本发明属于纳米药物技术，具体涉及聚合物囊泡纳米sting激动剂及其制备方法与应用。
背景技术：
sting通路的激活可增强机体抗肿瘤的免疫能力，是肿瘤免疫治疗的一种有前途的方法。有研究表明，sting激动剂有利于促进tme中t细胞的浸润以及抗肿瘤免疫治疗。除了天然的cgamp，病毒、脂质体和环状二核苷酸（cdn）也是sting通路的激动剂，目前主要研究的是cdn，如合成的cgamp、cdiamp等。但cdn作为带负电荷、亲水性强的小分子，不容易穿过细胞膜进入apc，还容易被酶解，此外，cdn在体内容易随机扩散和清除，药代动力学差，其全身扩散还可能引起细胞因子风暴。抗肿瘤纳米药物的研发方兴未艾。阳离子聚合物尤其是聚乙烯亚胺（pei）具有出色的压缩/复合核酸的能力和内涵体/溶酶体逃逸能力，常用于核酸类药物的递送。然而，高分子量pei的转染能力强，毒性也高，阻碍了其实际体内应用。低分子量pei毒性虽低但转染效率也低。精胺（sp）是人体内源性多肽小分子阳离子化合物，安全性更高。如何高效低毒地装载cdn并高效释放到apc细胞、激活sting通路引发高效抗肿瘤免疫应答是一个挑战。
技术实现要素：
本发明公开了聚合物囊泡纳米sting激动剂及其制备方法与应用，解决了高效核酸药物递送与载体毒性间的矛盾。本发明合成和表征了peg-p(tmc-dtc)-pei和peg-p(tmc-dtc)-sp，它们在含有cdn的水相中自组装成具有不对称膜结构的囊泡：较长peg链段（5kda）为囊泡外壳、较短pei或sp为囊泡内壳，内壳与带负电的cdn通过静电相互作用复合，从而得到了高效载cdn的囊泡cps-cdn；囊泡疏水膜中含有dtc所赋予的还原敏感的自交联结构使得cdn的装载更稳定。这样的内壳带正电荷的具有不对称膜结构的囊泡能高效装载和递送cdn到肿瘤细胞内，实现了肿瘤的高效治疗；现有技术没有过该囊泡装载二核苷酸的研究和报道。
本发明基于还原敏感可逆交联的聚合物囊泡，使用低毒的低分子量pei（600da、1200da等）和sp为阳离子片段，设计制备了两种内壳带正电的聚合物囊泡用于装载cdn形成囊泡sting激动剂（cps-cdn），分析了其激活sting通路产生抗肿瘤免疫的效果。本发明采用如下技术方案：
聚合物囊泡纳米sting激动剂，由聚合物囊泡装载sting激动剂组成；所述聚合物包括亲水链段、疏水链段以及阳离子片段；所述疏水链段的侧链为含双硫键的二硫戊环。
进一步的，组成载体的聚合物的化学结构式如下：
r为亲水链段，比如聚乙二醇链段；t链段与侧链含双硫键的碳酸酯链段（dtc单体形成的单元）组成疏水链段，t为环酯单体或者环碳酸酯单体形成的单元，比如丙交酯、己内酯、三亚甲基碳酸酯；p为阳离子片段，比如聚乙烯亚胺（pei）、精胺（sp）；y、z表示重复单元。
本发明中，所述亲水链段的分子量为3000～10000da；疏水链段的分子量为亲水链段分子量的2.1～8.0倍；侧链含双硫键的碳酸酯链段的分子量为t链段分子量的10%～35%；阳离子片段的分子量为亲水链段分子量的5%～30%。
本发明中，sting激动剂为环二核苷酸（cdn），包括环二单磷酸鸟苷（c-di-gmp）、环二单磷酸腺苷（c-di-amp）、2`,3`环单磷酸鸟-单磷酸腺苷酸（2`,3`-cgmap）、3`,3`环单磷酸鸟-单磷酸腺苷酸（3`,3`-cgmap）及其取代衍生物，比如硫、氟、氮取代环二核苷酸衍生物。
本发明中，聚合物形成囊泡，装载sting激动剂得到cps-cdn，囊泡疏水膜中含有dtc所赋予的还原敏感的自交联结构使得cdn的装载更稳定，这样的内壳带正电荷的具有不对称膜结构的囊泡能高效装载和递送药物到肿瘤细胞内，实现了肿瘤的高效治疗，现有技术还没有过该囊泡装载环二核苷酸的研究和报道。cps-cdn被apc摄取，通过质子海绵效应破坏溶酶体后逃离，细胞质中释放cdn，与内质网上的sting蛋白结合，启动sting通路，促进t细胞识别和杀死肿瘤细胞。本发明发现基于两种聚合物的囊泡在理化性质、细胞内吞、胞内药物释放、促进dc成熟，以及抗小鼠黑色素瘤活性方面存在差异。此外，由于x射线能使肿瘤释放肿瘤相关抗原taa，诱导肿瘤细胞双链dna的断裂进而激活cgas-sting通路，本发明进一步探究了cps-cdn与x射线联用协同增强的抗肿瘤疗效。结果表明，二者联用提高了肿瘤微环境tme中ifn-β的浓度，促进了dc细胞的成熟，提高了tme中cd8 t的比率，从而增强了对b16f10肿瘤的抑制，延长了荷瘤小鼠的生存时间。本发明公开了上述聚合物囊泡纳米sting激动剂在制备抗肿瘤药物中的应用；肿瘤优选为黑色素瘤。
本发明公开了上述聚合物囊泡纳米sting激动剂的制备方法，将sting激动剂溶液加入缓冲溶液中，再加入聚合物溶液，搅拌后透析，得到聚合物囊泡纳米sting激动剂。进一步的，sting激动剂溶液为sting激动剂水溶液；聚合物溶液为聚合物的dmf溶液；缓冲溶液为hepes缓冲溶液。其中，sting激动剂溶液的浓度为0.1～10mg/ml；聚合物溶液的浓度为1～100mg/ml。
本发明设计了双硫交联的聚合物囊泡用于sting激动剂cdn的递送，并研究了其联合放疗增强抗肿瘤免疫反应。聚合物囊泡的粒径为47nm，可高效包载cdn，并且具有高生物安全性、载药稳定性以及还原响应性，这是首次用囊泡装载adu-s100并联合放射用于黑色素瘤的治疗，并首次比较了低剂量的x射线联合纳米sting激动剂对tme的改变以及抗肿瘤治疗的影响。与目前报道的sting激动剂治疗相比，这种新的治疗策略有以下优点：1）聚合物囊泡可实现cdn的高效包载，囊泡膜的二硫交联使其结构稳定，并在细胞内还原环境下快速释放cdn；2）聚合物囊泡的纳米级特性提高了apc细胞对sting激动剂的细胞摄取，延长了其在肿瘤部位的滞留，大大提高了sting激动剂的免疫活性，增强sting通路的激活；3）与x射线联用，增强了sting通路的激活，促进i型ifn以及其他细胞因子的分泌，激活dc的成熟以及t细胞的活化，改善tme，诱导了强大的抗肿瘤免疫反应。4）联用的策略解决了低剂量的x射线可以避免造成组织的损伤但肿瘤抑制效果不佳的缺陷。
附图说明
图1为本发明聚合物囊泡纳米sting激动剂cps-cdn的制备及其联合x射线用于荷黑色素瘤小鼠的抗肿瘤免疫治疗的示意图；
图2为peg-p(tmc-dtc)-pei的1hnmr谱图（600mhz，cdcl3）以及peg-p(tmc-dtc)-sp的1hnmr谱图（400mhz，cdcl3）；
图3为聚合物囊泡的理化性质表征；
图4为空囊泡cps/pei（a）和cps/sp（b）与dc2.4、raw264.7、b16f10三种细胞共孵育12h后的细胞存活率；
图5为cy5-cps/pei-diamp和cy5-cps/sp-diamp与dc2.4、raw264.7、b16f10三种细胞共孵育24h后的细胞内吞的流式单参数直方图；
图6为dc2.4细胞与cps/pei-cy3-diamp或cps/sp-cy3-diamp共孵育2h的clsm图片（a）和（b）cy3-diamp的荧光半定量图（cy3-diamp浓度为300nm）。细胞核用dapi（蓝色）染色，溶酶/内涵体用lysotrackerdeepred（红色）染色，绿色荧光为cy3-diamp。标尺为20μm；
图7为体外bmdc的活化。bmdc与pbs、cps/sp、cps/pei、cdn、cps/sp-cdn或cps/pei-cdn共孵育24h后的流式细胞等伪色图（a）和被激活bmdc的定量统计（b）（n=3）。fitc-αcd11c标记bmdc细胞，apc-αcd80和pe-αcd86标记成熟的bmdc细胞；（c）使用elisa试剂盒检测培养基中分泌的细胞因子ifn-β浓度；
图8为肿瘤组织切片clsm图片显示瘤内注射cy3-diamp或cy5-cps/pei-cy3-diamp后24h的各荧光的分布。dapi（蓝色）：细胞核，cy3（绿色）：二核苷酸diamp，cy5（红色）：聚合物囊泡。标尺为20μm；
图9为cps/pei-cdn及其与x射线联用在荷黑色素瘤b16f10小鼠中的免疫治疗（n=3）。在第0、3、6、9天给药：3gyx射线、cps/pei-cdn 3gyx射线、或cps/sp-cdn 3gyx射线，囊泡cdn通过瘤内给药，cdn剂量为20μg/只，x射线在皮下瘤局部照射，pbs为对照组。（a）b16f10肿瘤模型的建立及给药方案；相对肿瘤体积（b）和体重（c）变化；（d）每只老鼠的相对肿瘤体积变化；
图10为3gyx射线与cps/pei-cdn、cdn联合治疗b16f10荷瘤小鼠。（a）肿瘤模型的建立以及联合瘤内给药方案；cps/pei-cdn治疗b16f10荷瘤小鼠的肿瘤体积（b）和（c）相对体重变化（n=7）；cps/pei-cdn与x射线联合治疗荷瘤小鼠的肿瘤体积（d）和（e）体重变化（n=7）；不同剂量的cdn治疗对小鼠肿瘤体积（f）和（g）小鼠体重的影响（n=7）；#表示此后有1只老鼠存活，##表示此后有2只老鼠存活；
图11为3gyx射线与cps/pei-cdn、cdn联合治疗b16f10荷瘤小鼠，开始治疗后小鼠的生存曲线（n=7）；
图12为3gyx射线与cps/pei-cdn、cdn联合治疗b16f10荷瘤小鼠，每只老鼠的肿瘤体积变化图以及完全响应的小鼠数量（n=7）；
图13为使用5gyx射线与cdn或cps/pei-cdn联合治疗b16f10荷瘤小鼠（n=7）。（a）给药方案；（b）第15天的小鼠肿瘤照片；（c）小鼠肿瘤体积变化；（d）小鼠的生存曲线；（e）小鼠的相对体重变化；（f）治愈小鼠对侧接种b16f10细胞后肿瘤的生长情况；（g）单只老鼠的肿瘤体积变化以及完全响应（cr）小鼠数量；
图14为cps/pei-cdn与x射线联合诱导荷b16f10小鼠的特异性的抗肿瘤免疫效应。流式细胞仪分析小鼠tdln中成熟dc的比例（a）及其定量数据统计图（n=4）（b）。（c）肿瘤tme中cd8 t细胞的含量（n=4）。流式细胞术分析tme中巨噬细胞表面cd206受体表达阳性的直方图（d）及其定量数据统计图（n=4）（e）。最后一次给药6h小鼠血清中ifn-β（f）和tnf-α（g）的浓度（n=3）。a-e：在最后一次给药的48h小鼠的tdln或肿瘤分析；
图15为cps/pei-cdn和x射线联合治疗后小鼠肿瘤的组织切片分析。（a）h&e染色图；（b）crt的免疫荧光染色图；（c）cd8 t细胞免疫荧光染色图。标尺：50μm；
图16为荷b16f10黑色素瘤小鼠主要器官的h&e染色图（40´，50μm）。a,b,c,d,e,f:pbs,3gy,cdn20μg,cps/pei-cdn20μg,3gy cdn20μg,3gy cps/pei-cdn20μg,5gy cps/pei-cdn20μg；
图17为一次瘤内注射cps/pei-cy7-amp或自由cy7-amp后小鼠血浆中cy7的浓度随时间的变化（cy7:10μg/只，n=3）。
具体实施方式
高剂量的放疗会造成局部组织损伤等系统毒性，而低剂量又不能有效消除肿瘤；此外，局部放疗诱导的sting信号传导是短暂的，引起的免疫应答不足以消除肿瘤；本发明公开了聚合物囊泡纳米sting激动剂，使用sting激动剂来进一步激活低剂量放疗的肿瘤中apc的sting通路，协同放疗产生的taa和ta，引发特异性cd8 t细胞，调节tme，诱导强大的抗肿瘤免疫应答，刺激细胞因子、t细胞募集因子的分泌，刺激dc成熟和肿瘤抗原的交叉呈递，进而启动抗肿瘤t细胞杀伤作用，增强固有和适应性免疫应答。本发明基于还原敏感可逆交联的聚合物囊泡、使用低毒的低分子量pei（600da、1200da等）和sp为阳离子片段，设计制备了两种内壳带正电的聚合物囊泡用于装载cdn形成囊泡sting激动剂（cps-cdn），探索了其激活sting通路产生抗肿瘤免疫的效果。使用纳米载体递送cdn的策略不仅可以保护cdn免受降解，改变其生物分布；还能促进其被apc有效内吞，提高t细胞应答和抗肿瘤免疫力；还能减少用量，避免高剂量带来的潜在风险。
本发明涉及的原料都是常规产品或者市售产品；具体制备操作以及测试方法都是本领域常规方法。所有数据使用6.01版本的graphpadprism进行分析。使用anova单因素方差分析和t-test来确定每组的显著性差异，生存中期采用kaplan-meier技术进行分析。统计学显著性建立在*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
参见图1，本发明合成和表征了peg-p(tmc-dtc)-pei和peg-p(tmc-dtc)-sp，它们在含有cdn的水相中自组装成具有不对称膜结构的囊泡：较长peg链段（5kda）为囊泡外壳、较短pei或sp为囊泡内壳，内壳与带负电的cdn通过静电相互作用复合，从而得到了高效载cdn的囊泡cps-cdn。
环二核苷酸adu-s100（99.23%）购自mce（masterofsmallmolecules）；cy3标记的线形二核苷酸（cy3-diamp，90%）购自上海生工生物工程。聚乙烯亚胺（pei，mn=0.6kg/mol，99％，sigma）、精胺（sp，mn=0.2kg/mol，99%，sigma）、n，n'-羰基二咪唑（cdi，98%，上海百灵威）购买后直接使用购买后直接使用。小鼠ifn-βelisa检测试剂盒（invivogen）、小鼠tnf-αelisa检测试剂盒（biolegend）按照生产商提供的说明书进行使用。小鼠抗体percp/cy5.5-αcd45、apc-αcd3、fitc-αcd3、apc-αcd80、pe-αcd86、fitc-αcd11c、fitc-αcd11b、apc-αcd206、pe-αf4/80、apc-αfoxp3、pe-αcd4、fitc-αcd8a、pe/cy7-αgr-1均购自biolegend。
核磁共振氢谱（1hnmr）由dd2-600液体超导核磁共振谱仪（安捷伦，美国）在600mhz下测得，以氘代氯仿（cdcl3）为溶剂，化学位移以残留溶剂信号为标准。聚合物囊泡的粒径分布及表面电位通过纳米粒度仪（zetasizernano-zs，马尔文仪器，英国）测定，并配备633nmhe-ne激光器。adu-s100的浓度用nanodrop2000c微量紫外分析仪（thermo，美国）测定。聚合物囊泡的形貌通过tecnaig220型透射电子显微镜（tem，fei，美国）在120kv加速电压下测得。使用bdfacsverse流式细胞仪分析细胞对囊泡的摄取以及经不同制剂刺激后dc细胞的成熟、巨噬细胞表型的转变以及tme中t细胞的激活。激光共聚焦（clsm）图像由leciatcssp5拍摄。使用多功能酶标仪（thermofisherscientific）检测活细胞与mtt生成的甲瓚在570nm处的吸光值，通过定量计算得到细胞的存活率。使用型号为rs2000pro的生物学x射线辐照仪（radsource，美国）对荷瘤小鼠进行局部辐照治疗。
小鼠黑色素瘤细胞系（b16f10）、小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（raw264.7）均从中科院上海库购买。骨髓来源的树突状细胞（bmdc）从6周龄的c57bl/6j雌性小鼠的腿骨和胫骨中获取，并用含10%胎牛血清（fbs，gibco，美国）、1%青-链霉素（基诺生物医学技术公司，中国）以及20ng/ml的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（gm-csf，peprotech，美国）的rpmi-1640培养基（hyclone，美国）于6孔板中培养，48h后更换全部培养基，之后每48h更新一半的培养基，培养至第9天后收集未贴壁以及松散粘附在培养皿上的dc细胞，通过表面cd11c的表达确定表型。b16f10、raw264.7以及dc2.4细胞均用含10
