糖基化ApoJ特异性抗体及其用途的制作方法

糖基化apoj特异性抗体及其用途
技术领域：
：1.本发明属于生物医学领域。特别地涉及与糖基化apoj特异性结合的抗体及其在缺血的诊断和预后中的用途。2.发明背景3.急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction，ami)是动脉粥样硬化血栓形成的最常见临床表现之一，并且表现为全世界死亡和残疾的主要原因之一。由于早期血运重建(revascularization)的重要性和高死亡风险，早期诊断至关重要。在这种情况下，生物标志物成为了重要的工具，以作为临床评估和12导联心电图(electrocardiogram，ecg)的补充来用于具有疑似ami的患者的诊断、分类、风险分层和管理。4.由于蛋白质潜在地直接牵扯到病理学发展的不同阶段，因此蛋白质代表了用于生物标志物搜索的优异靶标。因此，直到现在，大多数建议的心血管疾病(cvd)进展和临床事件表现的生物标志物都是参与疾病发展的不同阶段的蛋白质，例如：脂质代谢(apoai)、炎症(crp)、细胞坏死(肌钙蛋白、ck‑mb和肌红蛋白)或心脏功能(nt‑probnp)等。然而，急性冠脉综合征(acutecoronarysyndrome，acs)的诊断和管理是基于临床评估、心电图结果和肌钙蛋白水平，这是唯一组接受的生物标志物。该方案的应用具有一些局限性，这使得寻找新的生物标志物以改善心肌缺血患者的管理算法必不可少。由于其结构作用，心肌肌钙蛋白(ctn)是不可逆细胞损伤的优异标志物。然而，ctn不能在缺血事件进展至全面坏死之前检测到缺血事件。尽管高灵敏度的ctn测定(hs‑ctn)可以检测到少量的循环ctn，并且该事件被认为与缺血阶段相关，但是最近在mi猪模型中的研究表明，早期ctn升高与肌细胞凋亡相关，这意味着一些类型的细胞死亡是ctn的释放所需的。此外，当前的指南强调需要进行连续的hs‑ctn测量，以对急性胸痛患者进行充分的分类。已经描述了在ami的早期阶段，可以检测到载脂蛋白j(apoj)(也称为簇集素)的糖基化谱的变化。这已经导致将糖基化apoj作为ami的潜在生物标志物的建议(cubedoj.等，journalofproteomeresearch2011；10：211‑20)。5.在这种情况下，鉴定出能够从其初始阶段映射缺血事件的缺血特异性生物标志物对于改善当前急性缺血事件的诊断算法将是至关重要的。技术实现要素：6.本发明的作者出乎意料地发现了用于缺血的诊断和预后以及确定复发性缺血事件风险的新工具，其基于使用针对apoj蛋白中的特定糖基化位点的特异性单克隆抗体对糖基化apoj蛋白的全身水平的确定。出乎意料的是，如本文件的实施例中所示，与特异性识别apoj中存在的n‑聚糖的凝集素相比，靶向apoj中不同糖基化位点的单克隆抗体对于缺血的存在表现出鉴别能力的改善。这些结果是出乎意料的，因为众所周知，对于mab的产生，高度糖基化的蛋白质通常是困难的靶标，其受到不令人满意的亲和力和低特异性的限制。7.因此，在第一方面，本发明涉及特异性结合糖基化apoj但是不结合非糖基化apoj的抗体，其中8.(i)所述抗体特异性识别apoj内包含n‑糖基化位点的表位，并且其中所述糖基化位点包含asn残基，所述asn残基选自相对于ncbi数据库条目中定义的登录号为np_001822.3的apoj前体序列第86、103、145、291、317、354或374位处的asn残基，或9.(ii)所述抗体特异性识别选自seqidno：118、119、120、121、122、123或124的肽或已经使用所述肽来产生，其中所述肽在以下位置的asn残基处用n‑乙酰葡糖胺残基修饰：seqidno：118中的第5位、seqidno：119中的第5位、seqidno：120中的第5位、seqidno：121中的第6位、seqidno：122中的第5位、seqidno：123中的第5位或seqidno：124中的第5位。10.在第二方面，本发明涉及编码本发明的抗体的多核苷酸以及载体和宿主细胞。11.在第三方面，本发明涉及包含至少两种如本发明第一方面所限定的抗体的组合物。12.在第四方面，本发明涉及用于确定样品中糖基化apoj的方法，其包括以下步骤：13.(i)使所述样品与根据本发明第一方面的抗体或与根据本发明第三方面的组合物在足以在抗体与样品中存在的糖基化apoj之间形成复合物的条件下接触，14.(ii)确定步骤(i)中形成的复合物的量。15.在第五方面，本发明涉及用于诊断对象中的缺血或缺血性组织损伤的方法，其包括使用如本发明第一方面所限定的抗体、根据本发明第三方面的组合物或使用如本发明第四方面所限定的方法对所述对象的样品中糖基化apoj的水平进行确定，其中糖基化apoj的水平相对于参考值降低指示所述患者患有缺血或缺血性组织损伤。16.在第六方面，本发明涉及用于预测患有缺血事件的患者中缺血的进展或用于确定患有缺血事件的患者的预后的方法，其包括使用如本发明第一方面所限定的抗体、根据本发明第三方面的组合物或使用如本发明第四方面所限定的方法确定所述患者的样品中糖基化apoj的水平，其中糖基化apoj的水平相对于参考值降低指示所述缺血正在进展或所述患者的预后不良。17.在第七方面，本发明涉及用于确定患有稳定型冠脉疾病的患者患复发性缺血事件的风险的方法，其包括使用如本发明第一方面所限定的抗体、根据本发明第三方面的组合物或使用如本发明第四方面所限定的方法确定所述患者的样品中糖基化apoj的水平，其中糖基化apoj的水平相对于参考值降低指示所述患者表现出患复发性缺血事件的风险升高。18.在第八方面，本发明涉及根据本发明第一方面中任一项的抗体或根据本发明第三方面的组合物用于以下的用途：用于诊断患者中的缺血或缺血性组织损伤，用于确定已经患有缺血事件的患者中缺血的进展，用于已经患有缺血事件的患者的预后，或用于确定患有稳定型冠脉疾病的患者患复发性缺血事件的风险。附图说明19.图1.apoj蛋白序列，示出了信号肽(第1至22位氨基酸)，然后是β(第23至227位氨基酸)和α链(第228至449位氨基酸)。已经开发了针对具有葡糖胺(glcnac)残基的apoj蛋白序列的7个不同n‑糖基化位点(86、103、145、291、317、354和374)的单克隆抗体。20.图2.示意图，示出了用于开发针对七个apoj‑glcnac糖基化位点的特异性单克隆抗体的方法学手段。已经产生了九个克隆，5个靶位点各1个，并且两个靶位点各2个克隆。21.图3.apoj‑glcnac总水平和利用不同mab的检测水平。条形图(平均值±sem)示出了测量的健康对照和ami前缺血患者的血清样品中apoj‑glcnac水平的强度(任意单位(au)的光密度(od))：利用检测总apoj‑glcnac水平的基于凝集素的免疫测定(a)，以及利用靶向每个单独apoj‑glcnac糖基化残基的特异性抗体(b至j)。具体地，利用针对糖基化残基2(克隆ag2g‑17)和6(克隆ag6g‑1)的mab检测apoj‑glcnac，描绘了在早期缺血阶段的ami患者中apoj‑glcnac水平的大幅降低。22.图4：在心脏缺血中测得的apoj‑glcnac水平降低的百分比：在健康对照和ami前缺血患者的血清样品中利用检测总apoj‑glcnac水平(apoj‑glcnac总水平)的基于凝集素的免疫测定以及利用针对每个单独apoj‑glcnac糖基化残基的特异性抗体。23.图5.mab组合的c统计roc分析结果。roc曲线显示了用于检测不同apoj‑glcnac糖基化残基的mab的组合对于检测缺血具有更高的辨识能力。24.图6：靶向glcnac糖基化apoj的特异性抗体ag2g17和ag6g11的斑点印迹结合测定显示了抗体与从人血浆和血清纯化的apoj蛋白结合，但是不结合其他高度糖基化的蛋白质(例如白蛋白和转铁蛋白)的特异性。具体实施方式25.本发明的作者在此公开了用于缺血的诊断和预后的新方法，其基于利用针对apoj中的每个糖基化位点的特异性单克隆抗体来鉴定蛋白质apoj的糖基化模式。26.除非另有定义，否则本文所用的所有技术术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。在此以及在本发明的每个其他方面提供的定义同样适用于整个发明。27.抗体28.在第一方面，本发明涉及特异性结合糖基化apoj但是不结合非糖基化apoj的抗体，其中29.(i)所述抗体特异性识别apoj内包含n‑糖基化位点的表位，并且其中所述糖基化位点包含asn残基，所述asn残基选自相对于ncbi数据库条目中定义的登录号为np_001822.3的apoj前体序列第86、103、145、291、317、354或374位处的asn残基，或30.(ii)所述抗体特异性识别选自seqidno：118、119、120、121、122、123或124的肽或已经使用所述肽来产生，其中所述肽在以下位置的asn残基处用n‑乙酰葡糖胺残基修饰：seqidno：118中的第5位、seqidno：119中的第5位、seqidno：120中的第5位、seqidno：121中的第6位、seqidno：122中的第5位、seqidno：123中的第5位或seqidno：124中的第5位。31.如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，或根据本发明的一些实施方案，具有与分子(“抗原”)的表位特异性结合的能力的免疫球蛋白分子的片段。天然存在的抗体通常包含四聚体，该四聚体通常由至少两条重(h)链和至少两条轻(l)链构成。每条重链包含重链可变结构域(heavychainvariabledomain，本文缩写为vh)和重链恒定结构域，重链恒定结构域通常包含三个结构域(ch1、ch2和ch3)。重链可以是任何同种型，包括igg(igg1、igg2、igg3和igg4亚型)。每条轻链包含轻链可变结构域(本文缩写为vl)和轻链恒定结构域(cl)。轻链包括κ链和λ链。重链和轻链可变结构域通常负责抗原识别，而重链和轻链恒定结构域可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一成分(c1q)。vh和vl结构域可进一步细分为高变结构域，称为“互补决定区”，其间散布有更保守序列的结构，称为“框架区”(fr)。每个vh和vl由三个cdr结构域和四个fr结构域构成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：fr1‑cdr1‑fr2‑cdr2‑fr3‑cdr3‑fr4。重链和轻链的可变结构域包含与抗原相互作用的结合结构域。特别相关的是以下抗体及其表位结合片段：其已被“分离”，因此存在于不同于其在自然界中可存在的生理环境中，或者已被修饰，因为在氨基酸序列方面不同于天然存在的抗体。32.术语“抗体”包括完整单克隆抗体或多克隆抗体，或其保留了一个或更多个cdr区的片段，并且包括人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和非人来源的抗体。[0033]“单克隆抗体”是针对单一位点或抗原“决定簇”的同质、高度特异性的抗体群体。“多克隆抗体”包含针对不同抗原决定簇的异源抗体群体。[0034]在一个具体实施方案中，本发明的抗体为非人来源的抗体，优选为鼠来源的抗体。在一个优选实施方案中，本发明的抗体是单克隆抗体。在另一个具体实施方案中，本发明的抗体是多克隆抗体。[0035]在一个优选实施方案中，本发明的抗体是人‑兔嵌合抗体。在另一个优选实施方案中，人‑兔嵌合抗体包含与人恒定结构域(ck和ch1)连接的兔可变结构域(vλ、vκ和vh)，特别是与人cκ融合的兔vλ/vκ结构域和与人igg1的人ch1融合的兔vh结构域。[0036]众所周知，抗体的基本结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链构成，每对多肽链由轻链(25kda)和重链(50至75kda)构成。每条链的氨基末端区域包含约100至110个或更多个氨基酸的可变区，其参与抗原识别。每条链的羧基末端区域包含介导效应子功能的恒定区。每对轻链和重链的可变区形成抗体的结合位点。因此，完整的抗体具有两个结合位点。轻链分类为k或λ。重链分类为γ、μ、α、δ和ε，并且其分别定义了抗体同种型igg、igm、iga、igd或ige。[0037]每对轻链和重链的可变区形成抗体的结合位点。其特征在于由通过被称为互补决定区(cdr)的三个高变区连接的被称为框架(fr)的相对保守的区域构成的相同一般结构(kabat等，1991，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，5thed.，nihpublicationno.91‑3242，bethesda，md.；chothiaandlesk，1987，jmolbiol196：901‑17)。如本文所用，术语“互补决定区”或“cdr”是指抗体中的区域，该蛋白质在此处与抗原的形状互补。因此，cdr决定了蛋白质对特定抗原的亲和力(大致是结合强度)和特异性。每对的两条链的cdr通过框架区对齐，获得结合特异性表位的功能。因此，重链和轻链二者的特征在于三个cdr，分别为cdrh1、cdrh2、cdrh3，以及cdrl1、cdrl2、cdrl3。[0038]cdr序列可以根据常规标准来确定，例如通过igblast标准：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/(ye等，2013，nucleicacidsres41(webserverissue：w34‑40)，按照kabat等，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，5thed.，publichealthservice，nationalinstitutesofhealth，bethesda，md.(1991)提供的编号，或按照chothia等(1989，nature342：877‑83)提供的编号。[0039]如本文所用，本发明的抗体不仅涵盖了全长抗体(例如，igg)，而且涵盖了其抗原结合片段，例如fab、fab′、f(ab′)2、fv片段、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、非人来源的抗体、重组抗体以及来源于通过基因工程技术产生的免疫球蛋白的多肽，例如单链fv(scfv)、双抗体、重链或其片段、轻链或其片段、vh或其二聚体、vl或其二聚体、通过二硫桥稳定的fv片段(dsfv)、具有单链可变区结构域的分子(abs)、微抗体、scfv‑fc、vl和vh结构域以及包含抗体的融合蛋白，或包含期望特异性抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰的构型。本发明的抗体也可以是双特异性抗体。抗体片段可以指抗原结合片段。[0040]如本文所用，“重组抗体”是包含来源于自两个不同物种或两种不同来源的氨基酸序列的抗体，并且包括合成分子，例如包含非人cdr和人框架或恒定区域的抗体。在某些实施方案中，本发明的重组抗体是由重组dna分子产生的或是合成的。[0041]本领域技术人员将理解，本发明抗体的氨基酸序列可包含一个或更多个氨基酸替换，从而即使改变了多肽的一级序列，但维持了抗体与糖基化apoj结合的能力。所述替换可以是保守替换，并且通常用于指示将一个氨基酸替换为具有相似特性的另一氨基酸(例如，将谷氨酸(带负电荷的氨基酸)替换为天冬氨酸将是保守氨基酸替换)。[0042]考虑了本文所述的抗体的氨基酸序列修饰。例如，可期望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。通过将适当的核苷酸改变引入编码抗体的核酸中或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。这样的修饰包括，例如抗体氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或替换。进行缺失、插入和替换的任何组合来获得最终构建体，只要最终构建体具有期望特性即可。氨基酸变化也可以改变蛋白质的翻译后过程，例如改变糖基化位点的数目或位置。[0043]氨基酸序列插入包括长度从一个残基到包含数百或更多残基的多肽在氨基末端和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有n末端甲硫氨酰基残基的肽或与细胞毒性多肽融合的抗体多肽链。分子的其他插入变体包括与酶或提高其血清半衰期的多肽的n‑或c‑末端融合。[0044]变体的另一种类型是氨基酸替换变体。这些变体的分子中至少一个氨基酸残基被不同的残基替换。抗体的替换诱变(substitutionmutagenesis)最感兴趣的位点包括高变区，但也考虑了fr改变。[0045]抗体的另一种氨基酸变体改变了抗体的原始糖基化模式。改变是指缺失分子中存在的一个或更多个碳水化合物部分，和/或添加分子中不存在的一个或更多个糖基化位点。多肽的糖基化通常是n‑连接的或o‑连接的。n‑连接是指碳水化合物部分连接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺‑x‑丝氨酸和天冬酰胺‑x‑苏氨酸(其中x是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物部分酶促连接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中任一个的存在都会产生潜在的糖基化位点。o‑连接的糖基化是指单糖或单糖衍生物n‑乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种连接至羟基氨基酸，最常见为丝氨酸或苏氨酸，然而也可以使用5‑羟基脯氨酸或5‑羟基赖氨酸。通过改变氨基酸序列以使其包含一个或更多个上述三肽序列(对于n‑连接的糖基化位点)来方便地实现将糖基化位点添加至抗体。也可以通过向原始抗体的序列中添加一个或更多个丝氨酸或苏氨酸残基或通过其替换来进行改变(对于o‑连接的糖基化位点)。通过本领域已知的多种方法来制备编码抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括但不限于从天然来源中分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情况下)或通过对抗体的早期制备的变体或非变体版本进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、pcr诱变和盒诱变来制备。[0046]抗体对抗原的亲和力可以定义为抗体结合这种抗原的效力。抗原‑抗体结合是可逆结合，并且因此，当两种分子在同一溶液中稀释时，在足够的时间后，该溶液达到平衡，其中抗原‑抗体复合物(agab)、游离抗原(ag)和游离抗体(ab)的浓度是常数。因此，比率[agab]/[ag]*[ab]也是常数，定义为缔合常数，其可用于比较一些抗体对其各自表位的亲和力。[0047]测量亲和力的常用方法是通过实验确定结合曲线。这涉及测量作为游离抗原浓度的函数的抗体‑抗原复合物的量。进行这种测量有两种常见方法：(i)使用scatchard分析的经典平衡透析法和(ii)表面等离子共振法，其中抗体或抗原结合到导电表面上，并且抗原或抗体的结合分别影响该表面的电性能。[0048]本发明的抗体与糖基化apoj蛋白结合的能力可以通过本领域可用的许多测定来确定。优选地，通过杂交瘤细胞的克隆产生的单克隆抗体的结合特异性如下来确定：通过免疫沉淀或通过体外结合测定，例如放射免疫测定(ria)、酶联免疫吸附测定(elisa)、表面等离子共振或通过免疫荧光技术例如免疫组织化学(ihc)、荧光显微镜或流式细胞术。[0049]通常，仅需要确定连接相同表位的两种或更多种抗体的相对亲和力，例如在本发明的抗体及其功能变体的情况下。在这种情况下，可以进行竞争性测定，其中将一种抗体的系列稀释液与恒定量的配体一起孵育，然后添加用任何合适的示踪剂标记的二抗。在该mab结合并洗涤未结合的抗体后，测量二抗的浓度并相对于一抗的浓度作图，并用scatchard方法进行分析。实例是tamura等，j.immunol.163：1432‑1441(2000)。[0050]如本文所用，术语“apoj”是指还称为“凝集素”、“睾酮抑制的前列腺信息(testosterone‑repressedprostatemessage)”、“载脂蛋白j”、“补体相关蛋白sp‑40，40”、“补体细胞溶解抑制剂(complementcytolysisinhibitor)”、补体裂解抑制剂”、“硫酸糖蛋白”、“ku70结合蛋白”、“na1/na2”、“trpm‑2”、“kub1”、“cli”。人apoj是uniprotkb/swiss‑prot数据库中的登录号p10909下提供的多肽(2018年9月12日的条目版本212)。[0051]术语“糖基化的”通常是指具有共价连接的寡糖链的任何蛋白质。[0052]如本文所用，术语“糖基化apoj”或“包含glcnac残基的apoj”是指在至少一个聚糖链中包含至少一个n‑乙酰葡糖胺(glcnac)重复的任何apoj分子，然而通常来说，apoj在每个聚糖链中包含至少一个n‑乙酰葡糖胺。在一个实施方案中，糖基化apoj在单个asn残基处包含n‑聚糖，该残基选自相对于ncbi数据库条目中定义的登录号为np_001822.3(2018年9月23日发布)的apoj前原蛋白序列第86、103、145、291、317、354或374位处的asn残基。在一个实施方案中，糖基化apoj在apoj内的每个n‑糖基化位点处都包含n‑聚糖，即在选自相对于ncbi数据库条目中定义的登录号为np_001822.3(2018年9月23日发布)的apoj前原蛋白序列第86、103、145、291、291、317、354和374位处的每个asn残基处。[0053]“包含glcnac残基的apoj”包括在高甘露糖n‑聚糖、复合型n‑聚糖、杂合寡糖n‑聚糖或o‑聚糖中包含至少一个glcnac残基的apoj分子。取决于n‑聚糖的类型，可以发现glcnac直接附着于多肽链或在n‑聚糖的远端位置。[0054]术语“glcnac”或“n‑乙酰葡糖胺”是指由葡糖胺被乙酸酰胺化而形成的葡萄糖衍生物，并且具有以下通式结构：[0055][0056]在一个实施方案中，包含glcnac残基的apoj包含两个glcnac残基，并且在本文中称为(glcnac)2。包含(glcnac)2残基的apoj分子包括其中(glcnac)2存在于高甘露糖n‑聚糖、复合型n‑聚糖、杂合寡糖n‑聚糖或o‑聚糖中的分子。取决于n‑聚糖的类型，可以发现(glcnac)2直接附着于多肽链或在n‑聚糖的远端位置。[0057]在一个优选实施方案中，“包含glcnac残基的apoj”基本上不包含其他类型的n‑连接或o‑连接的碳水化合物。在一个实施方案中，“包含glcnac残基的apoj”不包含n‑连接或o‑连接的α‑甘露糖残基。在另一个实施方案中，“包含glcnac残基的apoj”不包含n‑连接或o‑连接的α‑葡萄糖残基。在另一个实施方案中，“包含glcnac残基的apoj”不包含n‑连接或o‑连接的α‑甘露糖残基或n‑连接或o‑连接的α‑葡萄糖残基。[0058]如本文所用，术语“非糖基化apoj”是指其中相对于ncbi数据库条目中定义的登录号为np_001822.3(2018年9月23日发布)的apoj前原蛋白序列，在apoj多肽中的第86、103、145、291、317、354或374位处的asn残基没有糖基化的。[0059]根据本发明的术语“结合”是指由于非共价键(例如但不限于氢键、疏水相互作用、范德华键、离子键或上述的组合)而导致的亲和结合分子或特异性结合对之间的相互作用。术语“结合对”不涉及除以下外的任何其他技术结构特征的任何特定尺寸：所述结合对可以与结合对的另一个成员相互作用和结合，产生其中通过结合对的第一成员和第二成员之间的特异性相互作用而使第一组分与第二组分彼此结合的缀合物。在本发明的上下文中，结合对包括任何类型的免疫相互作用，例如抗原/抗体、抗原/抗体片段或半抗原/抗半抗原。[0060]术语“特异性地结合”、“特异性结合”或“特异性识别”当在本发明中用于指抗体或其片段与糖基化形式的apoj的结合时，应理解为抗体或其片段与糖基化形式的apoj特异性结合的能力，其通过具有比非特异性结合显著更高亲和力的两种分子的三维结构之间互补性的存在实现，以使得在所述分子中的任一种与反应混合物中存在的其他分子结合之前，优先发生所述抗体或其片段与糖基化形式的apoj之间的结合。这导致抗体或其片段不会与apoj分子中可存在或可不存在的其他聚糖发生交叉反应。抗体或其片段的交叉反应性可以例如通过评估所述抗体或其片段在常规条件下与目的聚糖以及若干或多或少(结构和/或功能上)密切相关的聚糖的结合来评估。仅当抗体或其片段与目的聚糖结合但是不与或者基本上不与任何其他聚糖结合时，才认为对目的聚糖具有特异性。例如，如果抗体与糖基化apoj之间的的结合亲和力的解离常数(kd)小于10‑6m、小于10‑7m、小于10‑8m、小于10‑9m、小于10‑10m、小于10‑11m、小于10‑12m、小于10‑13m、小于10‑14m或小于10‑15m，才认为结合是特异性的。[0061]在一个实施方案中，相对于ncbi数据库条目中定义的登录号为np_001822.3的apoj前体序列，特异性识别包含apoj内第86位的n‑糖基化位点的表位的抗体基本上不与包含apoj内第103、145、291、317、354或374位处的n‑糖基化位点的一个或更多个或任何表位结合。[0062]在一个实施方案中，相对于ncbi数据库条目中定义的登录号为np_001822.3的apoj前体序列，特异性识别包含apoj内第103位的n‑糖基化位点的表位的抗体基本上不与包含apoj内第86、145、291、317、354或374位处的n‑糖基化位点的一个或更多个或任何表位结合。[0063]在一个实施方案中，相对于ncbi数据库条目中定义的登录号为np_001822.3的apoj前体序列，特异性识别包含apoj内第145位的n‑糖基化位点的表位的抗体基本上不与包含apoj内第86、103、291、317、354或374位处的n‑糖基化位点的一个或更多个或任何表位结合。[0064]在一个实施方案中，相对于ncbi数据库条目中定义的登录号为np_001822.3的apoj前体序列，特异性识别包含apoj内第291位的n‑糖基化位点的表位的抗体基本上不与包含apoj内第86、103、145、317、354或374位处的n‑糖基化位点的一个或更多个或任何表位结合。[0065]在一个实施方案中，相对于ncbi数据库条目中定义的登录号为np_001822.3的apoj前体序列，特异性识别包含apoj内第317位的n‑糖基化位点的表位的抗体基本上不与包含apoj内第86、103、145、291、354或374位处的n‑糖基化位点的一个或更多个或任何表位结合。[0066]在一个实施方案中，相对于ncbi数据库条目中定义的登录号为np_001822.3的apoj前体序列，特异性识别包含apoj内第354位的n‑糖基化位点的表位的抗体基本上不与包含apoj内第86、103、145、291、317或374位处的n‑糖基化位点的一个或更多个或任何表位结合。[0067]在一个实施方案中，相对于ncbi数据库条目中定义的登录号为np_001822.3的apoj前体序列，特异性识别包含apoj内第374位的n‑糖基化位点的表位的抗体基本上不与包含apoj内第86、103、145、291、317或354位处的n‑糖基化位点的一个或更多个或任何表位结合。[0068]在一个实施方案中，显示与包含apoj内的n‑糖基化位点的表位特异性结合的根据本发明的抗体基本上不与包含n‑糖基化位点的apoj内的其他表位结合，和/或基本上不与apoj以外的n‑糖基化多肽结合。[0069]在另一个实施方案中，特异性识别在第5位的asn残基处用n‑乙酰葡糖胺残基修饰的seqidno：118的肽的抗体基本上不识别seqidno：119、120、121、122、123或124的肽中的一个、更多个或任一个，其中所述肽在seqidno：119的第5位、seqidno：120的第5位、seqidno：121的第6位、seqidno：122的第5位、seqidno：123的第5位或seqidno：124的第5位的asn残基处用n‑乙酰葡糖胺残基修饰。[0070]在另一个实施方案中，特异性识别在第5位的asn残基处用n‑乙酰葡糖胺残基修饰的seqidno：119的肽的抗体基本上不识别seqidno：118、120、121、122、123或124的肽中的一个、更多个或任一个，其中所述肽在seqidno：118的第5位、seqidno：120的第5位、seqidno：121的第6位、seqidno：122的第5位、seqidno：123的第5位或seqidno：124的第5位的asn残基处用n‑乙酰葡糖胺残基修饰。[0071]在另一个实施方案中，特异性识别在第5位的asn残基处用n‑乙酰葡糖胺残基修饰的seqidno：120的肽的抗体基本上不识别seqidno：118、119、121、122、123或124的肽中的一个、更多个或任一个，其中所述肽在seqidno：118的第5位、seqidno：119的第5位、seqidno：121的第6位、seqidno：122的第5位、seqidno：123的第5位或seqidno：124的第5位的asn残基处用n‑乙酰葡糖胺残基修饰。[0072]在另一个实施方案中，特异性识别在第5位的asn残基处用n‑乙酰葡糖胺残基修饰的seqidno：121的肽的抗体基本上不识别seqidno：118、119、120、122、123或124的肽中的一个、更多个或任一个，其中所述肽在seqidno：118的第5位、seqidno：119的第5位、seqidno：120的第5位、seqidno：122的第5位、seqidno：123的第5位或seqidno：124的第5位的asn残基处用n‑乙酰葡糖胺残基修饰。[0073]在另一个实施方案中，特异性识别在第5位的asn残基处用n‑乙酰葡糖胺残基修饰的seqidno：122的肽的抗体基本上不识别seqidno：118、119、120、121、123或124的肽中的一个、更多个或任一个，其中所述肽在seqidno：118的第5位、seqidno：119的第5位、seqidno：120的第5位、seqidno：121的第6位、seqidno：123的第5位或seqidno：124的第5位的asn残基处用n‑乙酰葡糖胺残基修饰。[0074]在另一个实施方案中，特异性识别在第5位的asn残基处用n‑乙酰葡糖胺残基修饰的seqidno：123的肽的抗体基本上不识别seqidno：118、119、120、121、122或124的肽中的一个、更多个或任一个，其中所述肽在seqidno：118的第5位、seqidno：119的第5位、seqidno：120的第5位、seqidno：121的第6位、seqidno：122的第5位或seqidno：124的第5位的asn残基处用n‑乙酰葡糖胺残基修饰。[0075]在另一个实施方案中，已经使用seqidno：118的肽产生的抗体，其中所述肽在seqidno：118的5位用n‑乙酰葡糖胺残基修饰，则所述抗体基本上不识别119、120、121、122或124的肽中的一个、更多个或任一个，其中所述肽在seqidno：119的第5位、seqidno：120的第5位、seqidno：121的第6位、seqidno：122的第5位、seqidno：123的第5位或seqidno：124的第5位的asn残基处用n‑乙酰葡糖胺残基修饰。[0076]在另一个实施方案中，已经使用seqidno：119的肽产生的抗体，其中所述肽在seqidno：119的5位用n‑乙酰葡糖胺残基修饰，则所述抗体基本上不识别118、120、121、122或124的肽中的一个、更多个或任一个，其中所述肽在seqidno：118的第5位、seqidno：120的第5位、seqidno：121的第6位、seqidno：122的第5位、seqidno：123的第5位或seqidno：124的第5位的asn残基处用n‑乙酰葡糖胺残基修饰。[0077]在另一个实施方案中，已经使用seqidno：120的肽产生的抗体，其中所述肽在seqidno：120的5位用n‑乙酰葡糖胺残基修饰，则所述抗体基本上不识别118、119、121、122或124的肽中的一个、更多个或任一个，其中所述肽在seqidno：118的第5位、seqidno：119的第5位、seqidno：121的第6位、seqidno：122的第5位、seqidno：123的第5位或seqidno：124的第5位的asn残基处用n‑乙酰葡糖胺残基修饰。[0078]在另一个实施方案中，已经使用seqidno：121的肽产生的抗体，其中所述肽在seqidno：121的5位用n‑乙酰葡糖胺残基修饰，则所述抗体基本上不识别118、119、120、122或124的肽中的一个、更多个或任一个，其中所述肽在seqidno：118的第5位、seqidno：119的第5位、seqidno：120的第5位、seqidno：122的第5位、seqidno：123的第5位或seqidno：124的第5位的asn残基处用n‑乙酰葡糖胺残基修饰。[0079]在另一个实施方案中，已经使用seqidno：122的肽产生的抗体，其中所述肽在seqidno：122的5位用n‑乙酰葡糖胺残基修饰，则所述抗体基本上不识别118、119、120、121或124的肽中的一个、更多个或任一个，其中所述肽在seqidno：118的第5位、seqidno：119的第5位、seqidno：120的第5位、seqidno：121的第6位、seqidno：123的第5位或seqidno：124的第5位的asn残基处用n‑乙酰葡糖胺残基修饰。[0080]在另一个实施方案中，已经使用seqidno：123的肽产生的抗体，其中所述肽在seqidno：123的5位用n‑乙酰葡糖胺残基修饰，则所述抗体基本上不识别118、119、120、122或124的肽中的一个、更多个或任一个，其中所述肽在seqidno：118的第5位、seqidno：119的第5位、seqidno：120的第5位、seqidno：121的第6位、seqidno：122的第5位或seqidno：124的第5位的asn残基处用n‑乙酰葡糖胺残基修饰。[0081]在另一个实施方案中，已经使用seqidno：124的肽产生的抗体，其中所述肽在seqidno：124的5位用n‑乙酰葡糖胺残基修饰，则所述抗体基本上不识别118、119、120、122或123的肽中的一个、更多个或任一个，其中所述肽在seqidno：118的第5位、seqidno：119的第5位、seqidno：120的第5位、seqidno：121的第6位、seqidno：122的第5位或seqidno：123的第5位的asn残基处用n‑乙酰葡糖胺残基修饰。[0082]在另一个实施方案中，根据本发明的抗体基本上不结合o‑连接的聚糖，更优选地o‑连接的glanac。[0083]在另一些实施方案中，抗体特异性识别包含apoj内的n‑糖基化位点的表位，并且其中所述糖基化位点包含选自相对于ncbi数据库条目中定义的登录号为np_001822.3的apoj前体序列第86、103、145、291、317、354或374位处的asn残基的asn残基，则该抗体发明基本上不结合o‑连接的聚糖，更优选地o‑连接的glanac。[0084]在另一些实施方案中，抗体特异性识别选自seqidno：118、119、120、121、122、123或124的肽或已经使用所述肽来产生，其中所述肽在以下位置的asn残基处用n‑乙酰葡糖胺残基修饰：seqidno：118中的第5位、seqidno：119中的第5位、seqidno：120中的第5位、seqidno：121中的第6位、seqidno：122中的第5位、seqidno：123中的第5位或seqidno：124中的第5位，则该抗体发明基本上不结合o‑连接的聚糖，更优选地o‑连接的glanac。[0085]在另一个实施方案中，根据本发明的抗体基本上不结合n‑乙酰半乳糖胺或包含n‑乙酰半乳糖胺而不是n‑乙酰葡糖胺的表位。[0086]在另一些实施方案中，抗体特异性识别包含apoj内的n‑糖基化位点的表位，并且其中所述糖基化位点包含选自相对于ncbi数据库条目中定义的登录号为np_001822.3的apoj前体序列第86、103、145、291、317、354或374位处的asn残基的asn残基，则该抗体发明基本上不结合n‑乙酰半乳糖胺或包含n‑乙酰半乳糖胺而不是n‑乙酰葡糖胺的表位。[0087]在另一些实施方案中，抗体特异性识别选自seqidno：118、119、120、121、122、123或124的肽或已经使用所述肽来产生，其中所述肽在以下位置的asn残基处用n‑乙酰葡糖胺残基修饰：seqidno：118中的第5位、seqidno：119中的第5位、seqidno：120中的第5位、seqidno：121中的第6位、seqidno：122中的第5位、seqidno：123中的第5位或seqidno：124中的第5位，则该抗体发明基本上结合n‑乙酰半乳糖胺或包含n‑乙酰半乳糖胺而不是n‑乙酰葡糖胺的表位。[0088]在另一个实施方案中，根据本发明的抗体基本上不结合包含seqidno：167(tklkelpgvcnetmmalwee)的序列的表位，其中所述表位在第11位包含n‑糖基化。[0089]在另一个实施方案中，相对于ncbi数据库条目中定义的登录号为np_001822.3的apoj前体序列，特异性识别包含apoj内第103位的n‑糖基化位点的表位的根据本发明的抗体发明基本上不结合包含seqidno：167的序列的表位，其中所述表位在第11位包含n‑糖基化。[0090]在另外一些实施方案中，抗体特异性识别seqidno：119的肽或已经使用所述肽来产生，其中所述肽在seqidno：119的第5位的asn残基处用n‑乙酰葡糖胺残基修饰，则所述抗体基本上不结合包含seqidno：167的序列的表位，其中所述表位在第11位包含n‑糖基化。[0091]本发明的结合剂、特别是如本文所述的抗体或抗体片段与糖基化apoj蛋白结合的能力可以通过本领域众公知的许多测定来确定。优选地，结合剂的结合能力通过免疫沉淀或通过体外结合测定，例如放射免疫测定(ria)、酶联免疫吸附测定(elisa)、表面等离子共振或通过免疫荧光技术例如免疫组织化学法(ihc)、荧光显微镜或流式细胞术来确定。[0092]在一个优选实施方案中，本发明的抗体与糖基化apoj特异性结合，所述糖基化apoj是包含n‑乙酰葡糖胺(glcnac)残基的糖基化apoj，或者包含n‑乙酰葡糖胺(glcnac)残基和唾液酸残基的糖基化apoj。[0093]如本文所述，术语“包含glcnac和唾液酸残基的apoj”是指在其聚糖链中包含至少一个n‑乙酰基‑葡萄糖重复和至少一个唾液酸残基的重复的任何apoj分子。[0094]如本文所用，术语“唾液酸”是指被称为n‑乙酰神经氨酸(neu5ac)且具有以下一般结构的单糖。[0095][0096]在一个实施方案中，apoj包含两个glcnac残基和一个唾液酸残基(下文称为(glcnac)2‑neu5ac)。在另一个实施方案中，glcnac和唾液酸残基通过一个或更多个单糖连接。在一个实施方案中，包含n‑乙酰葡糖胺(glcnac)和唾液酸残基的糖基化apoj的水平对应于能够与栽培小麦(triticumvulgaris)凝集素特异性结合的apoj水平。[0097]在一个优选实施方案中，“包含glcnac残基和唾液酸残基的apoj”基本上不包含其他类型的n‑连接或o‑连接的碳水化合物。在一个实施方案中，“包含glcnac和唾液酸残基的apoj”不包含n‑连接或o‑连接的α‑甘露糖残基。在另一个实施方案中，“包含glcnac和唾液酸残基的apoj”不包含n‑连接或o‑连接的α‑葡萄糖残基。在另一个实施方案中，“包含glcnac和唾液酸残基的apoj”不包含n‑连接或o‑连接的α‑甘露糖残基或n‑连接或o‑连接的α‑葡萄糖残基。[0098]本发明的抗体特异性识别包含apoj内的n‑糖基化位点的表位，并且所述糖基化位点包含选自相对于ncbi数据库条目中定义的登录号为np_001822.3(2018年9月23日发布)的apoj前原蛋白序列第86、103、145、291、317、354或374位处的asn残基。[0099]如本文所用，术语“表位”是指给定免疫原性物质的一部分，该部分是宿主免疫系统的抗体或细胞表面受体的靶标或被其结合，所述宿主免疫系统引起针对给定免疫原性物质的免疫应答，如通过本领域已知的任何方法确定的。此外，表位可以定义为在动物中引起抗体应答或诱导t细胞应答的免疫原性物质的一部分，如通过本领域可用的任何方法所确定的。参见walkerj，编，″theproteinprotocolshandbook″(humanapress，inc.，totoma，nj，us，1996)。术语“表位”也可以与“抗原决定簇”或“抗原决定簇位点”互换使用。蛋白质抗原的表位根据其结构和与抗体的相互作用分为构象表位和线性表位两类。[0100]asn残基是指多肽序列内的天冬酰胺氨基酸。在本实施方案中，糖基化连接至asn残基，所述糖基化也称为asn‑连接的糖基化或n‑连接的糖基化，并且当糖残基通过天冬酰胺残基的酰胺氮连接时发生。asn连接的寡糖的细胞内生物合成发生在内质网腔中和蛋白质向高尔基体转运之后。asn连接的糖基化发生在以下三肽糖基化共有序列处：asn‑xaa‑yaa(asn‑xaa‑thr/ser；nxt/s)，其中xaa可以是脯氨酸以外的任何氨基酸，并且yaa是丝氨酸或苏氨酸。[0101]所有asn连接的寡糖具有来源于共同生物合成中间体的共同五糖核心(man3glcnac2)。其区别在于分支数目和外围糖如岩藻糖和唾液酸的存在。其可以根据分支成分进行分类，其可以仅由甘露糖组成(高甘露糖n‑聚糖)；交替的gicnac和gal残基，末端是多种糖序列，并且具有二等分的fuc和核心glcnac的链内替换的可能性(复合型n‑聚糖)；或高甘露糖和复杂链(杂合n‑聚糖)的属性。参见hounsell，e.f编，“glycoproteinanalysisinbiomedicine，”methodsinmolecularbiology14：298(1993)。[0102]或者，本发明的抗体特异性识别选自seqidno：118、119、120、121、122、123或124的肽或已经使用所述肽来产生，其中所述肽在以下位置的asn残基处用n‑乙酰葡糖胺残基修饰：seqidno：118中的第5位、seqidno：119中的第5位、seqidno：120中的第5位、seqidno：121中的第6位、seqidno：122中的第5位、seqidno：123中的第5位或seqidno：124中的第5位。[0103]术语“多肽”和“肽”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物。[0104]术语“氨基酸”是指天然存在的和合成氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。此外，术语“氨基酸”包括d‑和l‑氨基酸(立体异构体)。[0105]在一个优选实施方案中，本发明的抗体包含：[0106]a)轻链互补决定区1(vl‑cdr1)，其包含seqidno：1、6、11、16、21、26、31、36、41中任一个所示的氨基酸序列或其功能等同变体；[0107]b)轻链互补决定区2(vl‑cdr2)，其包含氨基酸序列qas、kas、ras、sas、das中的任一个所示的氨基酸序列或其功能等同变体；[0108]c)轻链互补决定区3(vl‑cdr3)，其包含seqidno：2、7、12、17、22、27、32、37、42中任一个所示的氨基酸序列或其功能等同变体；[0109]d)重链互补决定区1(vh‑cdr1)，其包含seqidno：3、8、13、18、23、28、33、38、43中任一个所示的氨基酸序列或其功能等同变体；[0110]e)重链互补决定区2(vh‑cdr2)，其包含seqidno：4、9、14、19、24、29、34、39、44中任一个所示的氨基酸序列或其功能等同变体；或[0111]f)重链互补决定区3(vh‑cdr3)，其包含seqidno：5、10、15、20、25、30、35、40、45中任一个所示的氨基酸序列或其功能等同变体。[0112]如本文所用，术语“互补决定区”或“cdr”是指抗体中的区域，该蛋白质在此处与抗原的形状互补。因此，cdr决定了蛋白质对特定抗原的亲和力(大致是结合强度)和特异性。每对的两条链的cdr通过框架区对齐，获得结合特异性表位的功能。因此，重链和轻链二者的特征在于三个cdr，分别为vh‑cdr1、vh‑cdr2、vh‑cdr3，以及vl‑cdr1、vl‑cdr2、vl‑cdr3。[0113]如本文所用，术语cdr序列的功能等同变体”是指特定cdr序列的序列变体，其与之具有基本上相似的序列同一性，并且作为如本文所述的抗体或抗体片段的一部分时，基本上保持了其与其同源抗体结合的能力。例如，cdr序列的功能等同变体可以是包含一个或更多个氨基酸的添加、缺失或替换的所述序列的多肽序列衍生物。[0114]根据本发明的cdr序列的功能等同变体包含与以上参考序列之一所示的相应氨基酸序列具有至少约70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的cdr序列。还预期了cdr序列的功能等同变体包含由以上参考序列之一所示的相应氨基酸序列的n末端处、或c末端处、或n末端和c末端二者处的至少1个氨基酸、或至少2个氨基酸、或至少3个氨基酸、或至少4个氨基酸、或至少5个氨基酸、或至少6个氨基酸、或至少7个氨基酸、或至少8个氨基酸、或至少9个氨基酸、或至少10个氨基酸或更多个氨基酸组成的添加。同样地，还预期变体包含由以上参考序列之一所示的相应氨基酸序列的n末端处、或c末端处、或n末端和c末端二者处的至少1个氨基酸、或至少2个氨基酸、或至少3个氨基酸、或至少4个氨基酸、或至少5个氨基酸、或至少6个氨基酸、或至少7个氨基酸、或至少8个氨基酸、或至少9个氨基酸、或至少10个氨基酸或更多个氨基酸组成的缺失。[0115]根据本发明的cdr序列的功能等同变体优选将保持seqidno：1至45中任一个所示的相应氨基酸序列或轻链cdr2序列qas、kas、ras、sas和das中的任一个在作为如本发明的抗体或抗体片段的一部分时与同源抗原结合的能力的至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少100％、至少105％、至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％、至少150％、至少200％或更多。这种与其同源抗原结合的能力可以测定为抗体或抗体片段对其同源抗原的亲和力、亲合力、特异性和/或选择性的值。[0116]在另一个优选实施方案中，本发明的抗体的特征在于：[0117](i)vl‑cdr1包含seqidno：6所示的氨基酸序列，vl‑cdr2包含氨基酸序列kas并且vl‑cdr3包含seqidno：7所示的氨基酸序列，[0118](ii)vl‑cdr1包含seqidno：1所示的氨基酸序列，vl‑cdr2包含氨基酸序列qas并且vl‑cdr3包含seqidno：2所示的氨基酸序列，[0119](iii)vl‑cdr1包含seqidno：11所示的氨基酸序列，vl‑cdr2包含氨基酸序列ras并且vl‑cdr3包含seqidno：12所示的氨基酸序列，[0120](iv)vl‑cdr1包含seqidno：16所示的氨基酸序列，vl‑cdr2包含氨基酸序列qas并且vl‑cdr3包含seqidno：17所示的氨基酸序列，[0121](v)vl‑cdr1包含seqidno：21所示的氨基酸序列，vl‑cdr2包含氨基酸序列sas并且vl‑cdr3包含seqidno：22所示的氨基酸序列，[0122](vi)vl‑cdr1包含seqidno：26所示的氨基酸序列，vl‑cdr2包含氨基酸序列das并且vl‑cdr3包含seqidno：27所示的氨基酸序列，[0123](vii)vl‑cdr1包含seqidno：31所示的氨基酸序列，vl‑cdr2包含氨基酸序列sas并且vl‑cdr3包含seqidno：32所示的氨基酸序列，[0124](viii)vl‑cdr1包含seqidno：36所示的氨基酸序列，vl‑cdr2包含氨基酸序列kas并且vl‑cdr3包含seqidno：37所示的氨基酸序列，[0125](ix)vl‑cdr1包含seqidno：41所示的氨基酸序列，vl‑cdr2包含氨基酸序列kas并且vl‑cdr3包含seqidno：42所示的氨基酸序列，[0126](x)vh‑cdr1包含seqidno：8所示的氨基酸序列，vh‑cdr2包含seqidno：9所示的氨基酸序列并且vh‑cdr3包含seqidno：10所示的氨基酸序列，[0127](xi)vh‑cdr1包含seqidno：3所示的氨基酸序列，vh‑cdr2包含seqidno：4所示的氨基酸序列并且vh‑cdr3包含seqidno：5所示的氨基酸序列，[0128](xii)vh‑cdr1包含seqidno：13所示的氨基酸序列，vh‑cdr2包含seqidno：14所示的氨基酸序列并且vh‑cdr3包含seqidno：15所示的氨基酸序列，[0129](xiii)vh‑cdr1包含seqidno：18所示的氨基酸序列，vh‑cdr2包含seqidno：19所示的氨基酸序列并且vh‑cdr3包含seqidno：20所示的氨基酸序列，[0130](xiv)vh‑cdr1包含seqidno：23所示的氨基酸序列，vh‑cdr2包含seqidno：24所示的氨基酸序列并且vh‑cdr3包含seqidno：25所示的氨基酸序列，[0131](xv)vh‑cdr1包含seqidno：28所示的氨基酸序列，vh‑cdr2包含seqidno：29所示的氨基酸序列并且vh‑cdr3包含seqidno：30所示的氨基酸序列，[0132](xvi)vh‑cdr1包含seqidno：33所示的氨基酸序列，vh‑cdr2包含seqidno：34所示的氨基酸序列并且vh‑cdr3包含seqidno：35所示的氨基酸序列，[0133](xvii)vh‑cdr1包含seqidno：38所示的氨基酸序列，vh‑cdr2包含seqidno：39所示的氨基酸序列并且vh‑cdr3包含seqidno：40所示的氨基酸序列，或者[0134](xviii)vh‑cdr1包含seqidno：43所示的氨基酸序列，vh‑cdr2包含seqidno：44所示的氨基酸序列并且vh‑cdr3包含seqidno：45所示的氨基酸序列。[0135]在另一个实施方案中，上述抗体的特征在于：[0136](i)vl‑cdr1包含seqidno：6所示的氨基酸序列，vl‑cdr2包含氨基酸序列kas，vl‑cdr3包含seqidno：7所示的氨基酸序列，vh‑cdr1包含seqidno：8所示的氨基酸序列，vh‑cdr2包含seqidno：9所示的氨基酸序列并且vh‑cdr3包含seqidno：10所示的氨基酸序列，[0137](ii)vl‑cdr1包含seqidno：1所示的氨基酸序列，vl‑cdr2包含氨基酸序列qas，vl‑cdr3包含seqidno：2所示的氨基酸序列，vh‑cdr1包含seqidno：3所示的氨基酸序列，vh‑cdr2包含seqidno：4所示的氨基酸序列并且vh‑cdr3包含seqidno：5所示的氨基酸序列，[0138](iii)vl‑cdr1包含seqidno：11所示的氨基酸序列，vl‑cdr2包含氨基酸序列ras，其中vl‑cdr3包含seqidno：12所示的氨基酸序列，vh‑cdr1包含seqidno：13所示的氨基酸序列，vh‑cdr2包含seqidno：14所示的氨基酸序列并且vh‑cdr3包含seqidno：15所示的氨基酸序列，[0139](iv)vl‑cdr1包含seqidno：16所示的氨基酸序列，vl‑cdr2包含氨基酸序列qas，vl‑cdr3包含seqidno：17所示的氨基酸序列，vh‑cdr1包含seqidno：18所示的氨基酸序列，vh‑cdr2包含seqidno：19所示的氨基酸序列并且vh‑cdr3包含seqidno：20所示的氨基酸序列，[0140](v)vl‑cdr1包含seqidno：21所示的氨基酸序列，vl‑cdr2包含氨基酸序列sas，vl‑cdr3包含seqidno：22所示的氨基酸序列，vh‑cdr1包含seqidno：23所示的氨基酸序列，vh‑cdr2包含seqidno：24所示的氨基酸序列并且vh‑cdr3包含seqidno：25所示的氨基酸序列，[0141](vi)vl‑cdr1包含seqidno：26所示的氨基酸序列，vl‑cdr2包含氨基酸序列das，vl‑cdr3包含seqidno：27所示的氨基酸序列，vh‑cdr1包含seqidno：28所示的氨基酸序列，vh‑cdr2包含seqidno：29所示的氨基酸序列并且vh‑cdr3包含seqidno：30所示的氨基酸序列，[0142](vii)vl‑cdr1包含seqidno：31所示的氨基酸序列，vl‑cdr2包含氨基酸序列sas，vl‑cdr3包含seqidno：32所示的氨基酸序列，vh‑cdr1包含seqidno：33所示的氨基酸序列，vh‑cdr2包含seqidno：34所示的氨基酸序列并且vh‑cdr3包含seqidno：35所示的氨基酸序列，[0143](viii)vl‑cdr1包含seqidno：36所示的氨基酸序列，vl‑cdr2包含氨基酸序列kas，vl‑cdr3包含seqidno：37所示的氨基酸序列，vh‑cdr1包含seqidno：38所示的氨基酸序列，vh‑cdr2包含seqidno：39所示的氨基酸序列并且vh‑cdr3包含seqidno：40所示的氨基酸序列，[0144](ix)vl‑cdr1包含seqidno：41所示的氨基酸序列，vl‑cdr2包含氨基酸序列kas，vl‑cdr3包含seqidno：42所示的氨基酸序列，vh‑cdr1包含seqidno：43所示的氨基酸序列，vh‑cdr2包含seqidno：44所示的氨基酸序列并且vh‑cdr3包含seqidno：45所示的氨基酸序列。[0145]在另一个实施方案中，本发明的抗体的特征在于：[0146](i)轻链框架1(vl‑fr1)区氨基酸序列与seqidno：46、54、62、70、78、86、94、102或110中任一个所示的氨基酸序列具有至少90％同一性，[0147](ii)轻链框架2(vl‑fr2)区氨基酸序列与seqidno：47、55、63、71、79、87、95、103或111中任一个所示的氨基酸序列具有至少90％同一性，[0148](iii)轻链框架3(vl‑fr3)区氨基酸序列与seqidno：48、56、64、72、80、88、96、104或112中任一个所示的氨基酸序列具有至少90％同一性，以及[0149](iv)轻链框架4(vl‑fr4)区氨基酸序列与seqidno：49、57、65、73、81、89、97、105或113中任一个所示的氨基酸序列具有至少90％同一性。[0150]在另一个实施方案中，本发明的抗体还包含一个或更多个：[0151](i)重链框架1(vh‑fr1)区氨基酸序列，其与seqidno：50、58、66、74、82、90、98、106或114中任一个所示的氨基酸序列具有至少90％同一性，[0152](ii)重链框架2(vh‑fr2)区氨基酸序列，其与seqidno：51、59、67、75、83、91、99、107或115中任一个所示的氨基酸序列具有至少90％的同一性，[0153](iii)重链框架3(vh‑fr3)区氨基酸序列，其与seqidno：52、60、68、76、84、92、100、108或116中任一个所示的氨基酸序列具有至少90％同一性，以及[0154](iv)重链框架4(vh‑fr4)区氨基酸序列，其与seqidno：53、61、69、77、85、93、101、109或117中任一个所示的氨基酸序列具有至少90％同一性。[0155]在另一个实施方案中，本发明的抗体是ag1g‑11、ag2g‑17、ag3g‑4、ag4g‑6、ag5g‑17、ag6g‑1、ag6g‑11、ag7g‑17或ag7g‑19抗体，其中每种抗体各自的vl‑fr1、vl‑cdr1、vl‑fr2、vl‑cdr2、vl‑fr3、vl‑cdr3、vl‑fr4、vh‑fr1、vh‑cdr1、vh‑fr2、vh‑cdr2、vh‑fr3、vh‑cdr3和vh‑fr4区包含表1中所示的氨基酸序列。[0156]表1.每种抗体中不同cdr与框架区之间的对应关系及其在本文中引用的seqidno。[0157][0158][0159][0160][0161][0162][0163][0164][0165][0166]在另一个优选实施方案中，根据本发明的抗体包含：[0167]i)由seqidno：125、126、127、128、129、130、131、132或133中任一个所示的氨基酸序列限定的轻链，和/或[0168]ii)由seqidno：134、135、136、137、138、139、140、141或142中任一个所示的氨基酸序列限定的重链。[0169]在另一个实施方案中，本发明任一项的抗体包含至少一个来源于人抗体框架区的框架区，其是人源化或超人源化的。[0170]“人源化”意指来源于非人抗体的抗体，典型地为鼠抗体，其保留了亲本抗体的抗原结合特性，但在人中的免疫原性较低。这可通过多种方法实现，包括：(a)将整个非人可变结构域接枝到人恒定区上以产生嵌合抗体；(b)仅将非人互补决定区(cdr)接枝到人框架区和恒定区中，保留或不保留关键框架残基；以及(c)迁移整个非人可变结构域，但通过替代表面残基用类人部分“掩蔽”它们。本领域中已描述了用于使非人抗体人源化的方法。优选地，人源化抗体具有从非人来源引入其的一个或更多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“导入”残基，其通常取自“导入”可变结构域。[0171]人源化可基本上按照winter和同事的方法(jones等，nature，321：522‑525(1986)；reichmann等，nature，332：323‑327(1988)；verhoeyen等，science，239：1534‑1536(1988))，通过将高变区序列替换为人抗体的相应序列来进行。在实践中，人源化抗体通常是其中一些高变区残基以及可能地一些框架区(fr)残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基替换的人抗体。用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链二者)的选择对于降低免疫原性保留对抗原的特异性和亲和力非常重要。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知的人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域的序列。然后，将最接近啮齿动物序列的人序列作为人源化抗体的人框架区(fr)接受(suns等，j.immunol，151：2296(1993)；chothia等，j.mol.biol，196：901(1987))。另一种方法使用来源于轻链或重链特定亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架区。相同的框架可用于数种不同的人源化抗体(carter等，proc.natl.acad.sci.usa，89：4285(1992)；presta等，j.immunol，151：2623(1993))。[0172]更重要的是抗体是人源化的并保留了对抗原的高亲和力和其他有利生物学特性。为了实现该目标，通过使用亲本和人源化序列的三维模型对亲本序列和多种概念性人源化产物进行分析的过程来制备人源化抗体。在该方法中，使抗体更类似于人的另一个步骤是制备所谓的灵长类化抗体，即已被改造以包含猴(或其他灵长类)抗体，特别是食蟹猴抗体的可变重链结构域和可变轻链结构域的重组抗体，并且其包含人恒定结构域序列，优选人免疫球蛋白γ1或γ4恒定结构域(或pe变体)。[0173]“人抗体”意指完全包含人轻链和重链以及恒定区的抗体，其通过任何已知的标准方法产生。[0174]作为人源化的替代方案可产生人抗体。例如，现在可产生能够在不存在内源性免疫球蛋白产生的情况下在免疫接种后产生完整的人抗体储库的转基因动物(例如小鼠)。例如，已描述了在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区ph基因的纯合缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。在这样的种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在免疫接种之后产生人抗体。参见，例如jakobovits等，proc.mad.acad.sci.usa，90：2551(1993)；jakobovits等，nature，362：255‑258(1993)，lonberg，2005，naturebiotech.23：1117‑25。[0175]人抗体也可由体外活化的b细胞或scid小鼠产生，其免疫系统由人细胞重构。[0176]一旦获得人抗体，其编码dna序列可被分离、克隆并引入到合适的表达体系(即细胞系，优选来自哺乳动物)中，随后表达并将其释放到可从中分离抗体的培养基中。[0177]在另一个优选实施方案中，本发明的抗体是fab、f(ab)2、单结构域抗体、单链可变片段(scfv)或纳米抗体。[0178]fab、f(ab)2、单结构域抗体、单链可变片段(scfv)和纳米抗体被认为是表位结合抗体片段。[0179]抗体片段是抗体的片段，例如如fab、f(ab’)2、fab’和scfv。已开发了用于产生抗体片段的多种技术。传统上，这些片段是通过完整抗体的蛋白水解消化获得的，但是最近这些片段可由重组宿主细胞直接产生。在另一些实施方案中，选择的抗体是单链fv(scfv)片段，其另外可以是单特异性或双特异性的。[0180]木瓜蛋白酶消化抗体产生两种相同的抗原结合片段，称为“fab”片段，每个具有单抗原结合位点以及残留的“fc”片段，其名称反映了其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并且仍能够交联抗原的f(ab’)2片段。[0181]“fv”是包含完整的抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密非共价缔合的一个重链变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。正是在这种构型中，每个可变结构域的三个高变区相互作用以在vh‑vl二聚体的表面上限定抗原结合位点。六个高变区共同对抗体赋予抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或者仅包含对抗原具有特异性的三个高变区的fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于整个结合位点。[0182]fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(chi)。fab’片段与fab片段的不同之处在于，在重链ch1结构域的羧基末端添加了一些残基，包括来自抗体铰链区的一个或更多个半胱氨酸。fab’‑sh是本文中对fab’的命名，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有至少一个游离巯基。f(ab’)z抗体片段最初是作为fab’片段对产生的，它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。[0183]术语“单结构域抗体”是指其互补决定区是单结构域多肽的一部分的抗体。一些实例包括但不限于重链抗体(纳米抗体)、天然缺乏轻链的抗体、来源于常规4链抗体的单结构域抗体、经改造的抗体和除来源于抗体的那些之外的单结构域支架。单结构域抗体可以是本领域的任何抗体，或者是任何未来的单结构域抗体。单结构域抗体可来源于任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、美洲驼、山羊、兔、牛。[0184]“单链fv”或“scfv”抗体片段包含抗体的vh和vl结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。优选地，fv多肽还包含vh与vl结构域之间的多肽接头，其使得scfv能够形成抗原结合所期望的结构。有关scfv的综述，参见pluckthuninthepharmacologyofmonoclonalantibodies，第113卷，rosenburg和moore编辑，springer‑verlag，n.y.，第269至315页(1994)。[0185]更优选地，尽管fv片段的两个结构域vl和vh是由单独的基因，或编码这样的基因序列的多核苷酸(例如，其编码cdna)天然编码的，但是可使用重组方法通过能够使其制成单条蛋白链的柔性接头连接，其中vl和vh区缔合以形成单价表位结合分子(称为单链fv(scfv)。或者，通过使用太短(例如，少于约9个残基)而不能够使单条多肽链的vl和vh结构域缔合在一起的柔性接头，可形成双特异性抗体、双抗体或类似分子(其中两条这样的多肽链缔合在一起以形成二价表位结合分子)。本发明内所涵盖的表位结合抗体片段的一些实例包括(i)fab’或fab片段，由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段或wo2007059782中所述的单价抗体；(ii)f(ab’)2片段、包含在铰链结构域通过二硫桥连接的两个fab片段的二价片段；(iii)基本上由vh和ch1结构域组成的fd片段；(iv)基本上由vl和vh结构域组成的fv片段，(v)基本上由vh结构域组成的dab片段，并且也称为结构域抗体；(vi)骆驼科抗体或纳米抗体，以及(vii)分离的互补决定区(cdr)。此外，尽管fv片段的两个结构域vl和vh由单独的基因编码，但是其可使用重组方法通过能够使其制成单条蛋白链的合成接头连接，其中vl和vh结构域配对形成单价分子(称为单链抗体或单链fv(scfv)。[0186]术语“纳米抗体”表示仅由免疫球蛋白的重链(vh片段)的抗原结合区形成的小尺寸实体(15kda)。所述纳米抗体主要是在对骆驼科族例如骆驼、美洲驼和单峰骆驼(主要是美洲驼)以及鲨鱼族的动物进行免疫之后产生的，其特殊性在于具有天然缺乏轻链并通过重链可变结构域识别抗原的抗体。然而，来源于这些来源的纳米抗体需要人源化过程用于其治疗性应用。用于获得纳米抗体的另一种潜在来源是通过分离可变区的vh和vl结构域来源于不同人样品的抗体。纳米抗体呈现出以下优点：例如相对于完整抗体生产成本降低、稳定性和免疫原性降低。[0187]术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，这些片段包含与同一条多肽链(vh‑vl)中的轻链可变结构域(vl)连接的重链可变结构域(vh)。通过使用太短而不允许同一条链上的两个结构域之间配对的接头，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。[0188]本发明内包含的与糖基化apoj结合的抗体的功能性片段保留了它们所衍生的全长抗体的至少一种结合功能和/或调节功能。优选的功能性片段保留了相应全长抗体的抗原结合功能(例如，与哺乳动物ccr9结合的能力)。[0189]本发明还可包含双特异性抗体。双特异性抗体是对至少两个不同表位具有结合特异性的抗体。示例性的双特异性抗体可与糖基化apoj的两个不同表位结合。双特异性抗体可被制备为全长抗体或抗体片段(例如f(ab)2双特异性抗体、微抗体、双抗体)。根据不同的方法，将具有期望结合特异性(抗体‑抗原结合位点)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。所述融合优选地是与免疫球蛋白重链恒定结构域，其包含铰链区、ch2区和ch3区的至少一部分。优选的是具有包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(chi)，其存在于至少一种融合物中。编码免疫球蛋白重链融合物和免疫球蛋白轻链(如果需要时)的dna被插入到分离的表达载体中，并且共转染到合适的宿主生物体中。在一些实施方案中，当在构建中使用不等比例的三条多肽链提供最佳产率时，这为调节三种多肽片段的相互比例提供了大的灵活性。然而，当至少两条多肽链以相同比例表达时导致高产率或者当比例没有特定意义时，可将两条或全部三条多肽链的编码序列插入一个表达载体中。[0190]文献中也描述用于从抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如，双特异性抗体可使用化学键联来制备。[0191]具有与糖基化apoj结合的能力的片段也可通过本领域普通技术人员已知的常规方法获得。所述方法可涉及分离编码目的单克隆抗体的多肽链(或其片段)的dna，并通过重组dna技术操纵dna。dna可用于产生另一种目的dna或改变的dna(例如通过诱变)用于添加、去除或替换一个或更多个氨基酸，例如编码抗体多肽链(例如，重链或轻链、可变区或完整抗体)的dna可从用糖基化apoj免疫接种的鼠b细胞中分离。dna可通过常规方法，例如通过pcr来分离和扩增。[0192]单链抗体可通过常规方法通过氨基酸桥结合重链与轻链的可变区(fv区)来获得。scfv可通过在编码可变区(vl和vh)的多肽的dna之间融合编码接头肽的dna来制备。scfv的产生在许多文献中均进行了描述，例如在美国专利us4,946,778，bird(science242：423，1988)，huston等(proc.natl.acadsciusa85：5879，1988)和ward等(nature334：544，1989)中。[0193]在另一个实施方案中，抗体包含vl结构域和vh结构域。术语“vh结构域”是指免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，并且术语“vl结构域”是指免疫球蛋白轻链的氨基末端可变结构域。本文中所述的vl结构域可与恒定结构域连接以形成轻链，例如全长轻链。本文中所述的vh结构域可与恒定结构域连接以形成重链，例如全长重链。[0194]在另一个实施方案中，本发明的抗体与可检测标记偶联。在另一个优选实施方案中，所述标记可通过其物理特性、化学特性、电特性或磁特性中的至少一种的变化来检测。[0195]在本发明的上下文中，本文中使用的术语“可检测标记”或“标记试剂”是指允许使用合适的检测程序和和装置例如通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段来检测、定位和/或鉴定其所附接分子的分子标记。适合用于标记抗体的标记试剂包括放射性核素、酶、荧光团、化学发光试剂、酶底物或辅因子、酶抑制剂、颗粒、磁性颗粒、染料和衍生物等。[0196]通过放射性同位素(也称为放射性同位素或放射性核素)进行放射性标记的化合物，可包括但不限于3h、14c、15n、35s、90y、99tc、min、125i、131i、133xe、111lu、211at和213b。通常通过使用能够络合金属离子的螯合配体(例如dota、dotp、dotma、dtpa和teta)进行放射性同位素标记。用于将放射性同位素与蛋白质缀合的方法在现有技术中是公知的。[0197]在另一个具体实施方案中，本发明的抗体用荧光基团标记。荧光基团可直接或通过连接基团与氨基酸的侧链附接。用于缀合多肽荧光试剂的方法在现有技术中是公知的。[0198]用于用荧光基团标记多肽(例如抗体)的合适试剂包括显示出与蛋白质侧链中所列的多种基团(包括氨基和巯基)进行反应的能力的化学基团。因此，可用于修饰根据本发明的抗体的化学基团包括但不限于：马来酰亚胺、卤代乙酰基、碘乙酰胺琥珀酰亚胺酯(例如nhs、n‑羟基琥珀酰亚胺)、异硫氰酸酯、磺酰氯、2，6‑二氯三嗪基、五氟苯基酯、亚磷酰胺等。合适的反应性官能团的一个实例是经羧基修饰的可检测基团的n‑羟基琥珀酰亚胺酯(nhs)。通常来说，修饰荧光化合物的羧基通过使所述化合物与以下接触而被活化以得到标记的nhs酯：碳二亚胺试剂(例如，二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺)铀或试剂例如tstu(0‑(n‑琥珀酰亚胺基)‑n，n，n’，n’‑四甲基脲四氟硼酸酯)、hbtu((0‑苯并三唑‑1‑基)‑n，n，n’，n’‑四甲基脲六氟磷酸酯)或hatu(0‑(7‑氮杂苯并三唑‑1‑基)‑n，n，n’，n’‑四甲基脲六氟磷酸酯)、1‑羟基苯并三唑(hobt)和n‑羟基琥珀酰亚胺类型的活化剂。[0199]荧光标记物可包括但不限于溴化乙锭、sybrgreen、异硫氰酸荧光素(fitc)、四甲基罗丹明异硫醇(trit)、5‑羧基荧光素、6‑羧基荧光素、荧光素、hex(6‑羧基‑2’，4，4’，5’，7，7’‑六氯荧光素)、俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、joe(6‑羧基‑4’，5’‑二氯‑2’，7’‑二甲氧基荧光素)、5‑羧基‑2’，4’，5’，7’‑四氯荧光素、5‑羧基罗丹明、罗丹明、四甲基罗丹明(tamra)、rox(羧基‑x‑罗丹明)、r6g(罗丹明6g)、酞菁、偶氮甲碱类(azometazinas)、花青类(cyanines)(cy2、cy3和cy5)、德克萨斯红、princestonred、bodipyfl‑br2、bodipy530/550、bodipytmr、bodipy558/568、bodipy564/570、bodipy576/589、bodipy581/591、bodipytr、bodipy630/650、bodipy650/665、dabcyl、伊红、赤藓红、溴化乙锭、绿色荧光蛋白(gfp)及其类似物、基于无机的荧光半导体纳米晶体(量子点)、基于镧系元素(例如eu3 和sm3 等)的荧光标记物、罗丹明、磷‑镧系元素或fitc。[0200]酶标记物可包括但不限于辣根过氧化物酶、β‑半乳糖苷酶、萤光素酶或碱性磷酸酶。[0201]优选的标记包括但不限于荧光素、磷酸酶例如碱性磷酸酶、生物素、抗生物素蛋白、过氧化物酶例如辣根过氧化物酶和与生物素相关的化合物或与抗生物素蛋白相关的化合物(例如，可从pierce，rockford，il获得链霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白)。[0202]在另一个具体实施方案中，本发明的抗体通过与结合对的第一成员缀合而被标记。在一个优选实施方案中，该修饰是共价生物素化。本文中使用的术语“生物素化”是指生物素与分子(通常是蛋白质)的共价附接。使用能够与蛋白质侧链缀合的生物素试剂进行生物素化，其中所述缀合主要发生在蛋白质侧链中包含的伯氨基和巯基上。用于氨基的生物素化的合适试剂包括含有生物素和能够与氨基反应的基团的分子，例如琥珀酰亚胺酯、五氟苯基酯或卤烷类，其中生物素部分和反应性基团被任意长度的间隔物隔开。[0203]在另一个具体实施方案中，本发明的抗体用金属离子例如金(au)标记，包括可通过静电相互作用与抗体直接附接的胶体金纳米粒。在另一个具体实施方案中，胶体金纳米粒与生物素预先偶联，并且可与抗体共价连接。[0204]多核苷酸、载体和宿主细胞[0205]根据本发明的另一个方面，提供了编码对糖基化apoj具有高亲和力和特异性的单克隆抗体或其片段的多核苷酸序列，以及携带这些多核苷酸序列的载体和宿主细胞。[0206]因此，在第二个方面中，本发明涉及编码根据本发明的第一个方面的抗体的多核苷酸。[0207]本发明提供了核酸分子，特别是在一些实施方案中编码本发明的一种或更多种抗体的多核苷酸。广义上，术语“核酸”包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。这些聚合物通常被称为多核苷酸。本文中提及的术语“多核苷酸”意指长度为至少10个碱基的聚合形式的核苷酸。在某些实施方案中，碱基可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类核苷酸的经修饰形式。该术语包括单链和双链形式的dna。[0208]本发明的示例性核酸或多核苷酸包括但不限于核糖核酸(rna)、脱氧核糖核酸(dna)、苏糖核酸(threosenucleicacid，tna)、乙二醇核酸(glycolnucleicacid，gna)、肽核酸(peptidenucleicacid，pna)、锁核酸(lockednucleicacid，lna，包括具有β‑d‑ribo构型的lna、具有α‑l‑ribo构型的α‑lna(lna的非对映体)、具有2’‑氨基官能化的2’‑氨基‑lna以及具有2’‑氨基官能化的2’‑氨基‑α‑lna)、乙烯核酸(ethylenenucleicacid，ena)、环己烯基核酸(cyclohexenylnucleicacid，cena)或杂交体或者其组合。[0209]在一个实施方案中，仅使用体外转录(ivt)酶促合成方法制备的编码本发明的一种或更多种抗体构建体的线性多核苷酸被称为“ivt多核苷酸”。制备ivt多核苷酸的方法是本领域中已知的，并且描述于2013年3月9日提交的共同待决国际公开no.wo2013151666(代理人案号m300)中，其内容通过引用整体并入本文。[0210]上述的任何多核苷酸还可包括另外的核酸，所述另外的核酸编码例如指导分泌本文中所述的编码的多肽、抗体恒定区或本文中所述的其他异源多肽的信号肽。此外，如本文其他地方更详细描述的，本发明包括包含一种或更多种上述多核苷酸的组合物。[0211]在一个实施方案中，本发明包括包含第一多核苷酸和第二多核苷酸的组合物，其中所述第一多核苷酸编码本文中所述的vh结构域，并且其中所述第二多核苷酸编码本文中所述的vl结构域。[0212]本发明还包括本发明的多核苷酸的片段。另外，本发明还考虑了编码本文中所述的融合多肽、fab片段和其他衍生物的多核苷酸。[0213]多核苷酸可通过本领域中已知的任何方法产生或制造。例如，如果抗体的核苷酸序列已知，则可从化学合成的寡核苷酸组装编码该抗体的多核苷酸(例如，如kutmeier等，biotechniques17：242(1994)中所述)，简言之，其涉及合成包含编码该抗体的部分序列的重叠寡核苷酸，进行退火并连接那些寡核苷酸，并随后通过pcr扩增连接的寡核苷酸。[0214]或者，编码本发明的糖基化apoj抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可由合适来源的核酸产生。如果含有编码特定抗体的核酸的克隆不可用，但抗体分子的序列是已知的，则编码该抗体的核酸可被化学合成或者通过使用可与序列的3’和5’端杂交的合成引物进行pcr扩增，或通过使用对待鉴定的特定基因序列(例如来自编码该抗体的cdna文库的cdna克隆)具有特异性的寡核苷酸探针进行克隆从合适的来源(例如抗体cdna文库，或从表达该抗体或其它抗糖基化apoj抗体的任何组织或细胞(例如被选择来表达该抗体的杂交瘤细胞)产生的cdna文库，或从其分离的核酸，优选polya rna)获得。然后可使用本领域中公知的任何方法将通过pcr产生的扩增的核酸克隆到可复制的克隆载体中。[0215]一旦确定了抗糖基化apoj抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的核苷酸序列和相应的氨基酸序列，就可使用本领域中公知的用于操纵核苷酸序列的方法(例如重组dna技术、定点诱变、pcr等)来操纵其核苷酸序列(参见，例如sambrook等(1990)molecularcloning，alaboratorymanual(第2版；coldspringharborlaboratory，coldspringharbor，n.y.)和ausubel等，编辑.(1998)currentprotocolsinmolecularbiology(johnwiley&sons，ny)中所述的技术，二者均通过引用整体并入本文)，以产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸替换、缺失和/或插入。[0216]编码抗糖基化apoj抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸构成，其可以是未经修饰的rna或dna或者是经修饰的rna或dna。例如，编码抗糖基化apoj抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可由以下构成：单链和双链dna、是单链与双链区域的混合物的dna、单链和双链rna、以及是单链与双链区域的混合物的rna、包含dna和rna的杂合分子，所述dna和rna可以是单链的，或更典型地双链的或者单链与双链区域的混合物。另外，编码抗糖基化apoj抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可由包含rna或dna或者rna和dna二者的三链区构成。[0217]出于稳定性或其他原因，编码抗糖基化apoj抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸也可包含一个或更多个经修饰的碱基或经修饰的dna或rna骨架。“经修饰的”碱基包括例如三苯甲基化的碱基和不寻常的碱基例如肌苷。可对dna和rna进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包括化学、酶或代谢修饰的形式。[0218]编码来源于免疫球蛋白(例如，免疫球蛋白重链部分或轻链部分)的多肽的非天然变体的分离的多核苷酸可通过向免疫球蛋白的核苷酸序列引入一种或更多种核苷酸替换、添加或缺失，以使得一种或更多种氨基酸替换、添加或缺失被引入编码的蛋白质中来产生。突变可通过标准技术例如定点诱变和pcr介导的诱变引入。优选地，在一个或更多个非必需氨基酸残基处进行保守氨基酸替换。[0219]在一个实施方案中，多核苷酸具有模块化设计以编码本文中所述的抗体、其片段或变体中的至少一种。作为一个非限制性实例，多核苷酸构建体可编码以下设计中的任一种：(1)抗体的重链，(2)抗体的轻链，(3)抗体的重链和轻链，(4)被接头隔开的重链和轻链，(5)vh1、ch1、ch2、ch3结构域、接头和轻链以及(6)vh1、ch1、ch2、ch3结构域、vl区和轻链。这些设计中的任一个还可包含任何结构域和/或区域之间的任选接头。[0220]在一个具体实施方案中，本发明的多核苷酸编码fab、f(ab)2、单结构域抗体、单链可变片段(scfv)或纳米抗体。[0221]在一个优选实施方案中，本发明的多核苷酸选自：[0222](i)编码根据本发明的抗体的多核苷酸，其中该抗体是单结构域抗体、单链可变片段(scfv)或纳米抗体，[0223](ii)编码含有根据表1的重链可变区的多肽的多核苷酸，[0224](iii)编码含有根据表1的轻链可变区的多肽的多核苷酸，以及[0225](iv)编码含有根据表1的轻链可变区和根据表1的重链可变区的多肽的多顺反子多核苷酸。[0226]在一个优选实施方案中，根据本发明的多核苷酸包含seqidno：143、144、145、146、147、148、149、150或151中定义的序列。[0227]在一个相关方面中，本发明涉及表达载体，其包含编码本发明抗体的多核苷酸。[0228]“载体”包括穿梭载体和表达载体，并且包括例如质粒、黏粒或噬菌粒。通常来说，质粒构建体还将包括复制起点(例如，cole1复制起点)和选择标记(例如，氨苄青霉素或四环素抗性)，分别用于细菌中质粒的复制和选择。“表达载体”是指含有用于在原核细胞(例如细菌)或真核细胞中表达抗体(包括本发明的抗体片段)所必需的控制序列或调控元件的载体。合适的载体在以下公开。[0229]对于抗体的重组产生，分离编码抗体的核酸分子并插入到可复制的载体中用于进一步克隆(dna的扩增)，或者插入到与启动子有效键联的载体中用于表达。使用常规手段(例如，通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的核酸分子特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离编码抗体的dna并进行测序。许多载体是可获得的。载体组分通常包括但不限于以下的一种或更多种：信号序列、复制起点、一种或更多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。[0230]本发明的抗糖基化apoj抗体不仅可直接重组产生，而且可作为具有异源多肽的融合多肽，所述异源多肽优选是信号序列或在成熟的蛋白质或多肽的n‑末端具有特定切割位点的其他多肽。优选地，所选择的异源信号序列是被宿主细胞识别和加工(即，被信号肽酶切割)的序列。对于不识别和不加工天然抗糖基化apoj抗体信号序列的原核宿主细胞，该信号序列被例如选自以下的原核信号序列替换：碱性磷酸酶、青霉素酶、1pp或热稳定肠毒素ii前导物。对于酵母分泌，天然信号序列可被以下替换：例如酵母转化酶前导物、oc因子前导物(包括酿酒酵母(saccharomyces)和克鲁维酵母(kluyveromyces)cc因子前导物)或酸性磷酸酶前导物、白色念珠菌(calbicans)葡糖淀粉酶前导物或者wo90/13646中所述的信号。在哺乳动物细胞表达中，可获得哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导物，例如单纯疱疹gd信号。这样的前体区域的dna在阅读框中与编码抗糖基化apoj抗体的dna连接。[0231]表达和克隆载体二者均包含使载体能够在一种或更多种选定的宿主细胞中复制的核酸序列。一般来说，在克隆载体中，该序列是使载体能够独立于宿主染色体dna复制的序列，并且包括复制起点或自主复制序列。这样的序列对于多种细菌、酵母和病毒是公知的。来自质粒pbr322的复制起点适合用于大多数革兰氏阴性菌，2μ质粒起点适合用于酵母，并且多种病毒起点(sv40、多瘤、腺病毒、vsv或bpv)可用于在哺乳动物细胞中克隆载体。一般来说，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分(sv40起点通常仅因为它包含早期启动子可使用)。[0232]表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标记。典型的选择基因编码的蛋白质：(a)赋予对抗生素或其他毒素(例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素)的抗性，(b)补充营养缺陷型，或(c)提供从复合培养基中不可获得的关键营养素，例如编码杆菌(bacilli)的d‑丙氨酸消旋酶的基因。选择方案的一个实例利用药物阻止宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的那些细胞产生赋予药物抗性的蛋白质，并且因此在选择方案中存活。这样的显性选择的一些实例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。[0233]用于哺乳动物细胞的合适选择标记的另一个实例是能够鉴定感受态细胞以摄取抗糖基化apoj抗体核酸的那些，例如dhfr、胸苷激酶、金属硫蛋白‑1和‑11，优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。例如，首先通过在含有甲氨蝶呤(mtx)(dhfr的竞争性拮抗剂)的培养基中培养所有转化体来鉴定用dhfr选择基因转化的细胞。当使用野生型dhfr时，合适的宿主细胞是缺乏dhfr活性的中国仓鼠卵巢(chinesehamsterovary，cho)细胞系(例如，atcccrl‑9096)。[0234]或者，包含内源性dhfr用编码抗糖基化apoj抗体、野生型dhfr蛋白的dna序列与另一种选择标记例如氨基糖苷3’‑磷酸转移酶(aph)转化或共转化的宿主细胞特别是野生型宿主，可通过在含有针对选择标记的选择试剂例如氨基糖苷类抗生素(例如卡那霉素、新霉素或g418)的培养基中进行细胞生长来选择。参见美国专利no.4,965,199。[0235]用于酵母的合适的选择基因是存在于酵母质粒yrp7中的trp1基因(stinchcomb等，nature，282：39(1979))。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株(例如atccno.44076或pep4)提供了选择标记jones，genetics，85：12(1977)。然后酵母宿主细胞基因组中trp1病灶的存在为在不存在色氨酸的情况下通过生长检测转化提供了有效的环境。类似地，leu2缺陷型酵母菌株(atcc20，622或38，626)由带有leu2基因的已知质粒补充。[0236]另外，来源于1.6pm环状质粒pkdi的载体可用于克鲁维酵母的转化。作为替代，针对乳酸克鲁维酵母(k.lactis)报道了用于大规模生产重组小牛凝乳酶的表达体系。vandenberg，bio/technology，8：135(1990)。还已公开了用于通过克鲁维酵母的工业菌株分泌成熟的重组人血清白蛋白的稳定多拷贝表达载体。fleer等，bio/technology，9：968‑975(1991)。[0237]表达和克隆载体通常包含被宿主生物体识别并与抗糖基化apoj抗体核酸有效连接的启动子。适用于原核宿主的启动子包括phoa启动子、p‑内酰胺酶和乳糖启动子体系、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子体系以及杂合启动子例如tac启动子。然而，其他已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌体系的启动子还将包含与编码抗糖基化apoj抗体的dna有效连接的shine‑dalgarno(s.d.)序列。[0238]真核生物的启动子序列是已知的。事实上，所有真核基因均具有位于转录起始位点上游约25至30个碱基处的at富集区。在许多基因转录起始上游70至80个碱基处发现的另一个序列是cncaat区，其中n可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3’端是aataaa序列，其可以是用于将polya尾添加至编码序列3’端的信号。所有这些序列均被适当地插入到真核表达载体中。与酵母宿主一起使用的合适的启动子序列的一些实例包括针对以下的启动子：3‑磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶，例如烯醇酶、甘油醛磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖磷酸异构酶、3‑磷酸甘油酸突变酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶。[0239]另外的具有受生长条件控制的转录优势的诱导型启动子的其他酵母启动子是针对乙醇脱氢酶2、异细胞色素c、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛磷酸脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。ep73，657中还描述了用于酵母表达的合适的载体和启动子。酵母增强剂还有利地与酵母启动子一起使用。[0240]哺乳动物宿主细胞中载体的抗糖基化apoj抗体转录由例如启动子控制，所述启动子从以下病毒的基因组获得：例如多瘤病毒、鸡痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒以及最优选地猿猴病毒40(sv40)，其来自异源哺乳动物启动子(例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)、来自热激启动子，前提是这样的启动子与宿主细胞体系相容。[0241]sv40病毒的早期和晚期启动子作为sv40限制性片段方便地获得，该片段也包含sv40病毒复制起点。人巨细胞病毒的直接早期启动子作为hindiiie限制性片段方便地获得。美国专利no.4,419,446中公开了用于使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达dna的体系。对该体系的修改在美国专利no.4,601,978中进行了描述。关于在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子控制下的人p‑干扰素cdna在小鼠细胞中的表达还参见reyes等，nature297：598‑601(1982)。或者，可将劳斯肉瘤病毒长末端重复作为启动子使用。[0242]高等真核生物对编码本发明的抗糖基化apoj抗体的dna的转录通常通过将增强子序列插入到载体中来提高。现在已知许多增强子序列来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)。然而，通常会使用来自真核细胞病毒的增强子。一些实例包括复制起点晚期侧上的sv40增强子(bp100至270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点晚期侧上的多瘤增强子和腺病毒增强子。关于增强用于真核启动子活化的元件还参见yaniv，nature297：17‑18(1982)。尽管增强子可剪接到载体中在抗‑抗糖基化apoj抗体编码序列的5’或3’位置处，但是优选位于启动子的5’位点。[0243]真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其他多细胞生物体的有核细胞)中使用的表达载体也将包含用于终止转录和用于稳定mrna所需的序列。这样的序列通常可从真核或病毒dna或cdna的5’以及偶尔3’非翻译区获得。这些区域包含在编码抗糖基化apoj抗体的mrna的未翻译部分中转录为聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止组分是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见wo94/11026及其中公开的表达载体。[0244]在另一个相关方面中，本发明涉及包含本发明的多核苷酸或载体的宿主细胞。[0245]本文中使用的术语“宿主细胞”是指其中已引入本发明的核酸(例如根据本发明的多核苷酸或载体)并且能够表达本发明的微肽的细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。应理解，这样的术语不仅是指特定的对象细胞，而且还指这样的细胞的后代或潜在后代。因为由于突变或环境影响，某些修饰可发生在后代中，所以这样的后代实际上可以与亲本细胞不同，但仍包括在本文中使用的术语的范围内。该术语包括可通过引入异源dna而修饰的任何可培养细胞。优选地，宿主细胞是其中本发明的多核苷酸可稳定表达、翻译后修饰、定位于合适的亚细胞区室并使得与合适的转录机制接合的宿主细胞。合适的宿主细胞的选择也将受到检测信号选择的影响。[0246]用于在本文的载体中克隆或表达dna的合适宿主细胞是上述的原核生物、酵母或高等真核细胞。出于该目的，合适的原核生物包括真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科例如埃希氏杆菌属(escherichia)(例如大肠杆菌(e.coli))、肠杆菌属(enterobacter)、欧文菌属(erwinia)、克雷伯菌属(klebsiella)、变形杆菌属(proteus)、沙门菌属(salmonella)(例如，鼠伤寒沙门菌(salmonellatyphimurium))、沙雷菌属(serratia)(例如，黏质沙雷菌(serratiamarcescans))和志贺菌属(shigella)以及芽孢杆菌属(bacill)(例如枯草芽孢杆菌(b.subtilis)和地衣芽孢杆菌(b.licheniformis))(例如1989年4月12日公布的dd266，710中公开的地衣芽孢杆菌41p)、假单胞菌属(pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(p.aeruginosa))和链霉菌属(streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(atcc31，446)，尽管其他菌株例如大肠杆菌b、大肠杆菌x1776(atcc31，537)和大肠杆菌w3110(atcc27，325)也是合适的。这些实例是举例说明性的而不是限制性的。[0247]可在细菌中产生全长抗体、抗体片段和抗体融合蛋白，特别是在不需要糖基化和fc效应子功能时，例如当治疗性抗体与细胞毒素剂(例如，毒素)缀合并且免疫缀合物本身在肿瘤细胞破坏中显示出有效性时。全长抗体在循环中具有更长的半衰期。在大肠杆菌中进行的生产更快并且更具成本效益。有关抗体片段和多肽在细菌中的表达参见：例如美国专利no.5,648,237(carteret.al.)、美国专利no.5,789,199(joly等)和美国专利no.5,840,523(simmons等)，其描述了用于优化表达和分泌的翻译起始区(translationinitiationregion，tir)和信号序列，这些专利通过引用并入本文。在表达之后，从大肠杆菌细胞糊中分离出在可溶性级分中的抗体，并且可根据同种型通过例如蛋白a或g柱进行纯化。最终纯化可类似于用于纯化例如在cho细胞中表达的抗体的方法进行。[0248]除原核生物之外，真核微生物例如丝状真菌或酵母也是用于抗糖基化apoj抗体编码载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)或普通面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其他属、种和菌株是普遍可获得的并且在在本文中可用，例如粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)；克鲁维酵母宿主，例如如乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母(k.fragilis)(atcc12，424)、保加利亚克鲁维酵母(k.bulgaricus)(atcc16，045)、魏氏克鲁维酵母(k.wickeramii)(atcc24，178)、瓦尔特克鲁维酵母(k.waltii)(atcc56，500)、果蝇克鲁维酵母(k.drosophilarum)(atcc36，906)、耐热克鲁维酵母(k.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(k.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(ep402，226)；毕赤酵母(pichiapastoris)(ep183，070)；念珠菌属(candida)；里氏木霉(trichodermareesia)(ep244，234)；粗糙脉孢菌(neurosporacrassa)；许旺酵母属(schwanniomyces)，例如西方许旺酵母(schwanniomycesoccidentalis)；和丝状真菌，例如如脉孢菌属(neurospora)、青霉菌属(penicillium)、弯颈霉属(tolypocladium)和曲霉菌属(aspergillus)宿主，例如构巢曲霉(a.nidulans)和黑曲霉(a.niger)。[0249]用于表达糖基化的抗糖基化apoj抗体的合适宿主细胞来源于多细胞生物体。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定了许多来自以下宿主的杆状病毒株和变体以及相应的允许昆虫宿主细胞：例如草地贪夜蛾(spodopterafrugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(aedesaegypti)(蚊)、白纹伊蚊(aedesalbopictus)(蚊)、黑腹果蝇(drosophilamelanogaster)(果蝇)以及家蚕(bombyxmori)。用于转染的多种病毒株是公众可获得的，例如苜蓿银纹夜蛾(autographacalifornica)npv的l‑1变体和家蚕npv的bm‑5菌株，并且这样的病毒可用作根据本发明的本文中的病毒，特别是用于转染草地贪夜蛾细胞。[0250]棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、拟南芥(arabidopsis)和烟草的植物细胞培养物也可用作宿主。可用于在植物细胞培养物中产生蛋白质的克隆和表达载体是本领域技术人员已知的。参见例如hiatt等，nature(1989)342：76‑78，owen等(1992)bio/technology10：790‑794，artsaenko等(1995)theplantj8：745‑750，和fecker等(1996)plantmolbiol32：979‑986。[0251]然而，最令人感兴趣的是脊椎动物细胞，而且在培养物(组织培养物)中繁殖脊椎动物细胞已成为常规程序。可用的哺乳动物宿主细胞系的一些实例是由sv40转化的猴肾cvi系(cos‑7，atcccrl1651)；人胚肾系(293细胞或用于在悬浮培养物中生长的亚克隆293细胞，graham等，j.genvirol.36：59(1977))；幼小仓鼠肾细胞(bhk，atccccl10)；中国仓鼠卵巢细胞/‑dhfr(cho，urlaub等，proc.natl.acad.sci.usa77：4216(1980))；小鼠塞托利细胞(tm4，mather，biol.reprod.23：243‑251(1980))；猴肾细胞(cviatccccl70)；非洲绿猴肾细胞(vero‑76，atcccrl1587)；人宫颈癌细胞(hela，atccccl2)；犬肾细胞(mdck，atccccl34)；纯系大鼠(buffalorat)肝细胞(brl3a，atcccrl1442)；人肺细胞(w138，atccccl75)；人肝细胞(hepg2，14138065)；小鼠乳腺瘤(mmt060562，atccccl51)；tri细胞(mather等，annalsn.y.acad.sci.383：44‑68(1982))；mrc5细胞；fs4细胞；以及人肝癌系(hepg2)。[0252]宿主细胞经上述用于抗糖基化apoj抗体产生的表达或克隆载体转化，并在经适当修饰用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码所期望序列的基因的常规营养培养基中培养。[0253]用于产生本发明的抗糖基化apoj抗体的宿主细胞可在多种培养基中培养。市售培养基例如ham′sfio(sigma)、最低必需培养基(minimalessentialmedium，mem)(sigma)、rpmi‑1640(sigma)和dulbecco改良的eagle培养基(dmem)(sigma)适合于培养宿主细胞。另外，ham等，meth.enz.58：44(1979)，barnes等，anal.biochem.102：255(1980)，美国专利no.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；wo90/03430；wo87/00195；或美国专利no.re.30,985中描述的任何培养基均可用作用于宿主细胞的培养基。这些培养基中的任一种均可根据需要补充激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(例如hepes)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如gentamycintm药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能量来源。也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其他必要的补充物。培养条件，例如温度、ph等是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些，并且对于普通技术人员将是明显的。[0254]当使用重组技术时，抗体可在细胞内、在周质间隙中产生，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内产生抗体，则根据第一步骤，例如通过离心或超滤去除颗粒碎片，其为宿主细胞或裂解片段。carter等，bio/technology10：163‑167(1992)描述了用于分离分泌到大肠杆菌的周质间隙的抗体的方法。简言之，将细胞糊在存在乙酸钠(ph3.5)、edta和苯甲基磺酰氟(pmsf)的情况下解冻约30分钟。细胞碎片可通过离心去除。在将抗体分泌到培养基中的情况下，通常使用市售的蛋白质浓缩过滤器(例如amicon或milliporepellicon超滤单元)首先将来自这样的表达体系的上清液浓缩。蛋白酶抑制剂例如pmsf可包含在任何前述步骤中来抑制蛋白水解并且可包含抗生素以防止外来污染物的生长。[0255]由细胞制备的抗体组合物可使用例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱进行纯化，其中亲和色谱是优选的纯化技术。蛋白a作为亲和配体的适合性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白fc结构域的种类和同种型。蛋白a可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(lindmark等，j.immunol.meth.62：1‑13(1983))。蛋白g被推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(guss等，emboj.5：15671575(1986))。亲和配体所附接的基质最通常为琼脂糖，但也可使用其他基质。机械稳定的基质例如受控的孔隙玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯，允许比使用琼脂糖可实现的流动速率更快的流动速率和比使用琼脂糖可实现的处理时间更短的处理时间。在抗体包含ch3结构域的情况下，bakerbondabxtm树脂(j.t.baker，phillipsburg，n.j.)可用于纯化。根据待回收的抗体，还可使用用于蛋白质纯化的其他技术，例如在离子交换柱上分馏、乙醇沉淀、反相hplc、在二氧化硅上的色谱、在肝素sepharosetm上的色谱、在阴离子或阳离子交换树脂(例如聚天冬氨酸柱)上的色谱、色谱聚焦、sds‑page和硫酸铵沉淀。[0256]在一个或更多个任何初步纯化步骤之后，包含目标抗体与污染物的混合物可使用ph为2.5至4.5的洗脱缓冲液进行低ph疏水相互作用色谱，优选在低盐浓度(例如，约0至0.25m盐)下进行。[0257]组合物[0258]在第三个方面中，本发明涉及包含如本发明的第一个方面中或上述任何具体实现或实施方案中所定义的至少两种抗体的组合物。[0259]本文中使用的术语“组合物”涉及包含任何比例和数量的任何上述抗体的物质组合物，以及由其任何数量的不同抗体的组合直接或间接产生的任何产物。[0260]在一个优选实施方案中，形成本发明组合物的一部分的抗体的w/w比通常在约0.01∶1至100∶1的范围内。合适的比包括但不限于例如0.05∶1、0.1∶1、0.5∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶55、1∶60、1∶65、1∶70、1∶75、1∶80、1∶85、1∶90、1∶95、1∶100、100∶1、95∶1、90∶1、85∶1、80∶1、75∶1、70∶1、65∶1、60∶1、55∶1、50、45∶1、40∶1、35∶1、30∶1、25∶1、20∶1、15∶1、10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶0.5、1∶0.1和1∶0.05。[0261]在又一个优选实施方案中，形成本发明组合物的一部分的抗体的w/w比为1∶1。[0262]本领域技术人员将观察到，所述组合物可被配制成单一制剂或者可作为每种抗体的单独制剂存在，其可被组合用于作为组合制剂联合使用。所述组合物可以是成套试剂盒，其中每种组分被单独配制和包装。[0263]在一个具体实施方案中，本发明的组合物的特征在于抗体之一是ag2g‑17抗体。[0264]在另一个实施方案中，本发明的组合物包含：[0265](i)ag2g‑17和ag6g‑1抗体，[0266](ii)ag2g‑17和ag6g‑11抗体，[0267](iii)ag2g‑17和ag7g‑19抗体，[0268](iv)ag2g‑17和ag1g‑11抗体，[0269](v)ag2g‑17和ag7g‑17抗体，[0270](vi)ag2g‑17和ag4g‑6抗体，[0271](vii)ag2g‑17和ag3g‑4抗体，或者[0272](viii)ag2g‑17和ag5g‑17抗体。[0273]用于检测糖基化apoj的方法[0274]在第四方面中，本发明涉及用于在样品中确定糖基化apoj的方法(在下文中称为本发明的第一方法)，其包括以下步骤：[0275](i)在适合于在抗体与样品中存在的糖基化apoj之间形成复合物的条件下，使样品与本发明的抗体或本发明的组合物接触，[0276](ii)确定步骤(i)中形成的复合物的量。[0277]一般而言，免疫结合方法包括获得疑似包含糖基化apoj蛋白的样品，以及在有效允许形成免疫复合物的条件下使该样品与能够选择性结合或检测糖基化apoj蛋白的组合物接触。[0278]样品可以是疑似包含糖基化apoj蛋白的任何样品，例如组织切片或标本、均质的组织提取物、细胞、细胞器、经分离和/或经纯化形式的任一种以上含抗原组合物、或者任何生物流体，包括血液、血清和血浆。优选地，疑似包含糖基化apoj蛋白的样品是血液、血清或血浆。[0279]在有效条件下使所选生物样品与本发明的抗体接触并持续足以允许形成免疫复合物的时段，这通常是简单地将抗体组合物添加至样品并将混合物孵育足够长的时段以形成免疫复合物。[0280]“在适于形成复合物的条件下”意指所述条件优选地包括用溶液(例如bsa、牛丙种球蛋白(bgg)或磷酸盐缓冲盐水(pbs)/吐温)来对抗原和/或抗体进行稀释。这些添加的试剂还倾向于有助于降低非特异性背景。[0281]“合适的”或“适当的”条件还意指孵育在足以允许有效结合的温度或时段下进行。孵育步骤通常为约1至2至4小时左右，温度优选约25℃至27℃，或者可以在约4℃左右过夜。[0282]可以以多种方式进行确定形成的复合物的量。在一个优选实施方案中，将抗体标记，并直接确定结合。例如，这可通过将糖基化apoj蛋白附着于固体支持物，添加经标记抗体(例如荧光标记)，洗去过量的试剂以及确定标记是否存在于固体支持物上来进行。如本领域中已知的，可利用多种封闭和洗涤步骤。[0283]一般而言，免疫复合物形成的检测是本领域中公知的，并且可通过应用多种方法来实现。这些方法通常基于标记或标志物(例如那些放射性标签、荧光标签、生物标签和酶标签中的任一种)的检测。关于使用这样的标记的美国专利包括美国专利no.3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241。当然，如本领域中已知的，通过使用二级结合配体例如二抗和/或生物素/抗生物素蛋白配体结合排列，可发现另外的优点。[0284]在一个优选实施方案中，本发明的第一方法的步骤(ii)中的复合物的确定是使用抗apoj抗体来进行的。[0285]在又一个优选实施方案中，将本发明的第一方法的步骤(i)中使用的抗体或步骤(i)中使用的组合物中的抗体固定。[0286]如本领域技术人员将理解地，存在可用于本发明的多种常规测定，其使用未经标记的本发明的抗体(一抗)和经标记的本发明的抗体(二抗)；这些技术包括western印迹或免疫印迹、elisa(酶联免疫吸附测定)、ria(放射免疫测定)、竞争性eia(竞争性酶免疫测定)、das‑elisa(双抗体夹心elisa)、免疫细胞化学和免疫组织化学技术、流式细胞术或基于使用包含本发明抗体的蛋白质微球、生物芯片或微阵列的多重检测技术。使用本发明的抗体检测和定量糖基化apoj的其他方式包括亲和色谱技术、配体结合测定或凝集素结合测定。[0287]还应理解，未经标记抗体需要用另外的试剂检测，例如，经标记的二抗将被标记。这是特别有用的以便提高检测方法的灵敏度，因为其允许信号被放大。[0288]另外，也可通过检测样品中由于抗体与其同源抗原的结合而发生的物理特性变化来进行抗体的检测。这些测定包括在样品中确定与透射有关的参数，这是本领域已知的。本文中使用的术语“与透射有关的参数”涉及指示样品的透射光与入射光的比率或与之相关的参数，或涉及从其导出的参数。[0289]在一个实施方案中，与透射有关的参数通过比浊法或通过浊度法确定。[0290]本文中使用的比浊法是指通过在入射光束通过溶液之后降低其强度来测量溶液中的光散射物质。对于比浊测定，吸收的光量变化(透射量的倒数)可与发生的凝集的量有关。因此，可容易地确定样品中分析物(引起凝集的物质)的量。[0291]本文中使用的浊度法是指用于通过偏离通过样品的入射光的角度的光强度来测量溶液中的光散射物质的技术。浊度测定通过测量从原点以给定角度(通常为90°)散射或反射的光的量，提供了在样品中测量分析物量的间接方法。在存在蛋白质抗原的情况下，抗体与抗原反应，并开始沉淀反应。在该沉淀反应时间顺序的早期进行测量。通过与先前建立的标准曲线进行比较获得定量值。为了提高检测的灵敏度，可将抗体吸附或共价附着于聚合物微球。这样，用更少的试剂就能产生更大的信号。[0292]根据本公开内容的基于比浊法或浊度法的检测方法对具有和不具有微粒增强的所有已知的凝集测试发挥作用。在本公开内容中通常使用的是“微粒增强的光散射凝集测试”，其也被称为“颗粒增强的比浊免疫测定”(particle‑enhancedturbidimetricimmunoassay，petia)。基于凝集的免疫测定常规地用于临床诊断中，用于在临床化学分析器上定量血清蛋白、治疗药物和滥用药物，因为它们具有不需要任何分离或洗涤步骤的准均质测定的益处。为了在反应混合物中增强待检测抗原与特异性抗体之间的光学检测，可将抗体与合适的颗粒连接。因此，抗原与被抗体包被的颗粒反应并与其凝集。随着抗体量提高，复合物的凝集和尺寸提高，进一步导致光散射的变化。[0293]在另一个实施方案中，抗体与其同源抗原的结合可通过表面等离子体共振(spr)来检测。[0294]本文中使用的spr是指当激光束辐照至金属薄膜时，反射光的强度在特定的入射角(即，共振角)处急剧降低的现象。spr是基于上述现象的测量方法，并且能够以高灵敏度测定吸附在作为传感器的金属薄膜的表面上的物质。根据本发明，例如，然后可通过将一种或更多种根据本发明的抗体预先固定在金属薄膜的表面上，使样品通过金属薄膜的表面，以及检测在样品通过所述表面之前和之后的由抗体和靶抗原的结合所导致的吸附在金属薄膜表面上的物质之量的差来检测样品中的靶物质。[0295]用于缺血组织损伤的诊断方法[0296]在第五方面中，本发明涉及用于在对象中诊断缺血或缺血性组织损伤的方法，其包括使用如本发明第一方面中所限定的抗体、根据本发明第三方面的组合物或使用如本发明第四方面中所限定的方法在所述对象的样品中确定糖基化apoj的水平，其中糖基化apoj相对于参考值的水平降低指示患者患有缺血或缺血性组织损伤。[0297]在本发明的上下文中，术语“诊断”涉及当应用如本文中所公开的方法时，对来自患有心肌缺血或与其相关的缺血性组织损伤的患者样品与来自未患有该损害和/或损伤的个体的样品进行辨别的能力。如本领域技术人员所理解的，该检测并非意在对所有样品100％正确。然而，其要求对所分析样品的统计学上显著数目进行正确分类。统计学上显著的量可由本领域的专家通过使用不同的统计学工具来设置，所述统计学工具例如但不限于置信区间的确定、p值确定、studentt检验和费希尔判别函数(discriminatingfunctionfisher)。优选地，置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或小于99％。优选地，p值小于0.05、0.01、0.005或0.0001。优选地，本发明可在至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的所受试的特定组或群体的对象中正确地检测缺血或缺血性损伤。[0298]术语“缺血”在本文中与“缺血性事件”可互换使用并且是指由于向器官或组织的血流降低或中断而导致的任何情况。缺血可以是短暂的或永久的。[0299]表述“缺血性组织损伤”、“缺血性组织损害”、“由于缺血引起的组织损伤”、“与缺血相关的组织损伤”、“由于缺血导致的组织损伤”、“由缺血引起的组织损伤”和“缺血性损伤的组织”是指由于一段时间缺血而对器官或组织或细胞的形态学、生理学和/或分子损伤。[0300]在一个实施方案中，由缺血引起的损伤是心脏组织的损伤。在又一个更优选实施方案中，心脏组织的损伤由心肌缺血引起。[0301]术语“心肌缺血”是指由冠状动脉粥样硬化和/或向心肌供氧不足引起的循环障碍(circulatorydisturbance)。例如，急性心肌梗死表示对心肌组织的不可逆缺血性损害。该损害导致冠状循环中的闭塞性(例如，血栓形成或栓塞)事件并且产生其中心肌代谢需求超过向心肌组织之氧供应的环境。[0302]在又一个实施方案中，心肌缺血是急性心肌缺血或微血管性心绞痛。[0303]本文中使用的术语“微血管性心绞痛”是指由于流过小心脏血管的血流不足引起的病症。[0304]在一个实施方案中，由缺血引起的损伤是脑组织的损伤。在另一个实施方案中，对脑组织的损伤是由缺血性卒中引起的。术语“缺血性卒中”是指由脑血管阻塞(导致脑缺氧)引起的脑功能的突然丧失，其特征在于肌控制丧失、感觉或意识减弱或丧失、头晕、言语不清或随着脑损伤的程度和严重性而改变的其他症状，也称为脑事故或脑血管事故。术语“脑缺血”(或“卒中”)也指脑供血不足，通常导致脑缺氧。[0305]在另一个实施方案中，怀疑患者患有缺血性事件。[0306]术语“对象”或“个体”或“动物”或“患者”包括期望治疗的任何对象，特别是哺乳动物对象。哺乳动物对象包括人、家养动物、农场动物和动物园动物或宠物动物，例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。在本发明的一个优选实施方案中，对象是哺乳动物。在本发明的一个更优选实施方案中，对象是人。[0307]本文中使用的术语“样品”或“生物样品”是指从对象分离的生物材料。所述生物样品包含适合于检测给定蛋白质(例如apoj)的糖基化形式的水平的任何生物材料。样品可从任何合适的组织或生物流体，例如血液、唾液、血浆、血清、尿、脑脊液(cerebrospinalliquid，csf)或粪便中分离。在本发明的一个具体实施方案中，样品是组织样品或生物流体。在本发明的一个更具体实施方案中，生物流体选自血液、血清或血浆。[0308]优选地，在以相关术语进行确定的情况下，用于确定apoj的不同糖基化形式之水平的样品是用于确定参考值的相同类型的样品。举例来说，如果在血浆样品中进行糖基化apoj的确定，则血浆样品也将用于确定参考值。如果样品是生物流体，则还将在相同类型的生物流体(例如，血液、血清、血浆、脑脊液)中确定参考样品。[0309]关于糖基化apoj的水平，术语“降低的水平”或“低水平”涉及在样品中使用根据本发明的抗体检出的糖基化apoj的任何表达水平低于参考值。因此，当糖基化apoj的表达水平低于其参考值至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％或更多时，认为糖基化apoj表达水平降低或低于其参考值。[0310]本发明的诊断方法包括将在研究对象中获得的水平与参考值进行比较，其中糖基化apoj相对于参考值的水平降低指示患者患有缺血或缺血性组织损伤。[0311]本文中使用的术语“参考值”涉及用作用于评价由从对象收集的样品获得的值或数据的参考的预定标准。参考值或参考水平可以是绝对值；相对值；具有上限或下限的值；一系列的值；平均值；中值；平均值；或与特定对照或基线值相比的值。参考值可基于单独样品值，例如如，从来自所受试对象的样品获得的但在较早时间点的值。参考值可基于大量样品，例如来自按实际年龄匹配组的对象群体，或基于包括或不包括待受试样品的样品库(pool)。在一个实施方案中，参考值对应于在健康对象中确定的糖基化apoj残基的水平，其中将健康对象理解为在确定糖基化apoj的水平时不显示缺血性组织损伤的对象，并且优选地，未显示出缺血性损伤的病史的对象。[0312]在另一个实施方案中，参考值对应于相应生物标志物的平均值或平均水平，所述生物标志物是从在临床观点上看良好记录的且没有疾病(特别是未患有缺血性组织损伤，特别是未患有缺血性心肌损伤或缺血性脑损伤)的患者组获得的样品库确定的。在所述样品中，可例如通过确定参考群体中的平均表达水平来确定表达水平。在确定参考值时，有必要考虑样品类型的一些特征，例如年龄、性别、身体状态或患者的其他特征。例如，参考样品可从相同量的至少2个、至少10个、至少100个至超过1000个个体的组中获得，以使得群体在统计学上是显著的。[0313]在一个优选实施方案中，根据本发明的诊断方法使用以下进行：ag2g‑17抗体、ag3g‑4抗体、ag4g‑6抗体、ag5g‑17抗体、ag6g‑1抗体、ag6g‑11抗体、ag7g‑17抗体、ag7g‑19抗体。[0314]在另一个实施方案中，本发明的诊断方法通过使用包含根据本发明的数种抗体的组合物来进行，以使得用于比较的值是与所使用的抗体中的每一种结合的合计值。在一些优选实施方案中，糖基化apoj的检测使用选自以下的组合物进行：[0315](i)包含ag2g‑17和ag6g‑1抗体的组合物，[0316](ii)包含ag2g‑17和ag6g‑11抗体的组合物，[0317](iii)包含ag2g‑17和ag7g‑19抗体的组合物，[0318](iv)包含ag2g‑17和ag1g‑11抗体的组合物，[0319](v)包含ag2g‑17和ag7g‑17抗体的组合物，[0320](vi)包含ag2g‑17和ag4g‑6抗体的组合物，[0321](vii)包含ag2g‑17和ag3g‑4抗体的组合物，或[0322](viii)包含ag2g‑17和ag5g‑17抗体的组合物。[0323]应理解，根据本发明的诊断方法用于诊断患者的参考值是从相同类型的样品以及与诊断中考虑的抗体相同的抗体获得的值。因此，如果通过使用ag2g‑17抗体确定糖基化apoj的水平来进行诊断方法，则诊断中使用的参考值也是在使用相同抗体时检出的糖基化apoj的表达水平。类似地，如果通过使用根据本发明的数种抗体的组合物确定糖基化apoj的水平来进行诊断方法，则诊断中使用的参考值也是从健康对象或从如上定义的样品库中获得的使用相同组合物(视情况而定)检出的糖基化apoj的表达水平。[0324]在另一个实施方案中，如果确定生物标志物以诊断心肌组织损伤，则参考值将是来自不显示心肌组织损伤且优选地没有患心肌组织损伤之记录的健康对象的相同生物标志物的水平。如果参考值是从来自对象的样品库获得的相同生物标志物的平均水平，则制备样品库的对象是不显示心肌组织损伤且优选没有患心肌组织损伤之记录的对象。[0325]在另一个实施方案中，如果确定生物标志物以诊断脑组织损伤，则参考值将是来自不显示脑组织损伤且优选没有患脑组织损伤之记录的健康对象的相同生物标志物的水平。如果参考值是从来自对象的样品库中获得的相同生物标志物的平均水平，则获得样品库的对象是不显示脑组织损伤且优选没有患脑组织损伤之记录的对象。[0326]可优化本发明的诊断方法中使用的参考值以获得期望的特异性和灵敏度。[0327]在一个优选实施方案中，在可以在样品中检出坏死标志物的提高可检测之前，进行糖基化apoj的水平的确定。在一个优选实施方案中，坏死标志物是t‑肌钙蛋白或ck。在又一个实施方案中，在缺血损伤的症状发作的1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、30小时、40小时、50小时或更长时间内获得的样品中进行糖基化apoj水平的确定。在一个优选实施方案中，在心肌缺血性损伤的情况下，症状通常是胸痛、呼吸短促、发汗、虚弱、头晕目眩(light‑headedness)、恶心、呕吐和心悸。在一个实施方案中，患者是ami前患者。[0328]在另一个实施方案中，根据本发明的诊断方法的糖基化apoj水平的确定在来自患者的样品中进行，所述样品在患者施用旨在降低缺血或降低缺血性组织损伤的任何药物之前获得。在一个实施方案中，在心肌组织损伤的情况下，糖基化形式的apoj的水平的确定在来自患者的样品中进行，所述样品在患者用他汀类、抗血小板剂和/或抗凝血剂治疗之前获得。[0329]在又一个优选实施方案中，所述确定在所怀疑的缺血性事件发生之后的前6小时内、在至少一种坏死标志物的水平升高之前和/或在患者已接受针对所怀疑的缺血性事件的任何治疗之前进行。[0330]用于对患有缺血性损伤的患者进行预后的方法[0331]在第六方面中，本发明涉及用于在已患有缺血性事件的患者中预测缺血的进展或用于确定已患有缺血性事件的患者的预后的方法，其包括使用如本发明第一方面中限定的抗体，根据本发明第三方面的组合物或使用如本发明第四方面中限定的方法在所述患者的样品中确定糖基化apoj的水平，其中糖基化apoj相对于参考值的水平降低指示缺血正在进展或患者的预后不良。[0332]在一个优选实施方案中，根据本发明的预后方法使用以下进行：ag1g‑11抗体、ag2g‑17抗体、ag3g‑4抗体、ag4g‑6抗体、ag5g‑17抗体、ag6g‑1抗体、ag6g‑11抗体、ag7g‑17抗体、ag7g‑19抗体。[0333]在另一个实施方案中，本发明的预后方法通过使用包含根据本发明的数种抗体的组合物来进行，以使得用于比较的值是与所使用的抗体中的每一种结合的合计值。在一些优选实施方案中，糖基化apoj的检测使用选自以下的组合物进行：[0334](i)包含ag2g‑17和ag6g‑1抗体的组合物，[0335](ii)包含ag2g‑17和ag6g‑11抗体的组合物，[0336](iii)包含ag2g‑17和ag7g‑19抗体的组合物，[0337](iv)包含ag2g‑17和ag1g‑11抗体的组合物，[0338](v)包含ag2g‑17和ag7g‑17抗体的组合物，[0339](vi)包含ag2g‑17和ag4g‑6抗体的组合物，[0340](vii)包含ag2g‑17和ag3g‑4抗体的组合物，或[0341](viii)包含ag2g‑17和ag5g‑17抗体的组合物。[0342]在本发明的上下文中，术语“预测进展”涉及当应用本文中公开的方法时在患有缺血或与其相关的缺血性组织损伤之后预测疾病进程的能力。如本领域技术人员所理解的，该检测不意在对所有样品100％正确。然而，它要求所分析样品的统计学上显著数目必须被正确分类。统计学上显著的量可由本领域的专家通过使用不同的统计学工具来设置，所述统计学工具例如但不限于置信区间的确定、p值确定、studentt检验和费希尔判别函数。优选地，置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或小于99％。优选地，p值小于0.05、0.01、0.005或0.0001。优选地，本发明可在至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的所受试的特定组或群体的对象中正确地检测缺血或缺血性损伤。[0343]在本发明的上下文中，术语“确定预后”与“预后”可互换使用，涉及当应用本文中所公开的方法时预测患有心肌缺血或脑缺血或与其相关的缺血性组织损伤之后患者的结局的能力。如本领域技术人员所理解的，该检测并非意在对所有样品100％正确。然而，它要求所分析的样品的统计学上显著数目被正确分类。统计学上显著的量可由本领域的专家通过使用不同的统计学工具来设置，所述统计学工具例如但不限于置信区间的确定、p值确定、studentt检验和费希尔判别函数。优选地，置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或小于99％。优选地，p值小于0.05、0.01、0.005或0.0001。优选地，本发明可在至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的所受试的特定组或群体的对象中正确地检测缺血或缺血性损伤。[0344]在一个优选实施方案中，缺血性事件是心肌缺血性事件。在又一个优选实施方案中，心肌缺血性事件是st抬高型心肌梗死。[0345]在一个实施方案中，以6个月复发的风险来确定患者的预后。在确定6个月复发风险的情况下，应理解复发是指在第一次缺血性事件之后的前6个月内发生第二次缺血性事件。在一个实施方案中，第二次缺血性事件是与第一次缺血性事件相同的类型，即第一次缺血性事件是心肌缺血，并且以患者患第二次心肌缺血性事件的风险来确定预后。在另一个实施方案中，第二次缺血性事件是与第一次缺血性事件不同的类型，即如果第一次缺血性事件是心肌缺血，则以患者患脑缺血性事件的风险来确定预后，或者反之亦然，如果第一次缺血性事件是脑缺血性事件，则以患者患心肌缺血性事件的风险来确定预后。[0346]在又一个优选实施方案中，以6个月复发的风险、住院死亡的风险或6个月死亡的风险来确定患者的预后。[0347]在另一个实施方案中，以院内死亡的风险来确定患者的预后。[0348]在一个优选的实施方案中，以6个月死亡的风险来确定患者的预后。[0349]当涉及本发明的预后方法时，术语“参考值”涉及用作用于评价从对象收集的样品获得的值或数据的参考的预定标准。参考值或参考水平可以是绝对值；相对值；具有上限或下限的值；一系列的值；平均值；中值；平均值；或与特定对照或基线值相比的值。参考值可基于单独样品值，例如如，从来自所受试对象的样品获得的但在较早时间点的值。参考值可基于大量样品，例如来自按实际年龄匹配组的对象群体，或基于包括或不包括待受试样品的样品库。在一个实施方案中，参考值对应于在患有缺血性事件且其中缺血未进展或者具有良好进展的对象中确定的糖基化apoj的水平。在以6个月复发风险来确定进展的情况下，参考值可被视为在缺血性事件时刻取得的来自患者的样品中的糖基化apoj水平，但其中患者在第一次缺血性事件发生之后至少6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、18个月、24个月、36个月、48个月或更长时间内未患有任何另外的缺血性事件。在另一个实施方案中，当以住院死亡的风险来确定进展时，参考值可被视为在缺血性事件发生时患者中糖基化apoj的水平，但其中患者已经从医院出院。在以6个月死亡风险来确定进展的情况下，参考值可被视为在缺血性事件时取得的来自患者样品中糖基化apoj的水平，但其中患者在缺血性事件之后仍然存活至少6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、18个月、24个月、36个月、48个月或更长时间。[0350]在另一个实施方案中，参考值对应于从以下患者组获得的样品库确定的相应生物标志物的平均值或平均水平，所述患者从临床观点上看良好记录的并且其在患有缺血性事件之后显示出如上文段落中限定的良好预后。在所述样品中，可例如通过确定参考群体中的平均表达水平来确定表达水平。在确定参考值时，有必要考虑样品类型的一些特征，例如患者的年龄、性别、身体状态以及其他特征。例如，参考样品可从相同量的至少2个、至少10个、至少100个至超过1000个个体的组中获得，以使得群体在统计学上是显著的。[0351]应理解，根据本发明的预后方法用于患者预后的参考值是从相同类型的样品以及使用与来自所分析患者的样品中使用的抗体或抗体组合物相同的抗体或抗体组合物获得的值。因此，如果通过使用ag2g‑17抗体确定糖基化apoj的水平来进行预后方法，则预后中使用的参考值也是在使用相同抗体时检出的糖基化apoj的表达水平。类似地，如果通过使用根据本发明的数种抗体的组合物确定糖基化apoj的水平来进行预后方法，则预后中使用的参考值也是从健康对象或从如上定义的样品库中获得的使用相同组合物(视情况而定)检出的糖基化apoj的表达水平。[0352]在另一个实施方案中，如果确定生物标志物以确定已患有心肌组织损伤的患者的预后，则参考值将是来自对象的相同生物标志物的水平，所述对象在患有心肌缺血性事件之后显示符合上文限定的任何标准(6个月之后没有缺血性事件的复发、6个月之后没有院内死亡或死亡)的良好预后。如果参考值是从来自对象的样品库获得的相同生物标志物的平均水平，则制备样品库的对象是在患有心肌缺血性事件之后已经显示出符合上述限定的任何标准(6个月之后没有缺血性事件的复发、6个月之后没有院内死亡或死亡)的良好预后的对象。[0353]在另一个实施方案中，如果确定生物标志物以确定脑组织损伤的预后，则参考值将是来自对象的相同生物标志物的水平，所述对象在患有脑缺血性事件之后已经显示出符合上述限定的任何标准(6个月之后没有缺血性事件的复发、6个月之后没有院内死亡或死亡)的良好预后。如果参考值是从来自对象的样品库获得的相同生物标志物的平均水平，则制备样品库的对象是在患有脑缺血性事件之后已经显示出符合上述限定的任何标准(6个月之后没有缺血性事件的复发、6个月之后没有院内死亡或死亡)的良好预后的对象。[0354]可优化本发明的预后方法中使用的参考值以获得期望的特异性和灵敏度。[0355]本发明的风险分层方法[0356]本发明的作者还表明，使用根据本发明的抗体和组合物确定的糖基化apoj的水平也是用于确定患有稳定型冠状动脉疾病(cad)的患者患复发性缺血性事件之风险的可用生物标志物。该方法允许根据患者患有缺血性事件的风险对患者进行分层，并因此可用于根据风险为患者指定特定的预防性治疗。[0357]在第七方面中，本发明涉及用于确定患有稳定型冠脉疾病的患者患复发性缺血性事件之风险的方法，其包括使用如本发明第一方面中限定的抗体、根据本发明第三方面的组合物、或使用如本发明第四方面中限定的方法在所述患者的样品中确定糖基化apoj的水平，其中糖基化apoj相对于参考值的水平降低指示患者显示出患复发性缺血性事件的风险提高。[0358]在一个优选实施方案中，根据本发明的风险分层方法使用以下进行：ag1g‑11抗体、ag2g‑17抗体、ag3g‑4抗体、ag4g‑6抗体、ag5g‑17抗体、ag6g‑1抗体、ag6g‑11抗体、ag7g‑17抗体、ag7g‑19抗体。[0359]在另一个实施方案中，本发明的风险分层方法通过使用包含根据本发明的数种抗体的组合物来进行，以使得用于比较的值是与所使用的抗体中的每一种结合的合计值。在一些优选实施方案中，糖基化apoj的检测使用选自以下的组合物进行：[0360](i)包含ag2g‑17和ag6g‑1抗体的组合物，[0361](ii)包含ag2g‑17和ag6g‑11抗体的组合物，[0362](iii)包含ag2g‑17和ag7g‑19抗体的组合物，[0363](iv)包含ag2g‑17和ag1g‑11抗体的组合物，[0364](v)包含ag2g‑17和ag7g‑17抗体的组合物，[0365](vi)包含ag2g‑17和ag4g‑6抗体的组合物，[0366](vii)包含ag2g‑17和ag3g‑4抗体的组合物，或[0367](viii)包含ag2g‑17和ag5g‑17抗体的组合物。[0368]在本发明的上下文中，术语“确定风险”或“风险分层”涉及当应用本文中公开的方法时确定以下风险或概率的能力：a)患者在患有心肌缺血或脑缺血或与其相关的缺血性组织损伤之后患另外的临床并发症，和/或b)受益于心肌缺血或脑缺血或与其相关的缺血性组织损伤的特定治疗。如本领域技术人员所理解的，该检测并非意在对所有样品100％正确。然而，它要求对所分析样品的统计学上显著数目进行正确分类。统计学上显著的量可由本领域的专家通过使用不同的统计学工具来设置，所述统计学工具例如但不限于置信区间的确定、p值确定、studentt检验和费希尔判别函数。优选地，置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或小于99％。优选地，p值小于0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。优选地，本发明可在至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的所受试的特定组或群体的对象中正确地检测缺血或缺血性损伤。[0369]术语“稳定型冠脉疾病(stablecoronarydisease)”和“稳定型冠心病(stablecoronaryheartdisease)”具有相同的含义并且可互换使用。这两个术语都包括医学病症稳定型冠状动脉疾病(stablecoronaryarterydisease，scad)。在术语“稳定型心血管疾病”、“稳定型冠脉疾病”或“稳定型冠心病”的上下文中，“稳定型”被定义为在不存在急性心血管事件的情况下诊断的心血管疾病的任何病症。因此，例如，稳定型冠脉疾病限定了冠脉疾病的不同演变阶段，不包括冠状动脉血栓形成在临床表现中占主导地位(急性冠脉综合征)的情况。患有scad的患者由以下病症中的一种或更多种限定：阳性egg应激测试或阳性心肌闪烁显像(myocardialscintigraphy)或冠状动脉狭窄＞50％下的稳定型心绞痛、急性冠脉综合征病史、冠状动脉血运重建史、以稳定剂量通过抗血小板剂、抗凝血剂和/或他汀类治疗至少3个月。[0370]在一个优选实施方案中，患有稳定型冠脉疾病的患者在稳定型冠脉疾病之前患有急性冠脉综合征。在一些优选实施方案中，患有稳定型冠脉疾病的患者在稳定型冠脉疾病之前至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、18个月、24个月、36个月、48个月、60个月或更长时间已患有急性冠脉综合征。[0371]当涉及本发明的风险分层方法时，术语“参考值”涉及用作用于评价由从对象收集的样品获得的值或数据的参考的预定标准。参考值或参考水平可以是绝对值；相对值；具有上限或下限的值；一系列的值；平均值；中值；平均值；或与特定对照或基线值相比的值。参考值可基于单独样品值，例如如，从来自所受试对象的样品获得的但在较早时间点的值。参考值可基于大量样品，例如来自按实际年龄匹配组的对象群体，或基于包括或不包括待受试样品的样品库。在一个实施方案中，参考值对应于在患有稳定型冠脉疾病但未患有任何复发性缺血性事件的对象中确定的糖基化apoj的水平。在这种情况下，可从中确定参考值的合适患者是患有稳定型冠脉疾病且在稳定型冠脉疾病发作之后至少6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、18个月、24个月、36个月、48个月或更长时间未患缺血性复发事件的患者。[0372]在另一个实施方案中，参考值对应于由从以下患者组获得的样品库确定的相应生物标志物的平均值或平均水平，所述患者从临床观点上看良好记录且患有稳定型冠脉疾病，但在稳定型冠脉疾病发作之后至少6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、18个月、24个月、36个月、48个月或更长时间内未患复发性缺血性事件。在所述样品中，可例如通过确定参考群体中的平均表达水平来确定表达水平。在确定参考值时，有必要考虑样品类型的一些特征，例如患者的年龄、性别、身体状态等。例如，参考样品可从相同量的至少2个、至少10个、至少100个至超过1000个个体的组中获得，以使得群体在统计学上是显著的。[0373]应理解，根据本发明的方法用于风险分层的参考值是从相同类型的样品以及使用与来自所分析患者的样品中使用的抗体或抗体组合物相同的抗体或抗体组合物获得的值。因此，如果通过使用ag2g‑17抗体确定糖基化apoj的水平来进行风险分层方法，则在风险分层中使用的参考值也是在使用相同抗体时检出的糖基化apoj的表达水平。类似地，如果通过使用根据本发明的数种抗体的组合物确定糖基化apoj的水平来进行风险分层方法，则在风险分层中使用的参考值也是从健康对象或从如上定义的样品库中获得的使用相同组合物(视情况而定)检出的糖基化apoj的表达水平。[0374]在一个优选实施方案中，患有稳定型冠脉疾病的患者在稳定型冠脉疾病之前已经患有急性冠脉综合征。[0375]在又一个优选实施方案中，复发性缺血性事件是急性冠脉综合征、卒中或短暂性缺血性事件。[0376]在第七方面中，本发明涉及根据本发明的第一方面的抗体或根据本发明的第三方面的组合物用于在患者中诊断缺血或缺血性组织损伤、用于在已患有缺血性事件的患者中确定缺血的进展、用于对已患有缺血性事件的患者进行预后或用于确定患有稳定型冠脉疾病的患者患复发性缺血性事件之风险的用途。[0377]在第八方面中，本发明涉及根据本发明的第一方面的抗体或根据本发明的第三方面的组合物用于在患者中诊断缺血或缺血性组织损伤、用于在已患有缺血性事件的患者中确定缺血的进展、用于对已患有缺血性事件的患者进行预后或用于确定患有稳定型冠脉疾病的患者患复发性缺血性事件之风险的用途。[0378]将通过以下实施例描述本发明，所述实施例应被认为仅是举例说明性的而非限制本发明的范围。[0379]实施例[0380]材料和方法[0381]针对apoj‑glcnac的特异性单克隆抗体(mab)的开发[0382]通过噬菌体展示，已经开发了针对在apoj序列中包含7个糖基化位点的7种糖基化肽的特异性单克隆抗体(图2)。具体地，已经开发了针对每个特异性位点的一种抗体以及针对位点6和7的两种另外的克隆。[0383]对mab用于不同apoj‑glcnac形式的定量以用于缺血检测的验证[0384]患者群体[0385]验证研究包含患有新发作st抬高型心肌梗死(st‑elevationmyocardialinfarction，stemi)的患者组，所述患者在疼痛发作之后前6小时内在急诊室就诊，并在入院时显示出阴性常规肌钙蛋白t(conventionaltroponint，ctn‑t)水平(不包括亚急性心肌梗死)，并随后在第一采血(ami前缺血)之后上升高于参考上限99％。[0386]将无任何先前心血管疾病表现的健康供体组用作对照组。对照组和ami前缺血患者的人口统计学和临床特征示于表2中。[0387]表2：验证研究中包含的患者。除非说明，否则值表示为平均值和sem。[0388][0389]圣克鲁斯保罗医院的伦理委员会(ethicscommitteeofthesantacreuisantpauhospital)批准了该项目，并根据赫尔辛基宣言(helsinki’sdeclaration)的原则进行了研究。所有参与者均签署了知情同意书以参加研究。[0390]样品收集与制备[0391]收集来自患者和健康个体的新鲜抽取静脉血样品，以制备血清，并将其等分并在‑80℃下储存。[0392]用特异性mab对不同apoj‑glcnac形式进行定量[0393]用基于针对不同apoj‑glcnac残基的不同mab的免疫测定，对ami前缺血患者和健康对照的血清样品中不同apoj‑glcnac形式的水平进行测量。该方法基于：[0394]1)第一步，其中通过apoj蛋白序列内的特异性糖基化残基与每种特异性mab的特异性结合，将apoj‑glcnac固定；[0395]2)第二步，其中用针对apoj蛋白序列的特异性市售生物素化抗体(ab69644，abcam)检测经固定的apoj；以及[0396]3)最后一步，其中通过由链霉抗生物素蛋白‑hrp缀合物(21130，pierce)与生物素化抗体反应组成的报道系统进一步对特异性固定化糖基化apoj形式的量进行定量。[0397]用凝集素对总apoj‑glcnac水平进行定量[0398]用基于凝集素的免疫测定对ami前缺血患者和健康对照的血清样品中总apoj‑glcnac形式的水平进行测量。该方法基于：[0399]1)第一步，其中蛋白质与经固定的曼陀罗(d.stramonium)凝集素结合，[0400]2)第二步，其中用针对apoj蛋白序列的单克隆或多克隆抗体检测apoj，以及[0401]3)最后一步，其中通过报道系统或分子进一步对经固定糖基化apoj形式的量进行检测和定量。该报道系统基于二抗以及报道系统，例如生物素‑链霉抗生物素蛋白‑hrp。[0402]统计学分析[0403]除非在指出时，否则数据均表示为平均值和标准误差。n表示受试的对象的数目。使用statview5.0.1软件进行统计学分析。使用studentt检验进行组之间的比较。在任何期望值小于5时，卡方检验(χ2)或费希尔精确检验(fisher’sexacttest)用于分类变量。用ibmspss统计学v19.0进行受试者操作特征(receiveroperatingcharacteristic，roc)曲线(以评估所选变量的分辨能力)。p值＜0.05被认为是显著的。[0404]结果[0405]单克隆抗体开发[0406]图2示出了用于开发针对7个apoj‑glcnac糖基化位点的特异性单克隆抗体的方法学手段的示意图。[0407]1.免疫文库构建[0408]每个靶糖基化位点的五种类型的肽(图1)已以不同的形式(裸糖基化肽、bsa缀合的糖基化肽和生物素缀合的糖基化肽、裸肽和生物素缀合的非糖基化肽)合成。然后，使用每种bsa缀合的糖基化肽将兔单独免疫接种7次。之后，进行取血，并使用生物素缀合的肽作为阳性对照，用生物素缀合的糖基化肽进行抗血清滴定以监测免疫应答。用于滴定的肽序列列于表3中。[0409]表3：用于滴定的肽[0410]肽编号肽序列ag1gbio‑reirhn(glcnac)stgcag1bio‑reirhnstgcag2gbio‑edaln(glcnac)etresag2bio‑edalnetresag3gbio‑pgvcn(glcnac)etmmaag3bio‑pgvcnetmmaag4gbio‑eefln(glcnac)qsspag4bio‑eeflnqsspag5gbio‑srlan(glcnac)ltqgeag5bio‑srlanltqgeag6gbio‑cstnn(glcnac)psqakag6bio‑cstnnpsqakag7gbio‑wkmln(glcnac)tssleag7bio‑wkmlntssle[0411]针对所有7种生物素缀合的糖基化肽的抗血清的效价高于生物素缀合的肽的效价，这意味着它们可用于抗体噬菌体展示文库的构建。[0412]然后，构建免疫文库。从脾中分离rna。通过pcr扩增vκ、vh、cκ和ch1，以及装配fab编码基因并将其克隆到pcdisplay‑11中用于文库构建。如表4中所总结的，文库多样性达到2.8×108。进行qc集落pcr以测定末端文库的插入率。[0413]表4：末端文库的总结[0414]多样性阳性插入率效价(cfu)2.8×10814/202.9×1013[0415]进行qc集落pcr以测定末端文库的插入率，阳性率为14/20。然后对dna进行测序。[0416]2.文库筛选[0417]在成功构建兔/人嵌合fab文库之后，进行筛选阶段。完成了两轮生物淘选(biopanning)。为了消除与非糖基化位点和非特异性糖基化位点结合的结合剂，首先针对噬菌体文库进行7种生物素缀合的非糖基化肽(ag1、ag2、ag3、ag4、ag5、ag6、ag7)的混合和生物素缀合的糖基化肽(agng，n＝1至7，除靶肽之外)的混合。然后筛选阳性靶标以进行富集。[0418]为了降低背景，如下对实验条件进行优化。(1)首先针对噬菌体文库进行未封闭的链霉抗生物素蛋白包被的孔和封闭的链霉抗生物素蛋白包被的孔，然后进行(ag1、ag2、ag3、ag4、ag5、ag6、ag7)混合和(agng，n＝1至7，除靶肽之外)混合。(2)筛选阳性靶标以富集。(3)更改封闭缓冲液，并且还延长封闭时间。(4)延长洗涤次数和时间。[0419]在针对7种靶标(ag1g、ag2g、ag3g、ag4g、ag5g、ag6g、ag7g)进行三轮生物淘选之后，使用第1轮、第2轮和第3轮的输出进行多克隆噬菌体elisa。然后，在方案优化之后再次进行多克隆噬菌体elisa。为了进一步降低非特异性结合剂，针对第1轮、第2轮和第3轮的输出进行(ag1、ag2、ag3、ag4、ag5、ag6、ag7)混合和(agng，n＝1至7，除靶肽之外)混合，然后孵育。[0420]3.结合剂验证[0421]随机选择针对7种靶标的来自3rd‑p生物筛选的20种克隆。采用沉淀在培养基中使用噬菌体进行qc单克隆噬菌体elisa。结果表明，对6种靶标(ag1g、ag2g、ag4g、ag5g、ag6g、ag7g)总共鉴定出17/59种独特克隆。其中有，ag1g的2种克隆、ag2g的2种克隆、ag4g的4种克隆、ag5g的2种克隆、ag6g的3种克隆和ag7g的4种克隆。然而，对于ag3g的靶标，在第一轮中未鉴定出完整的抗体序列。此外，剩余的42/59种克隆是相同的序列，其是具有一部分vh结构域的不完整的抗体序列，并且非特异性地存在于所有靶标中。[0422]在第二轮中，挑选出来自ag3g组的另外5种克隆进行测序。在分析这5种克隆的序列之后，其中4种克隆是相同的非特异性序列(正如与其他6种靶标所发生的)。鉴定出一种阳性克隆，并且抗体序列是完整的。[0423]然后，针对7种靶标的所选择克隆，我们进行了可溶性elisa。在单克隆噬菌体elisa中鉴定出针对每种靶标(ag1g至ag5g)的一种阳性克隆，以及针对靶标ag6g和ag7g的两种阳性克隆。构建表达载体并进行使用细胞裂解物进行的可溶性elisa。[0424]4.igg产生和验证[0425]产生了以igg形式的9种克隆(ag1g‑11、ag2g‑17、ag3g‑4、ag4g‑6、ag5g‑17、ag6g‑1、ag6g‑11、ag7g‑17和ag7g‑19)并进行qcelisa。最后，所有9种igg均显示与前述的qc可溶性elisa一致的结果。此外，与其他结合剂(针对其相应的靶标)相比，针对ag6g的两种igg显示出更多的区别差异。单克隆抗体的命名和相应的结合糖基化位点示于表5中。[0426]表5：通过噬菌体展示，通过最终产生的克隆检出的特异性apoj糖基化位点[0427][0428]针对存在缺血的分辨能力[0429]为了测试对包含glcnac的apoj序列的特异性糖基化残基的检测的分辨能力，针对ami前缺血患者(n＝38)和健康对照(n＝40)的血清样品用靶向7个不同的糖基化位点的每种特异性克隆运行elisa测试。与使用基于凝集素的免疫测定对总apoj‑glcnac水平进行定量相比，用靶向每种单独糖基化残基的特异性抗体对每种apoj‑glcnac形式进行定量显示，与对照对象相比，ami前缺血患者中降低最强(图3和4以及表6)。[0430]表6：样品的回顾性分析。[0431][0432]以任意单位(arbitraryunit，au)的光密度(opticaldensity，od)的平均值，其表明在以下情况下测量的健康对照和ami前缺血患者的血清样品中apoj‑glcnac水平的强度：a)用检测总apoj‑glcnac水平的基于凝集素的免疫测定(灰色行)和b)用靶向每种单独apoj‑glcnac糖基化残基的特异性抗体。用针对每种单独apoj‑glcnac糖基化残基的特异性mab进行检测显示，在早期缺血性阶段中在ami患者中apoj‑glcnac水平降低最强。[0433]具体地，用针对糖基化残基2(克隆ag2g‑17)和6(克隆ag6g‑1)的mab检测apoj‑glcnac显示在早期缺血性阶段中在ami患者中apoj‑glcnac水平的降低最强。此外，表6示出了针对具有glcnac残基的apoj的所有mab对apoj‑glyc水平降低的检测具有更好的分辨能力，其显示与凝集素相比，ami前缺血患者中apoj‑glyc降低％更高：49至76mab与46凝集素(图4)。[0434]c统计学分析揭示了用靶向每种单独apoj‑glcnac糖基化残基的特异性抗体在血清样品中检测apoj‑glcnac水平对缺血性事件之存在的高分辨能力。单独mab的roc分析显示auc(曲线下面积)值为0.751至0.918，并且灵敏度和特异性的百分比很高(表7)。[0435]表7：c统计学roc分析结果单独mab。[0436][0437]c统计学接收者操作曲线(roc)分析以及相关的灵敏度和特异性，其表明用靶向每种单独apoj‑glcnac糖基化残基的特异性抗体在血清样品中检测apoj‑glcnac水平对缺血性事件之存在的分辨能力。auc：曲线下面积；ci：置信区间。[0438]为了测试不同糖基化残基的组合是否可提高用于判别缺血之存在的apoj‑glcnac定量方法的灵敏度和特异性，进行了对单独mab测量的所有可能组合的roc分析。图5示出了6种组合的roc曲线，其表明对检测缺血性事件之存在的高分辨能力。重要地，与用基于凝集素的免疫测定对总apoj‑glcnac水平进行定量相比，用靶向单独糖基化残基的特异性抗体检测不同apoj‑glcnac形式的组合显示对检测缺血性事件的更高分辨能力(表8)。具体地，用与克隆ag6g‑1、ag6g‑11、ag7g‑19和ag1g‑11组合的克隆ag2g‑17检测apoj‑glcnac血清水平的组合显示检测缺血的最大分辨能力(95％置信区间达到值1.000)。[0439]表8：c统计学roc分析结果mab组合。[0440][0441]c统计学接收者操作曲线(roc)分析以及相关的灵敏度和特异性，其表明在血清样品中检测apoj‑glcnac水平时对缺血性事件之存在的分辨能力。与用基于凝集素的免疫测定对总apoj‑glcnac水平的定量相比，靶向单独apoj‑glcnac糖基化残基的特异性抗体的组合显示出更高的检测缺血的特异性。auc：曲线下面积；ci：置信区间。[0442]与特异性识别存在于apoj中的n‑聚糖的凝集素相比，靶向apoj中7个不同糖基化位点的mab显示出改善的缺血之存在的分辨能力[0443]为了测试对包含glcnac的apoj序列的特异性糖基化残基检测的分辨能力，针对ami前缺血患者(n＝38)和健康对照(n＝40)的血清样品用靶向7个不同糖基化位点的每种特异性克隆运行elisa测试。用基于曼陀罗凝集素的免疫测定对总apoj‑glcnac水平进行定量的结果示于表9中。[0444]表9：基于凝集素的免疫测定的特异性。[0445][0446]用c统计学接收者操作曲线(roc)分析获得的特异性值，其表明在以下两个患者群组中用基于凝集素在血清样品中检测apoj‑glcnac水平对缺血性事件之存在的分辨能力：ami前缺血患者和stemi患者。*对于普通小麦(triticumvulgaris)凝集素为53％；对于曼陀罗(daturastramonium)凝集素为72％。[0447]与用基于凝集素的免疫测定对总apoj‑glcnac水平进行定量相比(表9)，用靶向每种单独糖基化残基的特异性抗体对每种apoj‑glcnac形式进行定量显示，与对照对象相比，在ami前缺血患者中的降低最强(参见图3和4以及表6)。具体地，用针对糖基化残基2(克隆ag2g‑17)和6(克隆ag6g‑1)的mab检测apoj‑glcnac显示出在早期缺血性阶段中在ami患者中apoj‑glcnac的水平降低最强。[0448]c统计学分析揭示了用靶向每种单独apoj‑glcnac糖基化残基的特异性抗体在血清样品中检测apoj‑glcnac水平对缺血性事件之存在的高分辨能力。单独mab的roc分析显示auc(曲线下面积)值为0.751至0.918，并且特异性百分比高于凝集素(74至82％mab与53至72凝集素)(比较表7中mab检测测定中的特异性值与表9中凝集素测定中的特异性值)。[0449]mab结合来自血清的天然apoj，但不结合其他重度n‑glcnac糖基化蛋白[0450]还针对其他重度n‑glcnac糖基化蛋白(例如白蛋白和运铁蛋白)测试了mab特异性。为此，将从人血浆和血清纯化的2μg的任一者天然apoj蛋白、白蛋白和运铁蛋白用窄口移液器尖端加载到硝酸纤维素膜中。在干燥之后，通过浸渍于tbs‑t中的5％bsa中(在室温下1小时)来封闭非特异性位点。将膜与ag2g‑17或ag6g‑11克隆(因为它们是显示出特异性‑灵敏度最佳组合的克隆)在室温下孵育30分钟。在用tbs‑t进行3次洗涤之后，将膜和与hrp缀合的二抗在室温下孵育30分钟。最后，进行用tbs‑t的3次洗涤(1×15分钟和2×5分钟)，然后用tbs洗涤(5分钟)。将膜与supersignal孵育，并将其在chemidoc中暴光。[0451]单克隆抗体与来自血浆和血清的天然apoj结合，但不与其他重度n‑glcnac糖基化蛋白(例如白蛋白和运铁蛋白)结合，其表明单克隆抗体针对糖基化apoj的特异性(图6)。相反，按照定义，凝集素与所有糖基化蛋白质均非特异性结合，而与氨基酸序列无关。当前第1页12当前第1页12