一种禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC-MSMS检测方法与流程

一种禾谷镰刀菌中t6p和tre的uplc
‑
ms/ms检测方法
技术领域
1.本发明涉及uplc
‑
ms/ms检测方法领域，尤其是涉及一种禾谷镰刀菌中t6p和tre的uplc
‑
ms/ms检测方法。


背景技术：

2.禾谷镰刀菌(f.graminearum)是小麦、玉米等农作物中最常见的病原菌，该菌致病，不仅导致农作物产量下降，同时产呕吐毒素，严重影响了农产品的品质和安全性。海藻糖的生物合成途径对真菌的致病力有至关重要的作用，据报道禾谷镰刀菌中敲除海藻糖合成途径相关基因，禾谷镰刀菌将丧失海藻糖合成能力，继而无法产孢，呕吐毒素合成能力下降86％。
3.t6p，6
‑
磷酸海藻糖是tre，海藻糖生物合成的中间体，是植物和真菌中必不可少的信号代谢物，对t6p和tre在禾谷镰刀菌中进行定量，可以为禾谷镰刀菌生长和产毒防控的海藻糖合成途径研究提供支撑。
4.tre属于糖类化合物，目前有较为成熟的检测方法。t6p属于酸性强糖，在微生物中含量极低，目前主要采用gc
‑
ms和lc
‑
ms两种方法检测，但是存在以下缺点：gc
‑
ms需要衍生反应，前处理复杂，检测时间长，lc
‑
ms检测时间短，样品前处理简单，但主要采用单级杆质谱扫描，母离子定性定量，假阳性概率较大。此外，由于t6p强酸性质，为强极性难保留和分离的化合物，对色谱柱要求较高，据报道dionex ionpac as11
‑
hc column(250
×
2.0mm,particle size9μm)、sielc primesep sb column(4.6
×
150mm，5μm)、waters acquity beh amide column(3.0
×
100mm,1.7μm)和zic
‑
hilic hplc column(2.1
×
150mm,3.5μm)均可用于检测磷酸糖，除waters acquity beh amide column可以达到较大的分离度，具有较好的分离效果，其他色谱柱但均存在分离度低、色谱响应值低、色谱柱使用寿命短等问题。


技术实现要素：

5.发明目的：为了解决现有技术中所存在的问题，本发明提出了一种具有较好分离度，灵敏度高，回收率高，稳定性好的禾谷镰刀菌中t6p和tre的uplc
‑
ms/ms检测方法。
6.技术方案：为达以上目的，本发明采取以下技术方案：
7.一种禾谷镰刀菌中t6p和tre的uplc
‑
ms/ms检测方法，具体为：将待测样品禾谷镰刀菌首先进行前处理制备成，经色谱柱进行梯度洗脱分离，利用uplc
‑
ms/ms的mrm模式采集数据，电喷雾离子源，负离子扫描方式下监测，将获得的待测样品谱图与标准谱图对比，保留时间相同的即为对应物质，通过标准曲线线性回归方程分别对t6p和tre进行定量；
8.所述色谱柱选取phenomenexluna所述色谱柱选取phenomenexluna(100
×
2mm，3μm)色谱柱或waters acquity uplc hss t3 column(100
×
3mm，1.7μm)色谱柱。
9.更进一步的，待测样品禾谷镰刀菌的前处理方法如下：
10.将待测禾谷镰刀菌置于绿豆汤液体培养基中，在28℃，140rpm条件下培养7天，过滤去除菌丝后，离心浓缩成为1
×
105个/ml孢子液备用；将孢子液接种于马铃薯液体培养基
中，每瓶接种1ml，28℃，140rpm震荡培养7d后，过滤取菌丝，采用去离子水清洗3次后，烘干，－20℃储存待测；
11.准确称取菌丝样品0.04g于15ml离心管中，加入4ml去离子水，浸泡1h后，采用高速匀浆机匀浆，加入4ml甲醇后，－80℃冷冻，在超声波清洗机超声解冻破壁30min，离心，取上清液，待测。
12.更进一步的，质谱条件具体为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：mrm多反应监测气帘气压力(curtain gas:40kpa)；电喷雾电压(ionspray voltage)：－4500kpa；离子源温度(temperature)：450℃；雾化气压力(ion source gas1)：65kpa；加热辅助气压力(ion source gas2)：65kpa；驻留时间：40ms。
13.更进一步的，当检测对象为t6p时，dp为
‑
110，ce为
‑
35，
‑
35。
14.更进一步的，当检测对象为tre时，dp为
‑
95，ce为
‑
19，
‑
25。
15.更进一步的，所述色谱柱为phenomenexluna更进一步的，所述色谱柱为phenomenexluna(100
×
2mm，3μm)色谱柱时，uplc优化条件如下：
16.流动相a：万分之一氨水；
17.流动相b：乙腈；
18.梯度：70％a等度洗脱；
19.流速：0.4ml/min。
20.更进一步的，所述色谱柱为waters acquity uplc hss t3 column(100
×
3mm，1.7μm)色谱柱时，uplc优化条件如下：
21.流动相a：5mm乙酸铵(包含万分之一氨水)；
22.流动相b：乙腈；
23.梯度：0
‑
3min 99％a、3
‑
5min 10％a、5
‑
8min 99％；
24.流速：0.25ml/min。
25.更进一步的，t6p标准谱图的获取方法具体如下：
26.称取t6p标准品于容量瓶种，利用体积分数为60％的乙腈溶解并定容，然后利用60％的乙腈逐级稀释配置成多个浓度梯度的标准工作溶液，将不同浓度的标准工作溶液进行uplc
‑
ms/ms分析，并制作标准曲线和谱图。
27.更进一步的，tre标准谱图的获取方法具体如下：
28.称取tre标准品于容量瓶种，利用体积分数为60％的乙腈溶解并定容，然后利用60％的乙腈逐级稀释配置成多个浓度梯度的标准工作溶液，将不同浓度的标准工作溶液进行uplc
‑
ms/ms分析，并制作标准曲线和谱图。
29.有益效果：本发明与现有技术相比，具备以下优点：
30.(1)选用的色谱柱具有较好的分离度，灵敏度高，回收率高，稳定性好。
31.(2)前处理方法简单，高效，进一步提高了分离效果。
附图说明
32.图1为t6p标准溶液的mrm色谱图显示的两种不同色谱柱的响应强度对比示意图；
33.图2为tre标准溶液的mrm色谱图显示的两种不同色谱柱的响应强度对比示意图；
34.图3为t3色谱柱检测时氨水对t6p响应值的影响对比色谱示意图；
35.图4为氨基柱分离t6p的标准曲线示意图；
36.图5为t3色谱柱分离t6p的标准曲线示意图；
37.图6为氨基柱分离tre的标准曲线示意图；
38.图7为t3色谱柱分离tre的标准曲线示意图。
具体实施方式
39.以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
40.本发明实施例中使用的仪器和试剂来源如下：
41.agilent 1290型uplc系统，absciex 4500质谱检测器；
42.电子天平：xp105dr型——赛多利斯科学仪器有限公司；
43.awl
‑
020i
‑
p型超纯水系统——艾科浦仪器有限公司；
44.kq
‑
250e型超声波清洗器——昆山禾创超声仪器有限公司；
45.h2050r型医用离心机——湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；
46.dw
‑
86l828j型超低温冰箱——海尔生物医疗股份有限公司；
47.涡旋混匀器——江苏海门其林贝尔仪器有限公司。
48.甲醇和乙腈为色谱纯，美国默克公司生产；乙酸铵为≥98％，德国cnw公司生产；t6p和tre购置于sigma
‑
aldrich贸易有限公司，质谱用水为屈臣氏蒸馏水。
49.实施例以及对比例中待测样品禾谷镰刀菌的前处理方法如下：
50.将待测禾谷镰刀菌置于绿豆汤液体培养基中，在28℃，140rpm条件下培养7天，过滤去除菌丝后，离心浓缩成为1
×
105个/ml孢子液备用；将孢子液接种于马铃薯液体培养基中，每瓶接种1ml，28℃，140rpm震荡培养7d后，过滤取菌丝，采用去离子水清洗3次后，烘干，－20℃储存待测；
51.准确称取菌丝样品0.04g于15ml离心管中，加入4ml去离子水，浸泡1h后，采用高速匀浆机匀浆，加入4ml甲醇后，－80℃冷冻，在超声波清洗机超声解冻破壁30min，离心，取上清液，待测。
52.实施例以及对比例中标准谱图和标准曲线获取方法如下：
53.其中t6p标准谱图的获取方法具体如下：
54.称取t6p标准品于容量瓶种，利用体积分数为60％的乙腈溶解并定容，然后利用60％的乙腈逐级稀释配置成多个浓度梯度的标准工作溶液，将不同浓度的标准工作溶液进行uplc
‑
ms/ms分析，并制作标准曲线和谱图。标准曲线具体请参考图4，图5所示。
55.其中tre标准谱图的获取方法具体如下：
56.称取tre标准品于容量瓶种，利用体积分数为60％的乙腈溶解并定容，然后利用60％的乙腈逐级稀释配置成多个浓度梯度的标准工作溶液，将不同浓度的标准工作溶液进行uplc
‑
ms/ms分析，并制作标准曲线和谱图。标准曲线具体请参考图5，图6所示。
57.通过标准曲线的绘制可以看出：
58.t6p和tre通过氨基柱时，在4.25
‑
250ug/l的线性范围内呈现良好的线性关系，通过t3柱时在31.25
‑
1000ug/l的范围内呈现良好的线性关系；另外，通过氨基柱的检出限为1.25
‑‑
5.10ug/l，远低于t3柱的15.62
‑
12.75ug/l；定量限氨基柱为3.75
‑
15.60ug/l，也低于t3柱的38.25
‑
52.03ug/l，氨基柱的灵敏度高于t3柱，两种色谱柱的相关系数均在0.99以
上，均符合实际分析的要求。
59.表1 t6p和tre的标准曲线、线性范围、相关系数、检出限和定量限
[0060][0061]
实施例1：
[0062]
禾谷镰刀菌中t6p的uplc
‑
ms/ms检测方法，具体为：将待测样品禾谷镰刀菌首先进行前处理制备成，经色谱柱进行洗脱分离，利用uplc
‑
ms/ms的mrm模式采集数据，电喷雾离子源，负离子扫描方式下监测，将获得的待测样品谱图与标准谱图对比，保留时间相同的即为对应物质，通过标准曲线线性回归方程对t6p进行定量；
[0063]
所述色谱柱选取phenomenexluna所述色谱柱选取phenomenexluna(100
×
2mm，3μm)色谱柱：uplc优化条件如下：
[0064]
流动相a：万分之一氨水；
[0065]
流动相b：乙腈；
[0066]
梯度：70％a等度洗脱；
[0067]
流速：0.4ml/min。
[0068]
质谱条件具体为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：mrm多反应监测气帘气压力(curtain gas:40kpa)；电喷雾电压(ionspray voltage)：－4500kpa；离子源温度(temperature)：450℃；雾化气压力(ion source gas1)：65kpa；加热辅助气压力(ion source gas2)：65kpa；驻留时间：40ms。dp为
‑
110，ce为
‑
35，
‑
35。
[0069]
实施例2：
[0070]
禾谷镰刀菌中t6p的uplc
‑
ms/ms检测方法，具体为：将待测样品禾谷镰刀菌首先进行前处理制备成，经色谱柱进行梯度洗脱分离，利用uplc
‑
ms/ms的mrm模式采集数据，电喷雾离子源，负离子扫描方式下监测，将获得的待测样品谱图与标准谱图对比，保留时间相同的即为对应物质，通过标准曲线线性回归方程对t6p进行定量；
[0071]
所述色谱柱选取waters acquity uplc hss t3 column(100
×
3mm，1.7μm)色谱柱：uplc优化条件如下：
[0072]
流动相a：5mm乙酸铵(包含万分之氨水)；
[0073]
流动相b：乙腈；
[0074]
梯度：0
‑
3min 99％a、3
‑
5min 10％a、5
‑
8min 99％；
[0075]
流速：0.25ml/min。
[0076]
质谱条件具体为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：mrm多
反应监测气帘气压力(curtain gas:40kpa)；电喷雾电压(ionspray voltage)：－4500kpa；离子源温度(temperature)：450℃；雾化气压力(ion source gas1)：65kpa；加热辅助气压力(ion source gas2)：65kpa；驻留时间：40ms。dp为
‑
110，ce为
‑
35，
‑
35。
[0077]
实施例3：
[0078]
禾谷镰刀菌中tre的uplc
‑
ms/ms检测方法，具体为：将待测样品禾谷镰刀菌首先进行前处理制备成，经色谱柱进行洗脱分离，利用uplc
‑
ms/ms的mrm模式采集数据，电喷雾离子源，负离子扫描方式下监测，将获得的待测样品谱图与标准谱图对比，保留时间相同的即为对应物质，通过标准曲线线性回归方程对tre进行定量；
[0079]
所述色谱柱选取phenomenexluna所述色谱柱选取phenomenexluna(100
×
2mm，3μm)色谱柱：uplc优化条件如下：
[0080]
流动相a：万分之一氨水；
[0081]
流动相b：乙腈；
[0082]
梯度：70％a等度洗脱；
[0083]
流速：0.4ml/min。
[0084]
质谱条件具体为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：mrm多反应监测气帘气压力(curtain gas:40kpa)；电喷雾电压(ionspray voltage)：－4500kpa；离子源温度(temperature)：450℃；雾化气压力(ion source gas1)：65kpa；加热辅助气压力(ion source gas2)：65kpa；驻留时间：40ms；dp为
‑
95，ce为
‑
19，
‑
25。
[0085]
实施例4：
[0086]
禾谷镰刀菌中tre的uplc
‑
ms/ms检测方法，具体为：将待测样品禾谷镰刀菌首先进行前处理制备成，经色谱柱进行梯度洗脱分离，利用uplc
‑
ms/ms的mrm模式采集数据，电喷雾离子源，负离子扫描方式下监测，将获得的待测样品谱图与标准谱图对比，保留时间相同的即为对应物质，通过标准曲线线性回归方程对tre进行定量；
[0087]
所述色谱柱选取waters acquity uplc hss t3 column(100
×
3mm，1.7μm)色谱柱：uplc优化条件如下：
[0088]
流动相a：5mm乙酸铵(包含万分之氨水)；
[0089]
流动相b：乙腈；
[0090]
梯度：0
‑
3min 99％a、3
‑
5min 10％a、5
‑
8min 99％；
[0091]
流速：0.25ml/min。
[0092]
质谱条件具体为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：mrm多反应监测气帘气压力(curtain gas:40kpa)；电喷雾电压(ionspray voltage)：－4500kpa；离子源温度(temperature)：450℃；雾化气压力(ion source gas1)：65kpa；加热辅助气压力(ion source gas2)：65kpa；驻留时间：40ms；dp为
‑
95，ce为
‑
19，
‑
25。
[0093]
对比例1
‑
4：
[0094]
对比例1
‑
4的其他实施方式与实施例1
‑
2相同，不同之处在于色谱柱的选择和优化条件不同，具体如表2所示：
[0095]
表2实施例1
‑
2以及对比例1
‑
4t6p检测过程色谱柱的选择和uplc条件优化
[0096][0097]
从表2可以看出：对比例1
‑
4中采用hilic和cogent diamond hydride时，强保留，未出峰；采用c18色谱柱时，t6p的保留较弱，t6p在2min左右无规则流出；waters acquity beh amide column检测柱压大，磷酸糖峰拖尾，色谱柱使用200针样品后，磷酸糖出现强保留，该色谱柱无法继续用于检测磷酸糖；而本申请实施例1和2分别使用的luna氨基硅胶柱和waters acquity uplc hss t3色谱柱，t6p的保留效果较好，50μg/l的t6p通过氨基柱检测响应强度约为3.5
×
104cps，而1000μg/l的t6p利用t3色谱柱时响应值只有1
×
104cps，t6p利用t3色谱柱检测响应强度远低于氨基柱，具体可参考图1的mrm色谱图所示，其中氨基柱t6p浓度为50μg/l，t3色谱柱t6p浓度为1000μg/l，虚线离子对为421.1/241.1，实线离子对421.1/79.1。
[0098]
对比例5
‑
8：
[0099]
对比例5
‑
8的其他实施方式与实施例3
‑
4相同，不同之处在于色谱柱的选择和优化条件不同，具体如表3所示：
[0100]
表3实施例3
‑
4以及对比例1
‑
4tre检测过程色谱柱的选择和uplc条件优化
[0101][0102]
从表3可以看出：除了c18柱，其他色谱柱均可实现tre的分离。但是kinetexhilic、cogent diamond hydride和waters acquity beh amide column在t6p分离时出现强保留，这3种色谱柱无法实现t6p和tre的同时检测。t3和nh2色谱柱可以实现t6p和tre的同时检测。
[0103]
具体可参考图2的mrm色谱图所示，其中tre浓度为50μg/l，虚线离子对为341.0/178.8，实线离子对341.0/118.9。
[0104]
此外，对实施例5和实施例1
‑
2进行t3色谱柱检测t6p时优化实验对比如图3所示：实施例5中进行色谱柱优化条件时：在水相中加入万分之一氨水。发现t6p的响应提高了十倍，但是其响应值仍然远低于nh3柱。luna柱效流失快，一根色谱柱检测磷酸糖平均寿命为200
‑
300个样品，t3柱使用寿命长，响应值较低，因此应综合考虑检测成本、样品中t6p的含量，选择合适的色谱柱进行测定。图3中t6p浓度为1000μg/l，离子对421.1/79.1。
[0105]
此外对实施例1
‑
4的回收率和精密度进行测定。
[0106]
准确称取禾谷镰刀菌40mg，添加一定浓度的标准品溶液后，每个浓度重复4次，计算该方法的回收率和相对标准偏差(rsd)，结果表明，利用氨基和t3两种色谱柱，在3个加标水平下，t6p的回收率分别为71.5％
‑
85.7％和83.7％
‑
95.6％，相对标准偏差为3.8％
‑
6.2％和2.7％
‑
3.3％；tre的回收率分别为72.4％
‑
82.3％和82.8％
‑
84.8％，相对标准偏差4.5％
‑
8.5％和2.8％
‑
3.2％；与氨基柱比，3柱的回收率高，rsd低，说明t3柱的稳定性优于氨基柱。利用氨基和t3两种色谱柱检测出禾谷镰刀菌ph
‑
1中t6p含量分别约为52.6μg/g和60.5μg/g，tre含量约为4.42mg/g和5.4mg/g，两种色谱柱检测禾谷镰刀菌ph
‑
1中t6p和tre
含量无显著性差异，均可用于检测禾谷镰刀菌ph
‑
1中t6p和tre含量。
[0107]
表4准确性和精密度实验结果
[0108][0109]
本发明公开的一种禾谷镰刀菌中t6p和tre的uplc
‑
ms/ms检测方法选取了氨基柱和t3色谱柱适合t6p和tre两种化合物uplc
‑
ms/ms检测，分别建立利用两种色谱柱同时检测禾谷镰刀菌中t6p和tre的方法，发现氨基柱的灵敏度高，t3色谱柱的回收率高、稳定性好。利用两种色谱柱检测出禾谷镰刀菌ph
‑
1中t6p含量分别约为52.6μg/g和60.5μg/g，tre含量约为4.42mg/g和5.4mg/g。

技术特征：
1.一种禾谷镰刀菌中t6p和tre的uplc
‑
ms/ms检测方法，其特征在于，样品禾谷镰刀菌进行前处理后制备样品溶液，样品溶液经色谱柱进行洗脱分离，利用uplc
‑
ms/ms的mrm模式采集数据，电喷雾离子源，负离子扫描方式下监测，将获得的待测样品谱图与标准谱图对比，保留时间相同的即为对应物质，通过标准曲线线性回归方程分别对t6p和tre进行定量；所述色谱柱选取nh2(100
×
2mm，3μm)色谱柱或waters acquity uplc hss t3 column(100
×
3mm，1.7μm)色谱柱。2.根据权利要求1所述的禾谷镰刀菌中t6p和tre的uplc
‑
ms/ms检测方法，其特征在于：待测样品禾谷镰刀菌的前处理方法如下：将待测禾谷镰刀菌置于绿豆汤液体培养基中，在28℃，140rpm条件下培养7天，过滤去除菌丝后，离心浓缩成为1
×
105个/ml孢子液备用；将孢子液接种于马铃薯液体培养基中，每瓶接种1ml，28℃，140rpm震荡培养7d后，过滤取菌丝，采用去离子水清洗3次后，烘干，－20℃储存待测；准确称取菌丝样品0.04g于15ml离心管中，加入4ml去离子水，浸泡1h后，采用高速匀浆机匀浆，加入4ml甲醇后，－80℃冷冻，在超声波清洗机超声解冻破壁30min，离心，取上清液，待测。3.根据权利要求1所述的禾谷镰刀菌中t6p和tre的uplc
‑
ms/ms检测方法，其特征在于质谱条件具体为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：mrm多反应监测气帘气压力(curtain gas:40kpa)；电喷雾电压(ionspray voltage)：－4500kpa；离子源温度(temperature)：450℃；雾化气压力(ion source gas1)：65kpa；加热辅助气压力(ion source gas2)：65kpa；驻留时间：40ms。4.根据权利要求1或3所述的禾谷镰刀菌中t6p和tre的uplc
‑
ms/ms检测方法，其特征在于：当检测对象为t6p时，离子对为：421.2/241.1,421.2/139.1；dp为
‑
110，ce为
‑
35，
‑
35。5.根据权利要求1或3所述的禾谷镰刀菌中t6p和tre的uplc
‑
ms/ms检测方法，其特征在于：当检测对象为tre时，离子对为：341.0/178.8,341.0/118.9；dp为
‑
95，ce为
‑
19，
‑
25。6.根据权利要求1所述的禾谷镰刀菌中t6p和tre的uplc
‑
ms/ms检测方法，其特征在于：所述色谱柱为nh2(100
×
2mm，3μm)色谱柱时，uplc优化条件如下：流动相a：万分之一氨水；流动相b：乙腈；梯度：70％a等度洗脱；流速：0.4ml/min。7.根据权利要求1所述的禾谷镰刀菌中t6p和tre的uplc
‑
ms/ms检测方法，其特征在于：所述色谱柱为waters acquity uplc hss t3 column(100
×
3mm，1.7μm)色谱柱时，uplc优化条件如下：流动相a：5mm乙酸铵(包含万分之一氨水)；流动相b：乙腈；梯度：0
‑
3min 99％a、3
‑
5min 10％a、5
‑
8min 99％；流速：0.25ml/min。8.根据权利要求1所述的禾谷镰刀菌中t6p和tre的uplc
‑
ms/ms检测方法，其特征在于：
t6p标准谱图的获取方法具体如下：称取t6p标准品于容量瓶种，利用体积分数为60％的乙腈溶解并定容，然后利用60％的乙腈逐级稀释配置成多个浓度梯度的标准工作溶液，将不同浓度的标准工作溶液进行uplc
‑
ms/ms分析，并制作标准曲线和谱图。9.根据权利要求1所述的禾谷镰刀菌中t6p和tre的uplc
‑
ms/ms检测方法，其特征在于：tre标准谱图的获取方法具体如下：称取tre标准品于容量瓶种，利用体积分数为60％的乙腈溶解并定容，然后利用60％的乙腈逐级稀释配置成多个浓度梯度的标准工作溶液，将不同浓度的标准工作溶液进行uplc
‑
ms/ms分析，并制作标准曲线和谱图。
技术总结
本发明公开了一种禾谷镰刀菌中T6P和Tre的UPLC


技术研发人员：吴琴燕 庄义庆 梁红芳 吴雨琦
受保护的技术使用者：江苏丘陵地区镇江农业科学研究所
技术研发日：2021.03.19
技术公布日：2021/6/29