本发明属于高分子材料领域，涉及一种聚合物囊泡的制备方法，具体涉及一种薄膜退火技术与水合法复合工艺制备聚合物囊泡的方法。
背景技术：
聚合物囊泡是由两亲性嵌段共聚物在溶液中有序自组装而成的中空球体结构，其形状与脂质体相似。在水溶液中，聚合物囊泡的膜层结构类似三明治，中间层是由疏水链段紧密排列形成的疏水层，疏水层的内外两侧由亲水链段伸展形成刷状。聚合物囊泡的内部水核可负载亲水性分子，疏水膜层可负载疏水性分子，因此在药物递送、医学诊断、食品工业及化妆品行业等领域有着广泛的应用。尤其是近年来随着生物医药行业的迅速发展以及疫情的爆发，利用聚合物囊泡负载蛋白、核酸药物以及核酸疫苗等生物医药产品更是被业界寄予了厚望。
peg(聚乙二醇)作为亲水链段，pla(聚乳酸)或pcl(聚己内酯)作为疏水链段的嵌段共聚物具有优异的生物相容性和可降解性能，是制备用于生物医药领域的聚合物囊泡的最佳候选体系。聚合物囊泡制备的常用方法为薄膜水合再生法，即将聚合物溶于某种有机溶剂后，将有机溶剂以旋蒸、氮气吹干或其它方式除去后，在室温或不高于40℃的温度下真空干燥制备薄膜，再添加水或缓冲液搅拌而成。然而，该方法下制备的囊泡往往形成缓慢，且生成的囊泡尺寸分布较广，从纳米级到微米级不等，不利于人体内组织或者细胞的递送。
技术实现要素：
本发明的目的是克服现有技术上述的缺点，提供一种聚合物囊泡的制备方法。本发明先利用选定溶剂制备薄膜和薄膜热退火制备具有一定微相分离的形貌结构的薄膜，再通过水合法制备得到纳米级、窄分布的聚合物囊泡。该方法能可控、批量制备纳米级及尺寸均一的聚合物囊泡。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一种聚合物囊泡的制备方法，包括如下步骤：
1)将嵌段共聚物或嵌段共聚物和需负载的疏水分子加入到有机溶剂中，搅拌制得均匀的嵌段共聚物溶液；
2)使用旋蒸或氮气吹干除去有机溶剂，得透明薄膜；
3)将薄膜置于真空条件下热退火；
4)当步骤1)是将嵌段共聚物加入到有机溶剂中时，加入水或缓冲液后搅拌，得到聚合物囊泡；或加入已溶解需负载亲水分子的水或缓冲液后搅拌，得到负载亲水分子的聚合物囊泡；当步骤1)是将嵌段共聚物和需负载的疏水分子加入到有机溶剂中时，加入水或缓冲液后搅拌，得到负载疏水分子的聚合物囊泡；或加入已溶解需负载亲水分子的水或缓冲液后搅拌，得到同时负载亲、疏水分子的聚合物囊泡。
步骤1)中所述的步骤1)中所述的嵌段共聚物优选为ab型、aba型、bab型、bac型、abc型、ababa型、abaca型嵌段共聚物中的至少一种；其中，嵌段a为亲水链段，嵌段b和嵌段c为不同的疏水链段；
所述的亲水链段优选为聚乙二醇；所述的疏水链段优选为聚乳酸或聚己内酯。
步骤1)中所述的疏水分子可以是疏水性荧光染料或疏水性小分子药物。
所述疏水性荧光染料优选为尼罗红(nilered)；所述疏水性小分子药物优选为紫杉醇(ptx)。
步骤1)中所述的有机溶剂优选为四氢呋喃(thf)。
步骤1)中所述的嵌段共聚物与有机溶剂的配比优选为2～15mg:1ml。
步骤1)中所述的搅拌的条件优选为100～500r/min，15～30min。
步骤3)中所述的热退火的条件优选为60℃～80℃，8～12h。
步骤4)中所述的亲水分子可以是亲水性小分子药物、蛋白或核酸。所述亲水性小分子药物优选为阿霉素(dox)；所述蛋白优选为小牛血清白蛋白(bsa)；所述核酸优选为质粒dna、反义寡核苷酸、信使rna(mrna)、小干扰rna(sirna)。
步骤4)中所述的水，缓冲液，已溶解需负载亲水分子的水或缓冲液的用量，均优选按与嵌段共聚物的配比为1ml:2～15mg计。
步骤4)中所述的搅拌的条件优选为室温，100～500r/min，12～24h。所述的室温是指20～30℃。
一种聚合物囊泡，通过上述制备方法制备得到。
本发明中制备聚合物囊泡的方法，其突出特点是先利用薄膜退火技术制备具备微相结构的薄膜，再使用水合法，得到纳米级尺寸均一(平均粒径为50～300nm)的聚合物囊泡。利用选定溶剂制备薄膜，其效果相当于特定的溶剂退火。再进行热退火，可制备具备微相结构的薄膜。具备微相结构的薄膜在水合的过程中，聚合物无需溶解至单体再完成自组装，而是部分薄膜脱落至水中，弯曲再闭合成球体形成囊泡，避免形成其它自组装结构，从而更加可控、高效。
附图说明
图1是薄膜退火技术及水合法的示意图；其中，①为使用指定溶剂制备薄膜后进行热退火处理，②为加入水或缓冲液搅拌。
图2是实施例1薄膜的原子力显微镜照片。
图3是实施例1制得的聚合物囊泡的透射电镜照片；其中，(1)为薄膜热退火 水合法制得的聚合物囊泡，(2)为普通薄膜水合法制得的聚合物囊泡。
图4是通过动态光散射测得实施例1的聚合物囊泡的粒径分布图。
图5是实施例5制得的载阿霉素聚合物囊泡被细胞吞噬后的共聚焦显微镜照片；其中，(1)为阿霉素的荧光信号(红色)，(2)为细胞在白光条件下的激光共聚焦显微镜照片，(3)为(1)和(2)的合并图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
实施例1：
称取20mg嵌段共聚物peg5000-pla12000，加入到2ml的thf中，搅拌(500r/min)15分钟制得10mg/ml的嵌段共聚物溶液；将嵌段共聚物溶液通过旋蒸除去thf，得到透明薄膜；放置于80℃真空干燥箱中，对薄膜进行热退火12h。然后加入2ml去离子水，室温下搅拌(400r/min)12h即制得聚合物囊泡。本实施例制备的聚合物囊泡的透射电镜图如图3(1)所示，结果显示，用本发明的技术(薄膜退火 水合法)制备的在短时间搅拌下已可形成均一的纳米级囊泡，而用传统技术(普通薄膜水合法，未进行薄膜热退火操作)在相同的时间下，囊泡生成的数量较少，且出现不规则聚集体(图3(2))，若要获得更多的囊泡，往往需较长(通常为数日)的搅拌时间。如图4所示，用本发明的技术制备的囊泡平均粒径为95nm，粒径分布(pdi)为0.014。
实施例2：
称取20mg嵌段共聚物peg2000-pcl7500，加入到2ml的thf中，搅拌(100r/min)30分钟制得5mg/ml的嵌段共聚物溶液；将嵌段共聚物溶液用氮气吹干除去thf，得到透明薄膜；放置于70℃真空干燥箱中，对薄膜进行热退火10h。然后加入2ml去离子水，室温下搅拌(400r/min)18h即制得聚合物囊泡。
实施例3：
称取20mg嵌段共聚物peg4000-pla20000-peg4000，加入到2ml的thf中，搅拌(500r/min)15分钟制得10mg/ml的嵌段共聚物溶液；将嵌段共聚物溶液通过旋蒸除去thf，得到透明薄膜；放置于80℃真空干燥箱中，对薄膜进行热退火12h。然后加入2ml去离子水，室温下搅拌(400r/min)24h即制得聚合物囊泡。
实施例4：
称取20mg嵌段共聚物peg6000-pla8000-pcl8000和10μg的尼罗红，加入到2ml的thf中，搅拌(500r/min)15分钟制得10mg/ml的嵌段共聚物溶液；将嵌段共聚物溶液通过旋蒸除去thf，得到透明薄膜；放置于80℃真空干燥箱中，对薄膜进行热退火12h。然后加入2ml去离子水，室温下搅拌(400r/min)24h即制得载尼罗红聚合物囊泡。
实施例5：
称取20mg嵌段共聚物peg4000-pcl10000，加入到2ml的thf中，搅拌(500r/min)15分钟制得10mg/ml的嵌段共聚物溶液；将嵌段共聚物溶液用氮气吹干除去thf，得到透明薄膜；放置于70℃真空干燥箱中，对薄膜进行热退火10h。然后加入2ml盐酸阿霉素水溶液(1mg/ml)，室温下搅拌(400r/min)18h即制得载盐酸阿霉素聚合物囊泡。透析除去未包裹的阿霉素后进行细胞培养(图5)。具体操作如下：向4t1细胞中加入载阿霉素的聚合物囊泡10μl，在37℃，5％co2培养箱中共培养4h。图5中(1)为阿霉素的荧光信号(红色)；(2)为细胞在白光条件下的激光共聚焦显微镜照片；(3)为(1)和(2)的合并图，结果显示，载阿霉素的囊泡成功将阿霉素递送进入细胞内。
实施例6：
称取20mg嵌段共聚物peg2000-pla6000-peg2000-pla6000-peg2000，加入到2ml的thf中，搅拌(500r/min)15min制得5mg/ml嵌段共聚物溶液；将嵌段共聚物溶液用氮气吹干除去thf，得到透明薄膜；放置于80℃真空干燥箱中过夜，对薄膜进行热退火。加入2ml含反义寡核苷酸(30μmol/l)的磷酸盐缓冲液，室温下搅拌(400r/min)18h即制得载反义寡核苷酸聚合物囊泡。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
1.一种聚合物囊泡的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)将嵌段共聚物或嵌段共聚物和需负载的疏水分子加入到有机溶剂中，搅拌制得均匀的嵌段共聚物溶液；
2)使用旋蒸或氮气吹干除去有机溶剂，得到透明薄膜；
3)将薄膜置于真空条件下热退火；
4)当步骤1)是将嵌段共聚物加入到有机溶剂中时，加入水或缓冲液后搅拌，得到聚合物囊泡；或加入已溶解需负载亲水分子的水或缓冲液后搅拌，得到负载亲水分子的聚合物囊泡；当步骤1)是将嵌段共聚物和需负载的疏水分子加入到有机溶剂中时，加入水或缓冲液后搅拌，得到负载疏水分子的聚合物囊泡；或加入已溶解需负载亲水分子的水或缓冲液后搅拌，得到同时负载亲、疏水分子的聚合物囊泡。
2.根据权利要求1所述的聚合物囊泡的制备方法，其特征在于：
步骤1)中所述的嵌段共聚物为ab型、aba型、bab型、bac型、abc型、ababa型、abaca型嵌段共聚物中的至少一种；其中，嵌段a为亲水链段，嵌段b和嵌段c为不同的疏水链段；
步骤1)中所述的疏水分子是疏水性荧光染料或疏水性小分子药物；
步骤4)中所述的亲水分子是亲水性小分子药物、蛋白或核酸。
3.根据权利要求2所述的聚合物囊泡的制备方法，其特征在于：
所述的亲水链段为聚乙二醇；所述的疏水链段为聚乳酸或聚己内酯。
4.根据权利要求3所述的聚合物囊泡的制备方法，其特征在于：
所述疏水性荧光染料为尼罗红；所述疏水性小分子药物为紫杉醇；
所述亲水性小分子药物为阿霉素；所述蛋白为小牛血清白蛋白；所述核酸为质粒dna、反义寡核苷酸、信使rna或小干扰rna。
5.根据权利要求1所述的聚合物囊泡的制备方法，其特征在于：
步骤1)中所述的有机溶剂为四氢呋喃。
6.根据权利要求1所述的聚合物囊泡的制备方法，其特征在于：
步骤1)中所述的嵌段共聚物与有机溶剂的配比为2～15mg:1ml。
7.根据权利要求1所述的聚合物囊泡的制备方法，其特征在于：
步骤3)中所述的热退火的条件为60℃～80℃，8～12h。
8.根据权利要求1所述的聚合物囊泡的制备方法，其特征在于：
步骤4)中所述的水，缓冲液，已溶解需负载亲水分子的水或缓冲液的用量，均按与嵌段共聚物的配比为1ml:2～15mg计。
9.根据权利要求1所述的聚合物囊泡的制备方法，其特征在于：
步骤1)中所述的搅拌的条件为100～500r/min，15～30min；
步骤4)中所述的搅拌的条件为室温，100～500r/min，12～24h。
10.一种聚合物囊泡，通过权利要求1-9任一项所述的聚合物囊泡的制备方法制备得到。
技术总结