭。作为一种天然载体，外泌体可以将外源性mirna或sirna体内递送至靶细胞或组织，以调节基因表达并抑制疾病进展。然而，常规转染基因，外泌体中基因的表达较少，并且最近的研究还证明，当电穿孔诱导sirna进入外泌体时，sirna易于降解，表明需要建立更可靠的方案。研究表明某些np可以与sirna或aso形成复合物，这种纳米复合物的形成对于完全保护rna，防止其降解并使它们能够通过胞吞作用和细胞内释放进行细胞传递非常重要。因此，为了进一步改善np的生物分布，稳定性，功效和生物相容性，我们迫切需要建立基于外泌体修饰的plga系统，以形成结合了这两种系统优点的复合物。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒及其制备方法和应用，该仿生药有效地积累在肺部并促进了基因沉默，同时减少了炎性细胞对气道的浸润程度。
为了克服上述缺陷，本发明采用的技术方案包括：一种巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒，其特征在于，其由外泌体膜(即m2巨噬细胞外泌体膜)包被纳米颗粒(即plga@dnmt3aossmartsilencer)形成；所述的外泌体膜从骨髓来源的m2巨噬细胞分离得到；所述的纳米颗粒plga@dnmt3aossmartsilencer由聚乳酸-乙醇酸共聚物plga和dnmt3aos抑制剂(即dnmt3aossmartsilencer)共乳化形成。
一种m2巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒，其由外泌体膜包被纳米粒子形成，所述的纳米粒子为表面与聚醚酰亚胺pei偶联的纳米颗粒plga@dnmt3aossmartsilencer；所述的外泌体膜从骨髓来源的m2巨噬细胞分离得到；所述的纳米颗粒plga@dnmt3aossmartsilencer由聚乳酸-乙醇酸共聚物plga和dnmt3aos抑制剂(即dnmt3aossmartsilencer)共乳化形成。
一种巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
1)纳米颗粒plga@dnmt3aossmartsilencer的制备；
2)骨髓m2巨噬细胞外泌体膜的制备；
3)在纳米颗粒plga@dnmt3aossmartsilencer上覆盖骨髓m2巨噬细胞外泌体膜而制成巨噬细胞外泌体膜包被的仿生纳米颗粒。
在步骤1)和2)之间，还包括使纳米颗粒plga@dnmt3aossmartsilencer表面与聚醚酰亚胺pei偶联的步骤。
步骤1)具体为：将60μgplga、2ugdnmt3aossmartsilencer分别溶解后混合乳化，产生初级乳液；将乳化剂加入到初级乳液中，进一步乳化；收集纳米颗粒plga@dnmt3aossmartsilencer。
使纳米颗粒plga@dnmt3aossmartsilencer表面与聚醚酰亚胺pei偶联的步骤具体为：将纳米颗粒plga@dnmt3aossmartsilencer与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和正羟基琥珀酰亚胺溶液(即n-羟基琥珀酰亚胺(nhs，北京百灵威科技有限公司))混合以活化纳米颗粒表面；然后滴加聚醚酰亚胺pei搅拌1小时；收集pei偶联的纳米颗粒。
步骤2)具体为：极化骨髓巨噬细胞向m2型转换，收集m2巨噬细胞的上清液，离心沉淀，除去细胞碎片；将最后的上清液离心，以获得外泌体；将收获的外泌体重悬于冰冷的tm缓冲液中，反复冻融5次；添加0.25m蔗糖重悬，离心；收集上清液，进一步离心，以收集沉淀为外泌体膜。
将外泌体膜和表面偶联pei的plga@dnmt3aossmartsilencer共孵育并超声处理，得到m2巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒。
本发明的又一个目的是提供包含前述的m2巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒的过敏性哮喘治疗性药物或者药物载体。
本发明的另一个目的是提供所述的制备方法在制备过敏性哮喘治疗性药物或者药物载体中的用途。
相对于现有技术，本发明使用em-plga@dnmt3aossmartsilencer抑制aa中m2巨噬细胞极化非常显著，该仿生药有效地积累在肺部并促进了基因沉默，同时减少了炎性细胞对气道的浸润程度。因此，基于m2巨噬细胞外泌体膜的plganp有助于将治疗性dnmt3aossmartsilencer递送至气道，指导其在aa小鼠模型中更有效的治疗。
附图说明
图1.外泌体膜修饰的plganps传递dnmt3aossmartsilencer以改善aa中气道炎症的示意图。
图2.仿生纳米颗粒的组装和表征。(a)代表性的tem图像。(b)大小分布。1：plga@dnmt3aossmartsilencer，2：外泌体，3：外泌体膜，4：em-plga@dnmt3aossmartsilencer。(c)zeta电位分布。1：plga，2：pei修饰的plga，3：外泌体，4：外泌体膜，5：em-plga@dnmt3aossmartsilencer。(d)使用共聚焦激光扫描显微镜(1,000x)进行表型分析。(e)em-plga@dnmt3aossmartsilencer的稳定性。(f)通过nanodrop测量48小时内来自em-plga@dnmt3aossmartsilencer的dnmt3aossmartsilencer的释放曲线。(g)通过流式细胞仪进行表型分析，右上象限中代表em-plga@dnmt3aossmartsilencer的百分比。
图3.m2巨噬细胞在体外对em-plga@dnmt3aossmartsilencer的摄取。(a)通过激光共聚焦显微镜对游离cy5-dnmt3aossmartsilencer，cy5-plga@dnmt3aossmartsilencer和cy5-em-plga@dnmt3aossmartsilencer的体外细胞摄取。cy5-dnmt3aossmartsilencer显示为红色，dapi用于染色核(蓝色)。比例尺＝25μm。(b)流式细胞仪分析m2巨噬细胞中cy5-dnmt3aossmartsilencer的荧光分布和百分比。(c)qrt-pcr分析dnmt3aosmrna表达。(d)qrt-pcr分析dnmt3amrna表达。(e)蛋白质印迹分析dnmt3a蛋白表达。结果表示平均值±sem。(每组5只小鼠。ns，代表无显著性，*p，<0.05，**p，<0.01，***p，<0.001)。
图4.aa小鼠中em-plga@dnmt3aossmartsilencer的体内追踪和组织分布。(a)全身近红外成像，用于在静脉输注后指定时间点跟踪em-plga@dnmt3aossmartsilencer体内分布。(b)在静脉注射后2小时的时间点，取aa小鼠器官进行离体近红外成像。(c)七个时间点的荧光信号强度。(d)2小时器官中的荧光信号强度。结果表示平均值±sem。(每组5只小鼠。*p，<0.05，**p，<0.01，***p，<0.001)。
图5.体内m2巨噬细胞对em-plga@dnmt3aossmartsilencer的细胞摄取。(a)在静脉内注射后4小时从aa小鼠收集肺，准备冷冻切片。然后，分别用fitc标记的抗体(绿色)对巨噬细胞和cd4 t细胞进行染色，并通过共聚焦成像观察，使用dapi对细胞核进行染色(蓝色)。(b)注射4小时后，对巨噬细胞(m1和m2)和cd4 t细胞摄取cy5标记的仿生np进行流式细胞仪分析。结果表示平均值±sem。(每组5只小鼠。ns，无显著性，*p，<0.05，**p，<0.01，***p，<0.001)。
图6.em-plga@dnmt3aossmartsilencer治疗减轻了derf1诱导的过敏性气道炎症。(a-b)h&e和pas染色进行组织病理学检查(原始放大倍数200倍和400倍，比例尺：200μm)。(c)通过elisa检测小鼠血浆中的总ige水平。(d)通过elisa检测过敏原特异性igg。(e)balf中细胞比例统计图，流式细胞术检测门控策略：balf中性粒细胞(neu：cd45 ly6g )，嗜酸性粒细胞(eos：cd45 ly6g-siglec-f cd11c-)，肺泡巨噬细胞(am：cd45 ly6g-siglecf )。(f)气道高反应性。
图7.em-plga@dnmt3aossmartsilencer治疗可通过抑制m2巨噬细胞极化减轻炎症反应。(a)balf中巨噬细胞中cd206和inos的流式细胞仪分析。(b)m1相关基因的qrt-pcr分析。(c)m2相关基因的qrt-pcr分析。将mrna表达水平分别标准化为gapdh，并使用2-δδct方法计算。结果表示平均值±sem。(每组5只小鼠。ns，无显著性，*p，<0.05，**p，<0.01，***p，<0.001)。
图8.em-plga@dnmt3aossmartsilencer处理不会对整体免疫功能产生明显的副作用。(a)使用游离的dnmt3aossmartsilencer，plga@dnmt3aossmartsilencer和em-plga@dnmt3aossmartsilencer治疗后，对主要器官进行h&e染色。比例尺为200μm。(b)肿瘤大小，aa小鼠derf1免疫后第1天，在右腹股沟注射a549细胞(每只小鼠2×106细胞)。然后，将小鼠随机分为三组(每组七只小鼠)，并在第21-27天通过尾静脉给予em-plga@dnmt3aossmartsilencer，plga@dnmt3aossmartsilencer或游离的dnmt3aossmartsilencer。肿瘤生长曲线(c)和存活率(d)。每组7只小鼠用于实验。
图9.哮喘小鼠表现出异常的lncrnadnmt3aos和dnmt3a表达。(a)h&e染色(放大倍数200×和400×，比例尺：200μm)。(b)在balf中对巨噬细胞进行分选。(c)在balf的巨噬细胞中检测到dnmt3aos和dnmt3a表达。将mrna表达水平分别标准化为gapdh，并使用2-δδct方法计算。结果表示平均值±sem。每组5只小鼠。**p，<0.01，***p，<0.001)。
图10.m2巨噬细胞的外泌体膜没有极化能力。(a)来自m2巨噬细胞和外泌体的cd9，cd63和hsp70的蛋白质印迹分析。(b)用20ng/mlil-4(peprotech)处理bmdm，以产生m2巨噬细胞。同时，我们在m0巨噬细胞中添加m2巨噬细胞的外泌体或外泌体膜(100μg/ml)。刺激48小时后，收集细胞以通过qrt-pcr进行鉴定。(c)m2巨噬细胞的外泌体和外泌体膜的蛋白质电泳。结果表示平均值±sem。(每组n＝3孔。ns，无显著性差异，***p，<0.001)。
图11.在体内使用em-plga@dnmt3aossmartsilencer沉默巨噬细胞中dnmt3aos基因的表达。(a)使用qrt-pcr在balf的巨噬细胞中检测到dnmt3aos和dnmt3amrna的表达。(b)通过蛋白质印迹检测dnmt3a蛋白表达。结果表示平均值±sem。(每组5只小鼠。ns，无显著性差异，*p，<0.05，**p，<0.01，***p，<0.001)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的实施方式作更进一步的说明。
在本发明中，我们探索了由m2巨噬细胞外泌体膜包被的仿生纳米颗粒(em-plga@dnmt3aossmartsilencer)，它由plga@dnmt3aossmartsilencer核心和外泌体膜组成。使用em-plga@dnmt3aossmartsilencer抑制aa(过敏性哮喘)中m2巨噬细胞极化非常显著(图1)，该仿生药有效地积累在肺部并促进了基因沉默，同时减少了炎性细胞对气道的浸润程度。因此，我们相信基于外泌体膜的plganp有助于将治疗性dnmt3aossmartsilencer递送至气道，指导其在aa小鼠模型中更有效的治疗。
1.材料与方法
1.1小鼠
c57bl/6(h-2d)雌性小鼠(6-8周，20-22g)购自青龙山实验动物中心(南京，中国)，并饲养在无病原体的spf级动物房中。所有动物实验均根据《实验动物的护理和使用指南》(中华人民共和国卫生部，1998)和皖南医学院实验动物伦理委员会的指南进行。所有实验方案均由皖南医学院动物伦理委员会评估并批准(许可号：20130138)。
1.2诱发过敏性哮喘
为了诱导过敏性哮喘，在实验的第0、7和14天，将100μgderf1经腹腔注射给c57bl/6小鼠。在第21-28天，每天通过雾化器将derf1致敏给小鼠，持续15分钟，并在最后一次雾化后24小时处死小鼠。
1.3plga@dnmt3aossmartsilencer的制备
plganps是根据我们以前的双重乳液溶剂蒸发法(w1/o/w2)制备的。为了生产plga@dnmt3aossmartsilencer，将plga(60μg)溶解在氯仿(200ul)中(plga即聚乳酸-羟基乙酸共聚物，plga50/50，济南岱罡生物工程有限公司)，将2ugdnmt3aossmartsilencer溶解于无rnase的水中(基于sirna的平均分子量为13,300g/mol),两者(plga与氯仿的混合物以及2ugdnmt3aossmartsilencer与水的混合物)混合形成混合物。使用微量探针超声仪在冰浴上将混合物乳化40s，以产生初级(w1/o)乳液。接下来，将1ml1％pva(即聚乙烯醇)加入到初级乳液溶液中，然后在冰浴上以40w乳化2分钟(40w指超声破碎仪运行设置功率)。最后，继续用磁力搅拌器搅拌使有机溶剂蒸发，并使用离心机(10,000×g，5分钟)收集plga@dnmt3aossmartsilencer(其为纳米颗粒)，并用无rnase的水洗涤两次。
为了增强nps(即前述的纳米颗粒)连接蛋白(包括外泌体膜)的能力，我们进一步用pei(即聚醚酰亚胺)修饰了纳米球(即plga@dnmt3aossmartsilencer)的表面，使该表面被正氨基覆盖，从而穿过外泌体膜。简而言之，将60μgnps进一步与1mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和350μg正羟基琥珀酰亚胺溶液(sigma-aldrich，350μg指正羟基琥珀酰亚胺(nhs)的质量)混合以活化nps表面。然后向其中滴加2ml1％pei，并在室温下用磁力搅拌器搅拌4小时。最后，用不含rnase的水洗涤后，收集pei偶联的nps，并将其保存在4℃下以备后用。使用nta测量尺寸分布。使用palszeta仪器(布鲁克哈芬仪器公司)来测量zeta电位。用tem观察pei偶联的plga@dnmt3aossmartsilencer的形状和表面形态。本发明中，所有附图以及后文中，提及的plga@dnmt3aossmartsilencer均指的都是偶联pei的plga@dnmt3aossmartsilencer。
表1.smartsilencer序列
以上序列依次为seqidno.1-6。
dnmt3aossmartsilencer由表1中的6个序列以1:1:1:1:1:1的摩尔比混合而成。sirna是双链的，这里提供的6个序列均为发挥作用时的单链。dnmt3aossmartsilencer是由dnmt3aos的3条sirna和dnmt3aos的3条aso序列组成，通常抑制基因沉默可能会用该基因的一条sirna或者aso去沉默该基因的表达，而smartsilencer是集合了3条sirna和3条dnmt3aos，使抑制效率更加高效。
表2.引物序列
以上序列依次为seqidno.7-24。表2中的引物是倍数变化条形图里所检测基因的引物。
1.4从骨髓巨噬细胞(bmdms，m2)中分离外泌体
使用先前描述(·lvetal.fasebj.2020；34(4):5077-5091.pmid:32052888)的方法极化源自骨髓的m2巨噬细胞(即极化骨髓巨噬细胞，使其向m2型转换)。收集m2巨噬细胞的上清液，以1500rpm离心20分钟使细胞沉淀，然后以10，000×g离心30分钟以除去细胞碎片。将最后的上清液(即经过前述的细胞沉淀、除去细胞碎片步骤后所得的上清液)以100，000×g超速离心4h，以获得外泌体。将外泌体重悬于pbs中，并在使用前储存在-80℃下。
随后，使用bca蛋白检测试剂盒确定纯化的外泌体的蛋白浓度。westernblot检测tsg101，cd9和hsp70在外泌体中的表达。使用粒子跟踪分析仪(particlemetrix，德国)测量尺寸分布。使用palszeta仪器(布鲁克哈芬仪器公司)来测量zeta电位。用tem观察外泌体的大小和形态。
1.5外泌体膜的分离及其极化能力的检测
简而言之，分离外泌体膜。将步骤1.4收获的外泌体重悬于冰冷的tris-镁缓冲液(tm缓冲液，ph7.4、0.01mtris和0.001mmgcl2)中，在-80℃迅速冷冻并在rt(即室温)解冻。重复此冻融循环多达五次以破坏外泌体的内含物。向这些外泌体制剂(即经过前述重复冻融循环后得到的外泌体)中添加1m蔗糖，最终浓度为0.25m蔗糖，并以2，000×g离心10分钟以去除内容物沉淀。收集上清液，并在3，000×g下进一步离心60分钟，以收集外泌体膜(其为本次3，000×g离心获得的沉淀)。使用粒子跟踪分析仪(particlemetrix，德国)测量尺寸分布。使用palszeta仪器(布鲁克哈芬仪器公司)来测量zeta电位。通过tem观察外泌体膜的形态。
为了评估外泌体膜的安全性，我们检测了外泌体膜的极化能力，我们首先制备了小鼠骨髓衍生的巨噬细胞(bmdm，m0)。然后用20ng/mlil-4处理bmdm,我们在其他孔中添加m2巨噬细胞的外泌体或外泌体膜(100μg/ml)。刺激48小时后，收集得到的细胞用于qrt-pcr鉴定。
1.6em-plga@dnmt3aossmartsilencer的合成与表征
巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒(即em-plga@dnmt3aossmartsilencer)是通过孵育和超声方法在pei偶联的plga@dnmt3aossmartsilencer上覆盖外泌体膜而制成的。首先将外泌体膜(em)和纳米颗粒(即偶联了pei的plga@dnmt3aossmartsilencer)在4℃孵育40分钟，并在超声浴中处理3分钟。使用粒子跟踪分析仪(particlemetrix，德国)测量尺寸分布。使用palszeta仪器(布鲁克海文仪器公司(brookhaveninstrumentscorporation))检测zeta电位。通过tem观察形态。
cy5标记的dnmt3aossmartsilencer的荧光值用于测量em-plga@dnmt3aossmartsilencer的包封效率。将制备的生物溶液以10000rpm离心1min，并通过荧光光谱分析溶液上清液的荧光值，得到dnmt3aossmartsilencer的包封效率。包封效率等于cy5标记的em-dnmt3aossmartsilencer荧光值与上清液荧光值之差除以em-plga@dnmt3aossmartsilencer-cy5荧光值。
如上所述制备em-plga@dnmt3aossmartsilencer,随后，将其分散在37℃的1ml无rnase的水中。以预定的间隔取出5μl溶液，并与20倍体积的dmso混合。使用酶标仪测定cy5-em-plga@dnmt3aossmartsilencer的荧光强度。
1.7dnmt3aossmartsilencer的稳定性
为了检测纳米粒子的稳定性，将plga@dnmt3aossmartsilencer和em-plga@dnmt3aossmartsilencer在含10％fbs的dmem中于37℃孵育3天。并使用粒子跟踪分析仪监测其粒径。
1.8plga@dnmt3aossmartsilencer和外泌体膜的共定位
使用激光扫描共聚焦显微镜(zeisslsm800，德国)对plga@dnmt3aossmartsilencer和外泌体膜共定位进行评估。pkh26荧光标记外泌体膜(红色)和5μgfam(绿色)标记dnmt3aossmartsilencer。
1.9体外细胞摄取
将bmdm(m2巨噬细胞)接种在24孔板中6小时。接下来，将外泌体修饰的plga@dnmt3aossmartsilencer(cy5标记的红色)添加到孔板中，并在37℃下孵育4小时。用pbs洗涤细胞，并用4％多聚甲醛固定10分钟，用dapi染色核，然后使用激光扫描共聚焦显微镜(zeisslsm800，德国)拍照。对于流式细胞仪分析，将m2巨噬细胞重悬于pbs中，然后用beckmancytoflex流式细胞仪进行测试。
1.10体外测定dnmt3aos/dnmt3a表达
将bmdm(m2巨噬细胞)接种在6孔板中(1×106细胞/孔)，并以200nm的剂量与em-plga@dnmt3aossmartsilencer孵育。剂量为200nm游离的dnmt3aossmartsilencer用作阴性对照。温育48小时后收集细胞。使用定量实时pcr(qrt-pcr)评估dnmt3aosmrna表达，分别使用qrt-pcr和westernblotting评估dnmt3amrna和蛋白表达。
1.11em-plga@dnmt3aossmartsilencer对aa的体内疗效
1.11.1总ige和derf1特异性igg的测量
根据说明书收集小鼠血清用于酶联免疫吸附测定(elisa)试剂盒(r&dsystems)来检测总ige的水平。
1.11.2气道高反应性检测
用戊巴比妥(sigma-aldrich)以25mg/kg体重的剂量麻醉小鼠。使用finepointerc系统(buxcoresearchsystems)测量气道阻力。
1.11.3肺组织病理学
为了进行进一步的组织学分析，随后将哮喘小鼠的肺组织取出，并将其在4％多聚甲醛中固定24小时。随后，进行苏木精和曙红(h&e)染色和高碘酸席夫(pas)染色以评估肺部炎症。
1.11.4elisa评估细胞因子
根据说明书使用elisa试剂盒(杭州multisciences(lianke)biotechco.，ltd.)在balf中对il-4，il-5和il-13细胞因子水平进行定量。
1.11.5流式细胞仪分析
根据说明书将从balf收集的细胞与不同的抗体一起孵育。在beckmanfc500流式细胞仪上分析细胞，并使用flowjo软件包分析数据。
1.11.6通过qrt-pcr和westernblot检测dnmt3aos/dnmt3a的体内表达
将em-plga@dnmt3aossmartsilencer静脉注射到aa小鼠(6-8周)中。em-dnmt3aossmartsilencer的剂量为150nmol/kg体重。使用游离的dnmt3aossmartsilencer作为阴性对照。最后一次注射后24小时，将来自balf的免疫细胞在rpmi1640培养基(10％fbs)的6孔板中培养6小时。除去细胞悬浮液，并从板的底部收集巨噬细胞。通过qrt-pcr检测巨噬细胞中dnmt3aosmrna的表达。通过蛋白质印迹法检测dnmt3aos的蛋白表达。
1.12体内成像和分布分析
构建哮喘小鼠评估em-plga@dnmt3aossmartsilencer在其体内分布。通过尾静脉向小鼠注射cy5标记的dnmt3aossmartsilencer，cy5标记的plga@dnmt3aossmartsilencer和cy5标记的em-plga@dnmt3aossmartsilencer(200μl，200nm)。在施用后1小时，2小时，6小时，12小时，24小时和48小时，通过体内ivisspectrum(perkinelmer，美国)监测荧光分布。将小鼠安乐死2小时，对肺和主要器官成像。所有数据均通过ivis系统进行了分析。
1.13体内细胞摄取
将等体积(200μl)的cy5标记的em-plga@dnmt3aossmartsilencer，plga@dnmt3aossmartsilencer和游离的dnmt3aossmartsilencer通过尾静脉注射入aa小鼠(雌性，6-8周龄)，并在注射后收集肺。注射后4小时从各组收集肺组织，并制备厚度为7μm的冷冻切片。肺部用丙酮和异丙醇固定，并在室温下用2％bsa封闭4小时，然后在4℃下用fitc-抗小鼠f4/80染色2小时。最后，在激光扫描共聚焦显微镜上获得了em-plga@dnmt3aossmartsilencer和巨噬细胞的荧光图像。
另一方面，以1200×g离心10分钟收集的肺细胞，并用pe-cy7标记的抗f4/80，apc标记的抗inos，apc标记的抗cd206和fitc标记的抗cd4染色30分钟分钟通过离心洗涤染色的细胞以去除多余的抗体，并通过beckmancytoflex流式细胞仪进行分析。
1.14评估em-plga@dnmt3aossmartsilencer治疗对整体免疫功能的副作用
1.14.1plga@dnmt3aossmartsilencer的体内生物安全性
将小鼠随机分为3组(n＝5)，并且将其进行静脉注射。在第21-27天分别注射dnmt3aossmartsilencer，plga@dnmt3aossmartsilencer和em-plga@dnmt3aossmartsilencer。在最后一次给药后24小时将小鼠麻醉并安乐死。取主要器官(心脏，脾脏，收集肝脏和肾脏)以进行h&e染色的石蜡切片。
1.14.2抗肿瘤能力检测
aa小鼠于s.c.首次免疫尘螨主要变应原derf1后一天，在右腹股沟注射a549细胞(每只小鼠2×106细胞)。之后，将小鼠随机分为三组(每组七只小鼠)，并在第21-27天通过尾静脉给予em-plga@dnmt3aossmartsilencer，plga@dnmt3aossmartsilencer或dnmt3aossmartsilencer。每天使用尺寸尺测量肿瘤的大小，直到大小达到2500mm3，我们将其记录为死亡。测定垂直直径的乘积，并用公式计算肿瘤体积：(最短直径)2×(最长直径)×0.5。
1.15统计分析
所有测得的参数均表示为平均值±sem。统计软件graphpadprism(6.0版)用于分析。使用graphpadprism软件(6.0版)进行统计分析。进行了t检验以确定两个独立组之间的差异。p值<0.05被认为具有统计学意义。
2.结果
2.1哮喘小鼠lncrnadnmt3aos和dnmt3a呈表达
我们先前发现，lncrnadnmt3aos和dnmt3a的表达水平是协调的，两者均与巨噬细胞极化有关。由于巨噬细胞是哮喘发病机理的关键因素，因此我们首先在肺泡灌洗液中分离巨噬细胞，并评估了过敏性哮喘小鼠中dnmt3aos和dnmt3a表达。dnmt3aos和dnmt3a在来自derf1诱导的小鼠巨噬细胞中高水平表达，而在pbs诱导的小鼠中观察到dnmt3aos和dnmt3a低表达(图9b-c)。总体而言，这些结果表明lncrnadnmt3aos和dnmt3a参与了过敏性哮喘的进展。
2.2em-plga@dnmt3aossmartsilencer的表征
如图1所示，为了成功设计em-plga@dnmt3aossmartsilencer纳米复合物，将dnmt3aossmartsilencer首先用plga封装，tem显示了其光滑的球形表面(图2a)。为了在已组装的plga@dnmt3aossmartsilencer纳米复合物周围整合外泌体膜，首先从培养的自体m2巨噬细胞的上清液中分离出外泌体。tem和蛋白质印迹显示，外泌体相关蛋白cd63，hsp70和cd9高表达(图10a)，表明成功分离了m2来源的外泌体。
接下来分离外泌体膜，tem观察到em-plga@dnmt3aossmartsilencer具有典型的核-壳结构，其中球形plga被em覆盖(图2a)。尺寸分析显示83％的plga@dnmt3aossmartsilencer的范围为80至140nm，平均直径为108±3.2nm。同时，有91％的em-plga@dnmt3aossmartsilencer粒径为100至180nm，平均尺寸为137±4.5nm(图2b)。pei修饰的plga@dnmt3aossmartsilencer抑制剂的平均ζ电位为26.5±3.2mv，表明np表面具有丰富的阳离子nh2基，并具有高整合外泌体膜的能力。外泌体膜显示出负的ζ电势(-24.0±4.1mv)。结合后，em-plga@dnmt3aossmartsilencer复合物的ζ电位为-22.5±3.6mv，从而证实了这两种组分的结合，并导致形成了具有结合特性的新型纳米粒子(图2c)。
2.3em-plga@dnmt3aossmartsilencer的表型和性能
在plga的帮助下，dnmt3aossmartsilencer被有效地封装到plga中，通过共聚焦图像确认了em(pkh26，红色)与plga@dnmt3aossmartsilencer(fam，绿色，图2d)的共存。dnmt3aossmartsilencer在plga中的封装效率为70.70±1.82％(数据未显示)。另外，我们通过将em-plga@dnmt3aossmartsilencer在dmem中与10％fbs一起孵育48小时，测试了smartsilencer的稳定性。如图2e所示，em-plga@dnmt3aossmartsilencer的尺寸仅略有变化，表明它在血液中相当稳定。另一方面，在体外研究了dnmt3aossmartsilencer的释放动力学。dnmt3aossmartsilencer具有持续释放特性，超过24％的dnmt3aossmartsilencer已在24小时内释放(图2f)。
流式细胞术分析也证实了em-plga@dnmt3aossmartsilencer复合物的成功。直方图显示，em有效地耦合到plga@dnmt3aossmartsilencer上，荧光信号发生了明显的移动(数据未显示)。点图(图2g)表明plga@dnmt3aossmartsilencer中有85％共同展示了外泌体膜，这是通过在每个双色点图中双阳性em-plga@dnmt3aossmartsilencer来确定的。
2.4来源于m2巨噬细胞的外泌体膜没有极化能力
为了确认来源于m2巨噬细胞的外泌体膜的极化能力，我们将外泌体膜与m0巨噬细胞共培养了48小时。结果(图10b)证实了我们的假设，表明外泌体膜不能将m0巨噬细胞极化为m2。这是因为外泌体的含量被释放，这也被蛋白质电泳的结果所证实(图10c)，因此可以安全地用于我们随后的实验中。
2.5外泌体膜和plganp的结合有效地将dnmt3aossmartsilencer体外递送到巨噬细胞中
巨噬细胞是aa气道炎症发生的主要因素，因此，我们首先评估了dnmt3aossmartsilencer是否可以通过em修饰的plganps体外传递到m2巨噬细胞中。em-plga@dnmt3aossmartsilencer将dnmt3aossmartsilencer送入靶细胞的能力对于aa的治疗功效至关重要。在这里，cy5标记的dnmt3aossmartsilencer用作荧光指示剂，以监测em-plga@dnmt3aossmartsilencer在m2巨噬细胞中的内在化(图3a)。我们的数据表明，em-plga@dnmt3aossmartsilencer在m2巨噬细胞中具有强烈红色荧光。这清楚地表明em-plga@dnmt3aossmartsilencer对靶细胞的高亲和力，恰恰证明了外泌体膜可以促进细胞结合。虽然使用dnmt3aossmartsilencer或plga@dnmt3aossmartsilencer，但荧光信号要低得多。此外，流式细胞仪分析提供了定量证据，支持了从荧光显微镜观察得出的结论。与无cy5的dnmt3aossmartsilencer相比，直方图(图3b)显示m2巨噬细胞中em-plga@dnmt3aossmartsilencer的荧光信号发生了显着偏移，超过了plga@dnmt3aossmartsilencer。点图显示72％的em-plga@dnmt3aossmartsilencer被m2巨噬细胞吸收。这些结果表明，em修饰的plganp是将dnmt3aossmartsilencer传递到巨噬细胞中的有效载体。
2.6使用em-plga@dnmt3aossmartsilencer体外沉默巨噬细胞中dnmt3aos的表达
我们以前的研究表明，lncrnadnmt3aos调节m0巨噬细胞向m2的极化，并参与调节dnmt3a的表达。由于m2巨噬细胞极化在aa的发病机理中起着重要作用，因此抑制巨噬细胞中dnmt3aos的表达有望成为治疗aa的有效策略。为了确定em-plga@dnmt3aossmartsilencer是否在在体外使m2巨噬细胞中dnmt3aos表达沉默，我们将bmdms(m2)与em-plga@dnmt3aossmartsilencer一起孵育了6h，然后检测了dnmt3aos/dnmt3a和蛋白的mrna表达。在转染后48小时测量dnmt3a的表达。如图3c所示，通过用em-plga@dnmt3aossmartsilencer转染使m2中的dnmt3aosmrna表达沉默，而游离的dnmt3aossmartsilencer没有显示沉默作用。剂量为200nm的em-plga@dnmt3aossmartsilencer导致dnmt3aos和dnmt3amrna表达的下降率分别为43％和46％(图3d)。此外，m2中的dnmt3a蛋白表达也被下调(图3e)。em-plga@dnmt3aossmartsilencer在m2中具有更大的沉默效果，这是由于m2巨噬细胞对细胞的吸收更好。总之，em修饰的plganp能够将dnmt3aossmartsilencer递送到巨噬细胞中，以沉默dnmt3aos和dnmt3a表达。
2.7体内em-plga@dnmt3aossmartsilencer分布和m2巨噬细胞靶向能力
为了进一步确认em-plga@dnmt3aossmartsilencer在aa中的靶向能力，给小鼠注射cy5标记的em-plga@dnmt3aossmartsilencer，并通过ivis成像。图4a通过nir荧光成像显示了aa中em-plga@dnmt3aossmartsilencer的体内动力学过程。活体全身荧光成像显示，在注射em-plga@dnmt3aossmartsilencer后1到36h，小鼠的荧光强度最强，全身持续时间超过48h。作为对照，dnmt3aossmartsilencer和plga@dnmt3aossmartsilencer显示了类似于em-plga@dnmt3aossmartsilencer的体内跟踪。游离的dnmt3aossmartsilencer在6h后迅速清除，而plga@dnmt3aossmartsilencer在1到36h的时间点上积累较少，保留时间更短。荧光成像结果表明，em-plga@dnmt3aossmartsilencer主要分布在肝脏，脾脏，肾脏和肺部。在肺中，em-plga@dnmt3aossmartsilencer的荧光信号在1h时可见，荧光强度在6h达到峰值。相比之下，plga@dnmt3aossmartsilencer在6h和24h时降低。在2h时，em-plga@dnmt3aossmartsilencer组的肺部荧光信号强度比游离dnmt3aossmartsilencer组增强5倍，比plga@dnmt3aossmartsilencer组强1.3倍。因此，肺组织中em-plga@dnmt3aossmartsilencer的分布比plga@dnmt3aossmartsilencer的分布增加可能主要是由于外泌体膜的高亲和力功能。更为重要的是，em-plga@dnmt3aossmartsilencer持续而强烈的荧光表明它们具有出色的靶向能力。
另一方面，在注射后2小时收集肺，并准备冷冻切片用于免疫荧光染色。正如在共聚焦图像中发现的那样(图5a)，cy5标记的em-plga@dnmt3aossmartsilencer主要呈现出与巨噬细胞的共定位，而与cd4 t细胞的共定位则很少。平行地，制备肺单细胞悬液，然后进行免疫荧光染色。如流式细胞仪所示(图5b)，与dnmt3aossmartsilencer和plga@dnmt3aossmartsilencer组相比，em-plga@dnmt3aossmartsilencer显示出dnmt3aos–m2巨噬细胞结合物的百分比显着高于m1，而dnmt3aos–cd4 t细胞结合物的百分比则显著降低。
随后，我们确定em修饰的plga@dnmt3aossmartsilencer是否可以在体内下调dnmt3aos基因的表达。七次注射em-plga@dnmt3aossmartsilencer后，从balf中分离出巨噬细胞，并检测到dnmt3aos和dnmt3a基因表达。如图11a所示，em-plga@dnmt3aossmartsilencer显着下调了巨噬细胞中的dnmt3aos和dnmt3amrna表达，而在dnmt3aossmartsilencer组中未观察到沉默效果。此外，还分析了dnmt3a蛋白在巨噬细胞中的表达。如图11b所示，em-plga@dnmt3aossmartsilencer也大大降低了蛋白表达。从这些结果，我们得出结论，静脉注射em-plga@dnmt3aossmartsilencer能够沉默dnmt3aos在体内m2巨噬细胞中的表达。
2.8em-plga@dnmt3aossmartsilencer抑制derf1诱导的aa炎症的发展
接下来，我们评估了使用em-plga@dnmt3aossmartsilencer是否可以抑制derf1过敏原诱发的过敏性炎症的发展。与dnmt3aossmartsilencer和plga@dnmt3aossmartsilencer相比，em-plga@dnmt3aossmartsilencer治疗的哮喘小鼠组织学结果表明，炎性细胞向肺部的募集较少，支气管周浸润和杯状细胞增生较少(图6a-b)。响应der-f1攻击，游离dnmt3aossmartsilencer处理的小鼠血浆中的总ige增至1150.37±103.9ng/ml，plga@dnmt3aossmartsilencer处理的小鼠血浆中的总ige增至813.67±53.9ng/ml，而em-plga@dnmt3aossmartsilencer处理的小鼠低得多，为598.32±63.17ng/ml。同时，derf1特异性igg1和igg2a的水平也降低了(图6c-d)。同时，与dnmt3aossmartsilencer处理的小鼠相比，em-plga@dnmt3aossmartsilencer处理的小鼠的bal液中的嗜酸性粒细胞和巨噬细胞分别减少了28％和50％(图6e)。
为了进一步评估em-plga@dnmt3aossmartsilencer对哮喘发病机制的影响，我们通过测量机械通气小鼠对增加浓度的乙酰胆碱的肺抵抗(rn)反应，研究了ahr。如所期望的，与游离的dnmt3aossmartsilencer相比，em-plga@dnmt3aossmartsilencer处理的小鼠表现出对乙酰胆碱的响应的rn值显著降低(图6f)。
鉴于m2巨噬细胞在介导哮喘发病机制中的关键作用，我们在aa中用游离dnmt3aossmartsilencer，plga@dnmt3aossmartsilencer或em-plga@dnmt3aossmartsilencer治疗后检测到了巨噬细胞。流式细胞术揭示了em-plga@dnmt3aossmartsilencer处理的小鼠的balf中m2巨噬细胞的数量明显减少，如cd206表达所示(图7a)。来自em-plga@dnmt3aossmartsilencer处理的小鼠的balf样品的pcr分析显示，与游离dnmt3aossmartsilencer处理的小鼠相比，m2标记arginase-1的表达降低了0.6倍(图7b)。对于另外一种m2标记fizz-1，也观察到了相似的结果，尽管在它们之间ym-1表达的差异并不显着。em-plga@dnmt3aossmartsilencer的注射也影响了m1标记的产生(图7c)。总之，这些数据表明，em-plga@dnmt3aossmartsilencer的给药通过抑制气道中m2巨噬细胞的极化，从而保护了小鼠免于derf1诱导的过敏性气道炎症。
2.9em-plga@dnmt3aossmartsilencer治疗不会对整体免疫功能产生明显的副作用
简而言之，将小鼠随机分为4组(n＝5)，并且将其静脉内注射。注入pbs，dnmt3aossmartsilencer，plga@dnmt3aossmartsilencer或em-plga@dnmt3aossmartsilencer。在最后一次给药后24小时将小鼠麻醉并安乐死。石蜡切片的主要器官(包括心脏，脾脏，肝脏和肾脏)进行了h&e染色。结果(图8a)显示，与pbs组相比，em-plga@dnmt3aossmartsilencer组几乎没有显示出明显的病理异常，表明体内生物安全性良好。
此外，小鼠的抗肿瘤能力通常被用作监测人体总体免疫功能的指标之一。aa小鼠是s.c.首次免疫derf1后第1天，在右腹股沟注射a549细胞(每只小鼠1×106细胞)。然后，将小鼠随机分为三组(每组七只小鼠)，并在第21-27天通过尾静脉给予em-plga@dnmt3aossmartsilencer，plga@dnmt3aossmartsilencer或dnmt3aossmartsilencer。如图所示，荷瘤aa小鼠的肿瘤生长曲线(图8b)和存活率(图8c)在各治疗组之间没有显示出显着差异。
sirna药物在体内的运输是一个不容忽视的问题。由于aso/sirna的稳定性和低脱靶效应，一些aso/sirna介导的基因沉默已成功实现了临床翻译。但是，作为聚阴离子和亲水性分子，裸露的aso/sirna无法自动穿透带负电的细胞膜到达目标mrna所在的细胞内空间。此外，存在脱靶效应和免疫原性的潜力。因此，复杂的aso递送仍然是对基于aso的治疗方法发展的重大挑战。为此，本发明设计了一种可生物降解的高分子有机化合物和外泌体膜复合物，以实现高效的dnmt3aos抑制剂输送，并进一步改善纳米载体对肺组织中m2巨噬细胞的靶向性，完全克服了寡核苷酸纳米载体从目标组织脱落的问题。
外泌体膜修饰的plganps源自m2巨噬细胞的外泌体，并通过反复冷冻和融化，重复离心，然后与plganps杂交来除去内含物。其中，外泌体膜的应用可使em-plga@dnmt3aossmartsilencer继承外泌体的天然核酸递送行为及其“归巢”性能，而添加plganp则可改善整个递送系统的稳定性。m2巨噬细胞对em-plga@dnmt3aossmartsilencer的吸收和一系列实验结果表明，它在体内的循环时间长，并且具有克服血液清除的能力。em-plga@dnmt3aossmart消声器在小鼠中的组织和器官分布结果表明其在肺组织中的良好“归巢”目标。同时，我们还评估了em-plga@dnmt3aossmartsilencer在细胞水平和动物水平的基因沉默效率，以及aa的抗炎作用。结果表明，em-plga@dnmt3aossmartsilencer提供的dnmt3aossmartsilencer在细胞和动物水平具有生物活性，可以有效地使dnmt3aos的表达沉默，并具有显著的消炎作用，同时对正常组织无毒。
在本发明中，我们将smartsilencer用于lncrnadnmt3aos沉默，而不是单个aso或sirna。我们使用了由3个sirna和3个aso组成的lncrna智能沉默子抑制剂系列，它们具有比普通sirna更高的敏感性和抑制效率。体内和体外实验的结果也证实了dnmt3aossmartsilencer的优异治疗效果。
总而言之，本发明成功设计了em-plga@dnmt3aossmartsilencer，将其作为一种简单而天然的纳米级药物递送平台，可有效治疗aa(过敏性哮喘)。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
序列表
<110>皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院）
<120>一种巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒及其制备方法和应用
<160>24
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1.一种巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒，其特征在于，其由外泌体膜包被纳米颗粒plga@dnmt3aossmartsilencer形成；所述的外泌体膜从骨髓来源的m2巨噬细胞分离得到；所述的纳米颗粒plga@dnmt3aossmartsilencer由聚乳酸-乙醇酸共聚物plga和dnmt3aos抑制剂dnmt3aossmartsilencer共乳化形成。
2.一种巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒，其特征在于，其由外泌体膜包被纳米颗粒形成，所述的纳米颗粒为表面与聚醚酰亚胺pei偶联的纳米颗粒plga@dnmt3aossmartsilencer；所述的外泌体膜从骨髓来源的m2巨噬细胞分离得到；所述的纳米颗粒plga@dnmt3aossmartsilencer由聚乳酸-乙醇酸共聚物plga和dnmt3aossmartsilencer共乳化形成。
3.权利要求1或2所述的巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)纳米颗粒plga@dnmt3aossmartsilencer的制备；
2)骨髓m2巨噬细胞外泌体膜的制备；
3)在纳米颗粒plga@dnmt3aossmartsilencer上覆盖骨髓m2巨噬细胞外泌体膜而制成巨噬细胞外泌体膜包被的仿生纳米颗粒。
4.根据权利要求3所述的m2巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒的制备方法，其特征在于，在步骤1)和2)之间，还包括使纳米颗粒plga@dnmt3aossmartsilencer表面与聚醚酰亚胺pei偶联的步骤。
5.根据权利要求3所述的m2巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤1)具体为：将60μgplga、2ugdnmt3aossmartsilencer分别溶解后混合乳化，产生初级乳液；将乳化剂加入到初级乳液中，进一步乳化；收集纳米颗粒plga@dnmt3aossmartsilencer。
6.根据权利要求4所述的m2巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒的制备方法，其特征在于，使纳米颗粒plga@dnmt3aossmartsilencer表面与聚醚酰亚胺pei偶联的步骤具体为：将纳米颗粒plga@dnmt3aossmartsilencer与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和正羟基琥珀酰亚胺溶液混合以活化纳米颗粒表面；然后滴加聚醚酰亚胺pei搅拌1小时；收集pei偶联的纳米颗粒。
7.根据权利要求3所述的m2巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤2)具体为：极化骨髓巨噬细胞向m2型转换，收集m2巨噬细胞的上清液，离心沉淀，除去细胞碎片；将最后的上清液离心，以获得外泌体；将收获的外泌体重悬于冰冷的tm缓冲液中，反复冻融5次；添加0.25m蔗糖重悬，离心；收集上清液，进一步离心，以收集沉淀为外泌体膜。
8.根据权利要求3所述的m2巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒的制备方法，其特征在于，将外泌体膜和表面偶联pei的plga@dnmt3aossmartsilencer共孵育并超声处理，得到m2巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒。
9.包含权利要求1或2所述的纳米颗粒的过敏性哮喘治疗性药物或者药物载体。
10.权利要求3-9任意一项所述的制备方法在制备过敏性哮喘治疗性药物或者药物载体中的用途。
技术总结