本发明涉及色素产品及其制备方法，尤其涉及一种红曲色素产品及其制备方法。
背景技术：
红曲由红曲菌在大米等基质上固态或液态发酵形成，因富含色泽深红的红曲色素成分，称之为红曲。将固态或液态发酵的红曲进行色素(主要是针对红色素)的提取和喷雾干燥获得的红曲色素称之为红曲红，在大米基质上固态发酵得到的红曲产品称之为红曲米。红曲色素在中国有上千年的食用历史，被广泛应用于以火腿为代表的肉制品着色和以红腐乳为代表的豆制品着色。
食品着色用红曲中的色素成分复杂，文献报道已完成结构解析的红曲色素超过60种，其中较为常见的色素主要为两种橙色素(红斑红曲素rubropunctatin，简称橙色素o1；红曲玉红素monascorubrine，简称橙色素o2)；两种黄色素(红曲素monascin,简称y1；安卡红曲黄素ankaflavin，简称y2)；两种红色素(红斑红曲胺rubropunctamine，简称r1；红曲玉红胺monascorubramine，简称r2)。
红曲色素虽然包含多种色素成分，但目前红色调着色用红曲应用最广。gb1886.19-2015和gb1886.181-2016关于红曲米和红曲红的标准均倾向于红色素为主要测定指标：提取溶剂采用70％乙醇，最适合红色素的提取(红橙黄三类红曲色素中，红色素的极性普遍高于黄色和橙色)，红曲米和红曲红的检测波长分别为505nm和495±10nm，接近于多种红色素的最大吸收波长。日本2018年出版的第9版《食品添加物公定书》对红曲色素的测定标准采用480-520nm检测波长，色素提取溶剂为95％乙醇和水(1：1)，该评价方法也倾向于红色素为主要测定指标。现有的针对红曲产品色价的评价方法，关注红色素的提取，忽略了对橙色素、黄色素，尤其是橙色素o1和o2的检测和利用。
橙色素o1和橙色素o2本身不仅是良好的橙色着色剂来源，也可以与氨基酸反应作为红色着色剂使用。在针对橙色素o1和o2的研究中，发现其可以与氨基酸及其他含氮化合物反应形成红色素。以橙色素o1、o2为前体化合物可以合成多种衍生色素。
桔霉素(citrinin)是一种有肝肾毒性的真菌毒素，尽可能降低食品或食品添加剂中桔霉素的含量是本领域技术人员研究的一个重点。目前常规的做法是针对红曲菌进行基因改造，将合成桔霉素的关键基因pksct敲除，降低桔霉素的产量；或者通过发酵过程中添加各种添加剂，降低发酵产物中桔霉素含量。两者均存在操作复杂、色素产量下降的问题。
如何由红曲米在富集橙色素及黄色素的同时，实现红色素的显著降低，并当红曲米中还含有桔霉素时，还能在富集橙色素及黄色素的同时，实现红色素和桔霉素的显著降低成为开发新类型色素产品有待解决的问题。
技术实现要素：
本发明提供一种含橙色素和黄色素的红曲色素产品，是利用有机溶剂提取红曲米(在其中含有其他色素时)，以富集橙色素和黄色素，实现其他色素的去除或显著降低得到的。
本发明提供一种含橙色素和黄色素的红曲色素产品的制备方法，是利用有机溶剂提取红曲米(在其中含有其他色素时)，能在富集橙色素和黄色素的同时，实现其他色素的去除或显著降低。
本发明还提供了所述的含橙色素和黄色素的红曲色素产品作为红色着色剂和黄色着色剂的应用。
本发明提供一种含红色素的红曲色素产品的制备方法，是利用有机溶剂提取红曲米(在其中含有其他色素时)，能在富集红色素的同时，实现其他色素的去除或显著降低。
本发明提供一种含橙色素或黄色素的红曲色素产品的制备方法，是利用有机溶剂提取红曲米(在其中含有其他色素时)，能在富集橙色素或黄色素的同时，实现其他色素的去除或显著降低。
本发明提供的一种含橙色素和黄色素的红曲色素产品，是利用有机溶剂提取含橙色素和黄色素的发酵产物获得提取产物，并由所述提取产物富集橙色素及黄色素得到，所述橙色素为橙色素o1和o2中的一种或多种，所述黄色素为黄色素y1和y2中的一种或多种，所述发酵产物为红曲米。
在本申请的方案中所述含橙色素和黄色素的红曲色素产品通过富集所述提取产物中的所述橙色素及黄色素，同时去除或显著降低所述提取产物中其他色素得到，所述其他色素包括红色素和桔霉素中的一种或多种，所述红色素为红色素r1和r2中的一种或多种。在本申请的方案既适用于含有桔霉素也适用于不含桔霉素的红曲米。对于不含桔霉素、含红色素的红曲米可富集o1、o2、y1和y2，同时能够实现红色素的显著降低，获得含o1、o2、y1和y2这4种色素混合物的黄色调的色素产品。对于含桔霉素、红色素的红曲米，本申请的方案能富集o1，o2、y1和y2，并同时实现红色素和桔霉素的显著降低。本申请的方案的最终目标之一是获得含橙色素o1、o2、y1和y2的具有黄色调的红曲色素产品。
进一步的，所述有机溶剂含有二氯甲烷、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、除乙醇外的低级醇、三氯甲烷、乙腈、甲酸、乙酸和磷酸中的一种或多种。
在本发明的方案中，有机溶剂提取后还包括利用硅胶柱层析精制所述提取产物以富集所述橙色素及黄色素。
所述利用硅胶柱层析精制所述提取产物以富集所述橙色素及黄色素的过程包括采用洗脱溶剂对硅胶柱进行洗脱以收集所述橙色素及黄色素，同时去除其他色素，所述其他色素包括红色素和桔霉素中的一种或多种，所述红色素为红色素r1和r2中的一种或多种，所述洗脱溶剂为二氯甲烷和甲醇的混合物，二氯甲烷和甲醇比例为50：0～1(v/v)，或者所述洗脱溶剂为三氯甲烷和甲醇的混合物，三氯甲烷和甲醇比例为50：0～1(v/v)。进一步的，甲醇也可以使用其他低级醇替代。
在本申请的方案中，洗脱过程可以通过目测观察各色素(例如橙色素o1、o2及黄色素y1、y2的混合色素条带)是否洗脱；或者使用本领域常规的洗脱收集标准进行，这对于本领域技术人员是可以实现的。
本发明还提供了一种含橙色素和黄色素的红曲色素产品的制备方法，所述方法利用有机溶剂提取含橙色素和黄色素的发酵产物获得提取产物，并由所述提取产物富集橙色素及黄色素以得到所述红曲色素产品，所述橙色素为橙色素o1和o2中的一种或多种，所述黄色素为黄色素y1和y2中的一种或多种，所述发酵产物为红曲米。
进一步的，所述由所述提取产物富集橙色素及黄色素包括：富集所述提取产物中的所述橙色素及黄色素，同时去除或显著降低所述提取产物中其他色素得到，所述其他色素包括红色素和桔霉素中的一种或多种，所述红色素为红色素r1和r2中的一种或多种。
在本发明的一个具体实施方式中，所述有机溶剂含有二氯甲烷、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、除乙醇外的低级醇、三氯甲烷、乙腈、甲酸、乙酸和磷酸中的一种或多种。
在本发明的一个具体实施方式中，所述有机溶剂为石油醚与乙酸乙酯，或石油醚与二氯甲烷的复合溶剂。更进一步的，在所述复合溶剂中，所述石油醚的比例为50％-85v/v％。更进一步的，所述石油醚的比例为50％-75v/v％。在本发明的方案中，所述石油醚沸程可以为30-60℃或60-90℃。优选所述石油醚沸程为60-90℃。
所述有机溶剂可以为石油醚，二氯甲烷和甲酸的组合溶剂。进一步的，在石油醚，二氯甲烷和甲酸的组合溶剂中，石油醚与二氯甲烷比例为1-2：1(v/v)，甲酸的含量为0.1-0.3v/v％。
所述有机溶剂可以为乙醇和甲酸的组合溶剂。进一步的，在乙醇和甲酸的组合溶剂的组合溶剂中，甲酸的含量为0.1-0.3v/v％，乙醇为浓度90-100％的乙醇。
进一步的，所述有机溶剂提取所述红曲米过程中，所述红曲米与有机溶剂的比例为1:5-50g/ml。
所述有机溶剂的浓度，例如乙醇可以是浓度80％以上的乙醇；所述二氯甲烷浓度为100％。进一步的，在组合溶剂中二氯甲烷的体积比可占50％或更低。
更进一步的，所述有机溶剂提取可以静置提取，或者所述有机溶剂提取还包括在加入有机溶剂提取红曲米的同时，采用超声辅助提取5-30min，获得超声辅助提取液。进一步的，所述超声的频率例如可以是200w-800w。
更进一步的，还包括将所述超声辅助提取液的上清液进一步进行硅胶柱层析精制。所述上清液例如可以将所述超声辅助提取液在3500r/min离心10min，取上清获得。
在所述制备含橙色素和黄色素的红曲色素产品的制备方法中，所述硅胶柱层析精制包括：
1)将所述上清液与硅胶按照1-2克硅胶/1克提取干物质(所述提取干物质的含量例如可以通过取10ml所述上清液，经溶剂挥发干燥，将得到的干物质称重获得)的比例混合，得到混合物1；
2)将混合物1装入硅胶柱，控制分离用硅胶与载样硅胶比(w/w)5～30:1，经二氯甲烷:甲醇＝50：0～1(v/v)洗脱，获得富含o1、o2、y1和y2的红曲色素溶液；
3)旋转蒸发干燥所述富含o1、o2、y1和y2的红曲色素溶液，得到富含o1、o2、y1和y2、红色素含量显著降低或不含红色素的红曲色素产品。
在上述精制过程中，所述硅胶例如可以是粒径200-500目，进一步也可以是300-400目。更进一步的，分离用硅胶与载样用硅胶的粒径可以相同，也可以不同，例如载样硅胶粒径可以为100-200目，分离硅胶粒径可以为200-500目。
更进一步的，所述旋转蒸发干燥的条件例如可以是30-50℃。
本发明还提供了含橙色素和黄色素的红曲色素产品(即含橙色素o1、o2及黄色素y1、y2的产物的产品)作为红色着色剂和黄色着色剂的应用。
所述含橙色素和黄色素的红曲色素产品在酸性条件下作为黄色着色剂，在碱性条件下，作为红色着色剂。
本发明提供的一种含红色素的红曲色素产品(即含红曲红色素r1、r2的红色素产品)的制备方法，包括：
1)利用有机溶剂提取含红色素的发酵产物获得提取产物，并由所述提取产物富集红色素，所述红色素包括红色素r1和r2中的一种或多种，所述发酵产物为红曲米；
2)所述由所述提取产物富集红色素包括：利用硅胶柱层析精制步骤1)获得所述提取产物，以富集所述提取产物中的所述红色素，同时去除或显著降低所述提取产物中其他色素，所述其他色素包括橙色素、黄色素和桔霉素中的一种或多种，所述橙色素为橙色素o1和o2中的一种或多种，所述黄色素为黄色素y1和y2中的一种或多种。
在所述制备含红色素的红曲色素产品的制备方法中，所述硅胶柱层析精制包括：
1)将所述上清液与硅胶按照1-2克硅胶/1克提取干物质(所述提取干物质的含量例如可以通过取10ml所述上清液，经溶剂挥发干燥，将得到的干物质称重获得)的比例混合，得到混合物1；
2)将混合物1装入硅胶柱，控制分离用硅胶与载样硅胶比(w/w)5～30:1，经二氯甲烷:甲醇＝50：0～1(v/v)洗脱富含o1、o2、y1和y2的红曲色素溶液，再用无水甲醇洗脱所述硅胶柱，以获得富含r1和r2的红曲色素溶液；
3)旋转蒸发干燥所述富含r1和r2的红曲色素溶液。
本申请还提供了一种含橙色素或黄色素的红曲色素产品的制备方法，包括：
1)利用有机溶剂提取含橙色素和黄色素的发酵产物获得提取产物，并由所述提取产物富集所述橙色素和黄色素，所述橙色素为橙色素o1和o2中的一种或多种，所述黄色素为黄色素y1和y2中的一种或多种，所述发酵产物为红曲米，
2)所述由所述提取产物富集橙色素和黄色素包括：利用硅胶柱层析精制步骤1)获得所述提取产物，以富集所述提取产物中的所述橙色素和黄色素，同时去除或显著降低所述提取产物中其他色素，所述其他色素包括红色素和桔霉素中的一种或多种，所述红色素为红色素r1和r2中的一种或多种；
3)利用制备型液相色谱由富集的所述橙色素和黄色素分别提纯橙色素o1和o2中的一种或多种，或黄色素y1和y2中的一种或多种。
在所述制备含橙色素或黄色素的红曲色素产品的制备方法中，所述硅胶柱层析精制方法与制备含橙色素和黄色素的红曲色素产品的制备方法中硅胶柱层析精制方法步骤相同。
本发明方案具有以下优点：
1)本发明提供的制备红曲色素产品的方法，既适用于含有桔霉素也适用于不含桔霉素的红曲米，对于不含桔霉素的红曲米可富集o1、o2、y1和y2，同时能够实现红色素的显著降低，获得含橙色素o1、o2、y1和y2的具有黄色调的红曲色素产品。
2)针对含桔霉素的红曲米，在实现o1、o2、y1和y2富集的同时显著降低桔霉素、红色素的含量，经济有效地解决红曲菌发酵产品桔霉素的污染问题，使高产o1、o2、y1和y2但伴有桔霉素含量高的红曲菌株也能安全地应用于食品添加剂及其他着色领域(比如染发、印刷等)；
3)本发明的红曲色素产品的制备方法，相比于使用国标70％乙醇提取的方法，即使提取产物中富含o1、o2、y1和y2，但提取得率不高，由于将红色素也同时提取出来，终产品因红色素的干扰可至色调偏红或黄色调不纯正。本申请方案中采用单独的二氯甲烷，单独90％-100％乙醇、单独乙酸乙酯、单独三氯甲烷或组合溶剂的提取比国标70％乙醇提取的方法对于富集o1、o2、y1和y2有更高的得率。组合溶剂中添加石油醚代替部分二氯甲烷或乙酸乙酯能获得显著相比于单独二氯甲烷、单独三氯甲烷或乙酸乙酯提取提高的去除红色素和桔霉素的效果，并能降低提取成本。
4)本申请方案中在采用有机溶剂柱层析后进一步利用硅胶柱层析精制有机溶剂提取产物，相比于单独有机溶剂提取，红色素会彻底去除，并且如该红曲米中含有桔霉素，桔霉素也能相应去除。
5)本发明提供的红曲色素产品在酸性条件下作为黄色着色剂，在碱性条件下，作为红色着色剂。
6)本发明提供的红曲色素产品作为红色着色剂用于含有以游离氨基酸为代表的含氮食品的着色，碱性染料、涂料的着色；作为黄色着色剂用于酸性染料、涂料的着色，碳酸饮料、糖果、塑料容器、包装材料等的着色；所述红曲色素产品经适当壁材(不含氮或不与含氮化合物反应)包埋处理也可作为黄色着色剂用于食品着色；可用于化妆(染发、染指甲等)、印染、涂料行业的着色。
附图说明
图1显示了含红曲红色素r1、r2(1、2)、黄色素y1、y2(3、4)及橙色素o1、o2(5、6)红曲米中色素成分的高效液相色谱图；
图2显示了红曲红色素r1、r2(1、2)、黄色素y1、y2(3、4)及橙色素o1、o2(5、6)的光谱图和质谱图。
具体实施方式
在本发明的方案中，所述含红曲橙色素o1、o2，黄色素y1、y2及红色素r1、r2的红曲米为市售的含红曲橙色素o1、o2，黄色素y1、y2及红色素r1、r2的红曲米，例如福建省古田县购买的红曲米产品，这对于本领域技术人员来说是可以使用常规筛选手段实现的。
实施例1筛选富含红曲橙色素，黄色素及红色素的发酵产物
采用高效液相色谱结合质谱分析，从市售红曲产品(福建省古田县购买的红曲米)中筛选含红曲橙色素，黄色素及红色素的红曲米。
将5克市售红曲产品粉碎，移入锥形瓶中，以红曲产品和乙醇1:10-20g/ml的比例加入70％乙醇溶液，超声辅助提取5-30min，然后将提取液在3500r/min离心10min，取上清液，经0.22μm有机滤器过滤后，进行hplc检测。
hplc检测条件：色谱柱cosmosilpackedcolumn(4.6μm，4.6id×250mm)，流动相由a相水(0.1％甲酸)和b相乙腈组成，梯度洗脱：b相(0-12min：60％，12-25min：60％-90％，25-27min：90％，27-30min：90％-60％；v:v)，流速1ml/min，二极管阵列检测器，检测波长：410nm，柱温：25℃。
采用lcms-it-tof质谱仪检测色素精确分子量。
hplc结合lcms-it-tof检测结果显示：6种色素的分子量、特征性光谱吸收峰符合相关文献记录：分别为红色素r1：(1：rubropunctamine)、r2(2：monascorubramine)；黄色素y1(3：monascin)、y2(4：ankaflavin)；橙色素o1(5：rubropunctatin)、o2(6：monascorubrin)。
图1显示了含红曲红色素r1、r2(1、2)、黄色素y1、y2(3、4)及橙色素o1、o2(5、6)红曲米中色素成分的高效液相色谱图。图2显示了红曲红色素r1、r2(1、2)、黄色素y1、y2(3、4)及橙色素o1、o2(5、6)的光谱图和质谱图。
当然本领域技术人员也可以根据需要筛选含橙色素和黄色素的发酵产物，或者含红色素的发酵产物，这对本领域技术人员来说是可以根据上述方法实现的。
实施例2本申请含橙色素和黄色素的红曲色素产品的制备
本实施例可以采用实施例1筛选的红曲米，也可以使用市售的含红曲橙色素o1、o2，黄色素y1、y2及红色素r1、r2的红曲米。
1)有机溶剂提取：将5克含红曲橙色素o1、o2，黄色素y1、y2及红色素r1、r2的红曲米粉碎，移入锥形瓶中，以红曲米和二氯甲烷1:10～20g/ml的比例加入100％二氯甲烷溶液，超声辅助提取5-30min，超声频率200w,然后将提取液在3500r/min离心10min，取上清液至新的离心管中；
2)硅胶柱层析精制：分离用硅胶和载样硅胶可以是购买自麦克林公司的产品，例如c820914货号的，尺寸为300-400目的柱层析硅胶。层析柱为可手动加压的快速柱色谱装置(flashchromatography)。本领域技术人员可以根据需要使用中压色谱分离装置替代快速柱色谱装置。
将步骤1)中上清液10ml经溶剂挥干，得到的干物质称重，可知每毫升上清液中干物质大致含量；再按照每1克干物质，1-2克硅胶的比例，将获得的上清液与硅胶混匀，挥干溶剂后，装入硅胶柱，控制分离用硅胶与载样硅胶比(w/w)约5～30:1，经二氯甲烷:甲醇＝50：0～1(v/v)洗脱，获得富含红曲橙色素o1、o2及黄色素y1、y2的红曲色素溶液，旋转蒸发干燥后获得富含红曲橙色素o1、o2及黄色素y1、y2、不含红色素和可能含有的桔霉素的红曲色素产品。
取0.1克所得红曲色素产品，采用实施例1的hplc方法检测色素含量。
实施例3本申请含橙色素和黄色素的红曲色素产品的制备
1)有机溶剂提取：将5克含红曲橙色素o1、o2，黄色素y1、y2及红色素r1、r2的红曲米粉碎，移入锥形瓶中,将红曲米和有机溶剂以1:20～30g/ml的料液比混合，其中该有机溶剂为：石油醚：乙酸乙酯＝1-5：1(v/v)的组合溶剂，超声辅助提取5-30min，超声频率300w,3500r/min离心10min，取上清液至新的离心管中。
将离心管中的物质采用实施例1的hplc方法检测色素含量。
实施例4本申请含橙色素和黄色素的红曲色素产品的制备
1)有机溶剂提取：将5克含红曲橙色素o1、o2，黄色素y1、y2及红色素r1、r2的红曲米粉碎，移入锥形瓶中,将红曲米和有机溶剂以1:20～30g/ml的料液比混合，其中该有机溶剂为石油醚：二氯甲烷＝1-3：1(v/v)的组合溶剂，超声辅助提取5-30min，超声频率300w,3500r/min离心10min，取上清液至新的离心管中。
将离心管中的物质采用实施例1的hplc方法检测色素含量。
实施例5本申请含橙色素和黄色素的红曲色素产品的制备
1)有机溶剂提取：将5克含红曲橙色素o1、o2，黄色素y1、y2及红色素r1、r2的红曲米粉碎，移入锥形瓶中,将红曲米和有机溶剂以1:20～30g/ml的料液比混合，其中该有机溶剂为石油醚：二氯甲烷＝1-2：1(v/v)，添加0.1-0.3v/v％甲酸的组合溶剂，超声辅助提取5-30min，超声频率300w,3500r/min离心10min，取上清液至新的离心管中。
将离心管中的物质采用实施例1的hplc方法检测色素含量。
实施例6本申请含橙色素和黄色素的红曲色素产品的制备
1)有机溶剂提取：将5克含红曲橙色素o1、o2，黄色素y1、y2及红色素r1、r2的红曲米粉碎，移入锥形瓶中，以红曲米和乙醇1:5～15g/ml的比例加入90-100％乙醇，添加0.3-0.5v/v％甲酸，超声辅助提取5-30min，超声频率300w,然后将提取液在3500r/min离心10min，取上清液至新的离心管中。
将离心管中的物质采用实施例1之hplc方法检测色素含量。
实施例7本申请含橙色素和黄色素的红曲色素产品的制备，或含红色素的红曲色素产品的制备
1)有机溶剂提取：将5克含红曲橙色素o1、o2及黄色素y1、y2的红曲米粉碎，移入锥形瓶中，以红曲米和乙醇1:5～15g/ml的比例加入70％乙醇溶液超声辅助提取5-30min，超声频率300w,然后将提取液在3500r/min离心10min，取上清液至新的离心管中。
2)硅胶柱层析精制：浓缩干燥提取物进行硅胶柱层析精制包括将浓缩干燥提取物溶于无水乙醇后与硅胶按重量比1：1混匀，挥干溶剂后，装入硅胶柱，控制分离用硅胶与载样硅胶比(w/w)约5～30:1，经二氯甲烷:甲醇＝50：0～1(v/v)洗脱，获得富含红曲橙色素o1、o2及黄色素y1、y2的红曲色素溶液组分1，然后用无水甲醇将残留在层析柱中的红色素洗脱，获得红色素溶液组分2。
分别旋转蒸发组分1和组分2，干燥后经实施例1的hplc方法测定色素，gb5009.222-2016检测方法测定桔霉素，获得富含红曲橙色素o1、o2及黄色素y1、y2、不含红色素和桔霉素的红曲色素产品1共计280mg和显著降低(与对比例1比较)的桔霉素的红曲红色素产品2共计660mg。
本实施例说明硅胶柱层析从红曲色素混合物中可高效分离制备出去除了红色素的黄色调的红曲色素产品1和红曲红色素产品2。
实施例8含橙色素或黄色素的红曲色素产品的制备
1)有机溶剂提取，按照实施例2进行；
2)硅胶柱层析精制，按照实施例2进行；
3)利用制备型液相色谱从富集的所述橙色素和黄色素分别提纯橙色素o1和o2中的一种或多种，或黄色素y1和y2中的一种或多种。
步骤3)具体包括：将实施例2步骤2)获得的1克柱层析富集的红曲色素产品溶于15ml色谱乙腈中，采用制备型液相色谱同时分离纯化o1、o2、y1、y2。流动相由a相水(0.1％甲酸)和b相(80％-100％乙腈)组成，等度洗脱或者梯度洗脱，流速10ml/min，紫外检测器，检测波长：410nm。纯化后的色素采用实施例1的hplc方法检测色素纯度。
对比例1红曲色素产品的制备
1)有机溶剂提取：将5克含红曲橙色素o1、o2及黄色素y1、y2的红曲米粉碎，移入锥形瓶中，以红曲米和乙醇1:5～15g/ml的比例加入70％乙醇溶液超声辅助提取5-30min，然后将提取液在3500r/min离心10min，取上清液至新的离心管中，实施例1之hplc方法检测色素含量。
对比例2红曲色素产品的制备
1)有机溶剂提取：将5克含有o1和o2的红曲米粉碎，移入锥形瓶中，以红曲米和二氯甲烷1:10～20g/ml的比例加入100％二氯甲烷溶液，超声辅助提取5-30min，然后将提取液在3500r/min离心10min，取上清液至新的离心管中，实施例1之hplc方法检测红曲色素产品中色素含量。
对比例3红曲色素产品的制备
1)有机溶剂提取：将5克含红曲橙色素o1、o2及黄色素y1、y2的红曲米粉碎，移入锥形瓶中，以红曲米和乙酸乙酯1:10～20g/ml的比例加入100％乙酸乙酯溶液，超声辅助提取5-30min，然后将提取液在3500r/min离心10min，取上清液至新的离心管中，实施例1之hplc方法检测色素产品中色素含量。
对比例4红曲色素产品的制备
1)有机溶剂提取：将5克含红曲橙色素o1、o2及黄色素y1、y2的红曲米粉碎，移入锥形瓶中，以红曲米和石油醚1:10～20g/ml的比例加入石油醚溶液，超声辅助提取5-30min，然后将提取液在3500r/min离心10min，取上清液至新的离心管中，hplc检测红曲米中色素含量。
实验结果
硅胶柱层析精制有机溶剂提取产物的提取方案比较
1、将各实施例制备的红曲色素产品按照下面的方法进行色素含量的测定，结果列于表1中。
分别准确吸取各实施例相同量提取液，挥干溶剂后，用色谱乙腈稀释50倍，采用实施例1的hplc检测条件测定色素含量。
2、分别准确吸取各实施例相同量提取液，挥干溶剂后，用相同体积色谱乙腈复溶，参照gb5009.222-2016检测方法测定桔霉素，结果列于表1中。
表1
从表1的结果可以看出，本申请采用不同于现有技术的单独有机溶剂提取，采用柱层析步骤，采用复合溶剂提取，均获得了显著的效果：
1)本申请单独有机溶剂提取效果：针对制备含橙色素和黄色素的红曲色素产品，相比于对比例1(现有技术单独70％乙醇提取方法)，单独90-100％乙醇(实施例6)，单独二氯甲烷(对比例2)，单独乙酸乙酯(对比例3)，均获得了显著提高的橙色素和黄色素提出率，显著降低的桔霉素、红色素含量。
2)本申请采用柱层析步骤效果：从对比例1与实施例7产品1和产品2的比较可以看出，相比于对比例1(现有技术单独70％乙醇提取方法)，增加柱层析步骤，一方面能富集想要的色素，另一方面能显著降低或去除想要富集的色素之外的其他色素。针对制备含橙色素和黄色素的红曲色素产品，单独有机溶剂提取(实施例6，对比例2-3)可实现桔霉素至少降低80％以上(实施例6降低幅度最小，约为84％)，但增加柱层析后，实施例2红色素和桔霉素均实现完全去除，实施例7产品1红色素和桔霉素均实现完全去除。针对制备含红色素的红曲色素产品(实施例7产品2)，相比于对比例1(现有技术单独70％乙醇提取方法)，在增加柱层析后，红色素的收率大幅度提高，橙色素和黄色素实现完全去除，桔霉素含量显著降低。
3)本申请采用复合溶剂提取效果：针对制备含橙色素和黄色素的红曲色素产品，相比于对比例1(现有技术单独70％乙醇提取方法)，单独石油醚(对比例4)提取，虽然提取产物不含有红色素和桔霉素，但橙色素和黄色素的提出率均较低，在石油醚与二氯甲烷或乙酸乙酯联合作为复合溶剂进行提取(实施例3-4)，能获得显著提高的橙色素和黄色素的提出率，同时红色素和桔霉素相比于对比例1(现有技术单独70％乙醇提取方法)显著降低。在石油醚 二氯甲烷 甲酸作为复合溶剂(实施例5)进行提取时，获得显著提高的橙色素和黄色素的提出率的同时，桔霉素相比于对比例1显著降低，红色素完全去除。
3、本申请提供的红曲色素产品在不同ph条件下色调检测
取适量实施例2制备的红曲色素产品，将其溶解于70％乙醇中，使用柯尼卡美能达cm-3600d分光测色计，采用ciel*a*b*(cielab)色彩模型，以明度l*和色度坐标a*、b*来表示颜色在色彩空间中的位置，用数值描述人眼可见的各种颜色。l*表示颜色的亮度(l*＝0表示黑色，l*＝100表示白色)，a*正值指示红色，负值指示绿色；b*正值指示黄色，负值指示蓝色。
表2本申请提供的红曲色素产品在不同ph下色调评价
ph9.0、11.0、13.0碱性环境下，红曲色素b*值(黄度)明显减小，色调角减小成负值，在400nm和520nm有两个最大吸收峰，色调呈紫红色。ph1、2、3、4的酸性环境下，红曲色素b*值(黄度)明显增大，色调角达到70以上，在470nm有最大吸收峰，色调为亮黄色。以上数据说明本申请提供的红曲色素产品在不同的ph环境下，可以分别作为红色和黄色着色剂应用于食品和非食品着色领域。
4、本申请提供的红曲色素产品与商业红曲红添加在肉制品中着色后色调及光稳定性比较
将本申请实施例2制备的红曲色素产品(a)溶解于70％乙醇中，每100克猪肉糜分别添加适量(a)和市售红曲红色素(b),充分混合均匀后分别标记为a0和b0测色调，室温放置30分钟后分别标记为a1和b1测色调，光照12小时后分别记为a2和b2测色调。色彩评价使用柯尼卡美能达cm-3600d分光测色计，结果如表3所示：实施例2制备的红曲色素产品添加入猪肉糜后a0的初始红度(a*)为10.78，室温放置30分钟后，a1红度(a*)迅速上升为16.54，肉糜色泽由微黄转为鲜红色，与添加红曲红色素的肉糜色彩近似。经过12小时的光照后a2和b2肉糜的红度和色差角分别为7.33,58.25和5.4，69.49，说明添加红曲色素a的肉糜，其红色调及其光稳定性均优于添加市售红曲红色素b。
因此，红曲色素产品(a)可以替代市售红曲红色素作为肉制品的红色着色剂使用。
表3红曲色素产品(a)与市售红曲红色素(b)添加于肉制品中与红曲红着色及色调光稳定性比较
5、本申请提供的红曲色素产品与商业红曲红着色白腐乳的色调比较
将本申请提供的红曲色素产品a与商业红曲红(即红曲色素产品b)分别用75％乙醇充分溶解，适当稀释后取50μl添加入1克腐乳中充分混合均匀，各取相同量着色前后的腐乳放置于盖玻片上，柯尼卡美能达cm-700d分光测色计分别采集着色前后腐乳l*a*b*结果如表4所示：白腐乳色调角83.53，呈淡黄色调；经本申请提供的红曲色素产品着色后a*值显著增大，b*值显著减小，色调角降至17.36，呈暗红色(与食品中的氨基酸反应后的颜色)。与市售红曲红着色白腐乳的色调近似。
表4红曲色素产品a与市售红曲红色素(b)添加于白腐乳中的色调比较
6、实施例8制备的红曲色素o1、o2、y1、y2(经hplc检测纯度大于90％)，分别溶于70％乙醇中，调节溶液的ph为1-14,采用柯尼卡美能达cm-700d分光测色计分别测定l*a*b*，，不同ph环境下o1和o2的色调变化结果如表5：ph1-7的酸性和弱碱环境下，红曲色素b*值(黄度)逐渐减小，色调角达到70以上，色调为亮黄色。色调呈紫红色。ph8-14的碱性环境下，红曲色素b*值(黄度)明显变小，色调角逐渐减小达到负值，颜色转变为紫红色。不同ph环境下y1和y2的色调变化结果如表6：y1和y2呈黄绿色，不同ph环境下色调无显著变化。本实施例说明富含o1、o2、y1、y2的红曲色素混合提取物的色调及不同ph环境下色调变化的主要贡献者为橙色素o1、o2。
表5不同ph环境下o1和o2的色调变化
表6不同ph环境下y1和y2的色调变化
1.一种含橙色素和黄色素的红曲色素产品，是利用有机溶剂提取含橙色素和黄色素的发酵产物获得提取产物，并由所述提取产物富集橙色素及黄色素得到，所述橙色素为橙色素o1和o2中的一种或多种，所述黄色素为黄色素y1和y2中的一种或多种，所述发酵产物为红曲米。
2.根据权利要求1所述的红曲色素产品，所述红曲色素产品为富集所述提取产物中的所述橙色素及黄色素，同时去除或显著降低所述提取产物中其他色素得到，所述其他色素包括红色素和桔霉素中的一种或多种，所述红色素为红色素r1和r2中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的红曲色素产品，所述有机溶剂含有二氯甲烷、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、除乙醇外的低级醇、三氯甲烷、乙腈、甲酸、乙酸和磷酸中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的红曲色素产品，有机溶剂提取后还包括利用硅胶柱层析精制所述提取产物以富集所述橙色素及黄色素。
5.根据权利要求4所述的红曲色素产品，所述利用硅胶柱层析精制所述提取产物以富集所述橙色素及黄色素的过程包括采用洗脱溶剂对硅胶柱进行洗脱以收集所述橙色素及黄色素，同时去除其他色素，所述其他色素包括红色素和桔霉素中的一种或多种，所述红色素为红色素r1和r2中的一种或多种，
所述洗脱溶剂为二氯甲烷和甲醇的混合物，二氯甲烷和甲醇比例为50：0～1(v/v)，或者所述洗脱溶剂为三氯甲烷和甲醇的混合物，三氯甲烷和甲醇比例为50：0～1(v/v)。
6.一种含橙色素和黄色素的红曲色素产品的制备方法，所述方法包括利用有机溶剂提取含橙色素和黄色素的发酵产物获得提取产物，并由所述提取产物富集橙色素及黄色素以得到所述红曲色素产品，所述橙色素为橙色素o1和o2中的一种或多种，所述黄色素为黄色素y1和y2中的一种或多种，所述发酵产物为红曲米。
7.根据权利要求6所述的方法，由所述提取产物富集橙色素及黄色素包括富集所述提取产物中的所述橙色素及黄色素，同时去除或显著降低所述提取产物中其他色素得到，所述其他色素包括红色素和桔霉素中的一种或多种，所述红色素为红色素r1和r2中的一种或多种。
8.根据权利要求6所述的方法，所述有机溶剂含有二氯甲烷、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、除乙醇外的低级醇、三氯甲烷、乙腈、甲酸、乙酸和磷酸中的一种或多种。
9.根据权利要求6所述的方法，有机溶剂提取后还包括利用硅胶柱层析精制所述提取产物以富集所述橙色素及黄色素的步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，所述利用硅胶柱层析精制所述提取产物以富集所述橙色素及黄色素的过程包括采用洗脱溶剂对硅胶柱进行洗脱以收集所述橙色素及黄色素，同时去除其他色素，所述其他色素包括红色素和桔霉素中的一种或多种，所述红色素为红色素r1和r2中的一种或多种，
所述洗脱溶剂为二氯甲烷和甲醇的混合物，二氯甲烷和甲醇比例为50：0～1(v/v)，或者所述洗脱溶剂为三氯甲烷和甲醇的混合物，三氯甲烷和甲醇比例为50：0～1(v/v)。
11.一种权利要求1-5任一项所述的含橙色素和黄色素的红曲色素产品作为红色着色剂和黄色着色剂的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，所述的含橙色素和黄色素的红曲色素产品在酸性条件下作为黄色着色剂，在碱性条件下，作为红色着色剂。
13.一种含红色素的红曲色素产品的制备方法，包括：
1)利用有机溶剂提取含红色素的发酵产物获得提取产物，并由所述提取产物富集红色素，所述红色素包括红色素r1和r2中的一种或多种，所述发酵产物为红曲米；
2)所述由所述提取产物富集红色素包括：利用硅胶柱层析精制步骤1)获得所述提取产物，以富集所述提取产物中的所述红色素，同时去除或显著降低所述提取产物中其他色素，所述其他色素包括橙色素、黄色素和桔霉素中的一种或多种，所述橙色素为橙色素o1和o2中的一种或多种，所述黄色素为黄色素y1和y2中的一种或多种。
14.一种含橙色素或黄色素的红曲色素产品的制备方法，包括：
1)利用有机溶剂提取含橙色素和黄色素的发酵产物获得提取产物，并由所述提取产物富集所述橙色素和黄色素，所述橙色素为橙色素o1和o2中的一种或多种，所述黄色素为黄色素y1和y2中的一种或多种，所述发酵产物为红曲米，
2)所述由所述提取产物富集橙色素和黄色素包括：利用硅胶柱层析精制步骤1)获得所述提取产物，以富集所述提取产物中的所述橙色素和黄色素，同时去除或显著降低所述提取产物中其他色素，所述其他色素包括红色素和桔霉素中的一种或多种，所述红色素为红色素r1和r2中的一种或多种；
3)利用制备型液相色谱由富集的所述橙色素和黄色素分别提纯橙色素o1和o2中的一种或多种，或黄色素y1和y2中的一种或多种。
技术总结