响应面法优化超声波辅助法提取苜蓿总酚的方法与流程

1.本发明涉及植物加工领域，具体为响应面法优化超声波辅助法提取苜蓿总酚的方法。


背景技术：

2.随着对紫花苜蓿(medicago sativa)的酚类、黄酮类、皂甙、多糖、膳食纤维及维生素e等多种天然生物活性成分的深入研究，加之苜蓿草地产量高，植物功能性物质的开发和利用愈发受到人们的关注。紫花苜蓿的酚类化合物是种类繁多且具有重要生理功能的化合物，它不仅具有天然的较强的抗氧化性和多种药用价值，可用于天然抗氧化剂、天然色素、功能食品等；昆虫取食刺激条件下，酚类化合物在植物防御性次生代谢、信号转导等方面起着重要的调控作用，为研制环保量型抗虫害药剂提供了理想的原料。除此之外，研究表明酚类物质可以抑制昆虫的生长，总酚含与植物抗虫性密切相关。也有研究指出接种蓟马取食刺激可以诱导苜蓿的总酚含量升高，进而提高抗虫性。基于此，本专利以紫花苜蓿为材料，利用苜蓿接种蓟马取食刺激辅助超声波法优化总酚提取的方法，确定了优化的技术参数和工艺条件，提高苜蓿总酚提取量，在生产实践上具有十分重要的意义。
3.目前，植物总酚的提取方法有很多，常用的提取方法包括热水浸提法、碱液提取法、回流法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法和高效液相色谱法等。利用水加热法提取蓟马取食刺激后的紫花苜蓿总酚时，苜蓿叶片的总酚含量在20～30mg
·
g
‑1，虽然这种方法简单、成本低，但存在提取率低、溶出杂质多等缺点。采用超声波辅助70％丙酮提取法提取蓟马取食刺激后的紫花苜蓿总酚时，苜蓿叶片的总酚含量达到80～90mg
·
g
‑1。尽管超声波辅助丙酮提取法提高了总酚提取量，但丙酮属于危险化学药品，易燃、易制毒，对人的身体危害极大。除此之外，微波辅助提取法由于仪器的特殊性，使用时注意事项较多，且不能进行大规模提取；高效液相色谱法虽然具有较高的准确性和灵敏度，但成本高、不适合快速检测和大规模提取。鉴于此，亟需研究有效的能够提高苜蓿总酚提取的新方法、新工艺来满足大规模工业化生产。


技术实现要素：

4.针对上述现有技术的缺陷，本发明提供了响应面法优化超声波辅助法提取苜蓿总酚的方法，可以有效缩短萃取时间、增加提取率、降低成本。
5.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
6.响应面法优化超声波辅助法提取苜蓿总酚的方法，将风干粉碎后的紫花苜蓿加入到乙醇中，通过超声波提取；其中，紫花苜蓿和乙醇的固液比为1:20，乙醇体积分数为60％，紫花苜蓿在乙醇中的浸提时间为45min，提取温度为60℃。
7.所述紫花苜蓿生长至分枝期，在每根枝条接蓟马成虫，并于接蓟马第5d后取植株的地上部分，风干后将茎叶粉碎，过筛，用来测定总酚含量。
8.所述粉碎后的紫花苜蓿加入到乙醇中，通过数控超声波清洗浴提取，并将提取后
的提取液离心处理。
9.所述离心液加入水和福林酚试剂反应后，再加入碳酸钠溶液，进行吸光度测定。
10.所述紫花苜蓿和乙醇的固液比、乙醇体积分数、紫花苜蓿在乙醇中的浸提时间以及提取温度的最优组合采用四因素三水平的box
‑
behnken响应面设计。
11.本发明的有益效果为：1)与水加热提取总酚的方法相比该方法明显提高了蓟马取食刺激后紫花苜蓿的总酚含量，在最优提取条件下总酚含量可达80mg
·
g
‑1；
12.2)因考虑到超声波辅助70％丙酮提取法中的丙酮具有易燃、毒性大、污染环境等缺点，而乙醇具有价格便宜、易回收、环保等优点，因此选用乙醇作为溶剂；
13.3)利用超声波产生的强烈震动及空化效应能有效缩短萃取时间、增加提取率、降低成本；
14.4)利用box
‑
behnken响应面法优化蓟马取食刺激后紫花苜蓿总酚提取的最优条件，该方法操作简便、成本较低，为虫害胁迫下紫花苜蓿总酚的精准提取具有一定的实用性和可靠性。
附图说明
15.图1为固液比和乙醇体积分数对总酚提取的响应曲面图；
16.图2为固液比和浸提时间对总酚提取的响应曲面图；
17.图3为固液比和提取温度对总酚提取的响应曲面图；
18.图4为乙醇体积分数和浸提时间对总酚提取的响应曲面图；
19.图5为乙醇体积分数和浸提时间对总酚提取的响应曲面图；
20.图6为浸提时间和提取温度对总酚提取的响应曲面图；
具体实施方式
21.下面结合附图并通过具体的实施例进一步的说明本发明的技术方案：
22.本发明以下结合具体实施例进行解说。
23.响应面法优化超声波辅助法提取苜蓿总酚的方法，包括以下步骤：
24.1)苜蓿品种：甘农9号紫花苜蓿(m.sativa
‘
gan
‑
nong no.9’)。
25.2)样品获得：紫花苜蓿种植在甘肃农业大学牧草试验基地8m
×
6m
×
2m的覆盖60目防虫网室中。挑选均匀、饱满的甘农9号种子用0.1％hgcl2消毒后穴播于地里，株距10cm，行距10cm，每个处理4行，每行9株，重复3次。出苗后间苗，每穴保留生长一致、分布均匀的3株幼苗。根据需要隔2
‑
3d浇水1次，每隔7d浇灌100ml/穴hoagland营养液，保证苜蓿正常生长。苜蓿生长至分枝期，按每枝条接5只蓟马成虫，为避免蓟马逃逸每个处理用防虫网罩住，重复3次。于接蓟马第5d后取植株的地上部分，风干后将茎叶粉碎，过40目筛子，用来测定总酚含量。
26.3)确定固液比、乙醇体积分数、提取温度、浸提时间的最佳参数：
27.准确称取步骤(2)中获得的样品粉末0.05g，按照固液比1:10、1:15、1:20、1:25、1:30和1:40g
·
ml
‑1加入60％乙醇，其他反应条件如下：提取温度60℃和浸提时间60min。将不同体积分数的乙醇，40％，50％，60％，70％，80％和100％添加到0.05g粉末中，浸提时间为60min，提取温度为60℃。将0.05g粉末溶解在60％乙醇中，提取温度分别为30、40、50、60和
70℃，浸提时间为60min。在0.05g粉末中加入60％乙醇，提取温度为60℃，浸提时间分别为15、30、45、60和75min。上述的混合样品在数控超声波清洗浴中以40khz和100w提取。提取完成后，将提取液在10000r
·
min
‑1下离心10min，然后精密量取0.2ml上清液，置于试管中，加入1.8ml水和1ml福林酚试剂，反应5min后，加入10％碳酸钠溶液1ml，室温下放置1h，在760nm波长处测定吸光度。以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标得到标准曲线，根据标曲计算总酚含量。所有实验均进行3个重复。
28.4)基于步骤(3)的试验结果，选择固液比、乙醇体积分数、浸提时间和提取温度为自变量，以总酚含量为因变量，采用四因素三水平的box
‑
behnken响应面设计，如表1所示，筛选紫花苜蓿总酚提取的最优组合，如表2所示为紫花苜蓿植株总酚提取响应面实验设计及结果。
29.表1各试验因素水平表
[0030][0031]
表2紫花苜蓿植株总酚提取响应面实验设计及结果
[0032][0033]
5)基于步骤4)box
‑
behnken中心组合试验的结果，得出该模型的p<0.01如表3所示，说明模型达到极显著水平，具有统计学意义。此外，失拟误差与纯误差之间未达显著水平，即p>0.05，才能充分反映实际情况，表明模型拟合度良好，此模型可用于分析和预测紫花苜蓿的总酚提取。模型的决定系数说明紫花苜蓿总酚的提取结果与模型预测结果具有良好的一致性，表明试验误差较小；校正系数验证了该模型的可靠性。
[0034]
表3回归模型的方差分析
[0035][0036]
6)基于步骤5)的结果，通过响应面的变化和等高线的稀疏程度可反映出各因素之间的交互作用，最优条件即为响应面的最高点。因此，响应面法优化了蓟马取食刺激后紫花苜蓿总酚提取的最优条件：固液比为1:20(g:ml)，乙醇体积分数为60％，浸提时间为45min，提取温度为60℃。
[0037]
本发明采用box
‑
behnken响应面法优化蓟马取食刺激后紫花苜蓿总酚的超声波提取法。蓟马取食刺激后甘农9号苜蓿总酚提取的最佳条件为固液比为1:20g
·
ml
‑1，浸提时间为45min，乙醇体积分数为60％，提取温度为60℃。此发明筛选出了紫花苜蓿总酚提取的最佳参数，为蓟马胁迫处理下紫花苜蓿总酚的提取提供了新方法，为进一步充分利用苜蓿资源和开发新型附加产品提供理论依据和技术支持，图1～图6可以直观地看出各单因素交互作用对甘农9号总酚提取效果的影响。
[0038]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0039]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。