本发明涉及表面印迹聚合物，尤其涉及一种新型槲皮素表面印迹聚合物及其应用，属于分析检测材料领域。
背景技术：
谷物在生长、贮存等过程中容易受到真菌毒素的污染，常见的真菌毒素有黄曲霉毒素(aflatoxins，afs)、玉米赤霉烯酮等。其中afs性质稳定且对人和动物健康危害很大，afs种类较多，不同种类afs的结构有一些差别，常见的黄曲霉毒素g2，g1，b2和b1(afg2，afg1，afb2和afb1)结构类似，是afs中对人体的毒害最大的四种。而afb1毒性更甚，被评为一类天然致癌物，因此探索合适的afs检测方法尤为重要。检测结果的准确性基于可靠的样品前处理。表面印迹聚合物-固相萃取在复杂样品基质中的处理效果非常好，受人关注。
由于afs具有很强的毒性同时价格高昂，直接使用其作为模板对研究人员的身体健康存在着威胁，因此，需要选择合适的类似物作为afs的替代物充当合成模板，提高实验安全系数。另外，选择其载体尤为重要，mil-88a材料因为合成条件简单快速同时原料易得、高的抗化学腐蚀性、低密度、可控制的孔径、比表面积较大等优点在分析药物、生化样品方面受到广泛的关注，但是mil-88a对于特定的目标物质缺乏足够的亲和选择性，吸附能力有限度，而在其表面上合成印迹聚合物可以增强吸附性能以及对目标物质的特异选择性，因此采用其作为载体合成表面印迹聚合物(mil-88a@mips)具有良好的应用前景。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种新型槲皮素表面印迹聚合物，通过优化表面印迹聚合物，进而探索检测谷物样品中黄曲霉毒素的方法。
为实现本发明目的，本发明以金属有机骨架(mil-88a)为载体，选取与黄曲霉毒素结构类似的槲皮素为替代模板制备新型表面印迹聚合物(mil-88a@mips)。
具体技术方案如下：通过如下方法得到槲皮素表面印迹聚合物：
(1)mil-88a加入到盛有乙醇的锥形瓶中，封口超声混匀。
(2)将槲皮素和甲基丙烯酸(maa)加入盛有乙醇的三口瓶中，封口超声至溶解，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯(edma)，偶氮丁腈(aibn)继续超声至溶解。
(3)将步骤(1)中的混合溶液转移到步骤(2)溶液中，在室温下搅拌接触；然后升温反应，反应结束后烘干，得到槲皮素表面印迹聚合物模板。
(4)用滤纸包裹槲皮素表面印迹聚合物模板，利用索氏提取管洗脱，洗脱液为乙腈和水混合溶液(8：2v/v)。洗脱过程中间隔检测聚合物所在的提取液。直至检测不到槲皮素，最后，将聚合物干燥，得到槲皮素表面印迹聚合物，简称-88a@mips。
所述aibn质量为单体甲基丙烯酸(maa)和交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(edma)总质量的4％。
将合成的已洗脱除去模板的mil-88a@mips作为柱填料制成固相萃取柱，优化萃取条件。用此固相萃取柱对谷物等实际样品进行处理，然后利用hplc-fd进行检测，探索出一种灵敏高效可靠的afs检测方法。
模板和不同载体材料的选择都会影响表面印迹聚合物的吸附性能，本发明优点：1、采用afs的类似物槲皮素作为afs的替代物充当合成模板，合成的印迹聚合物mil-88a@mips不仅对afs有独特的选择性特异性吸附能力，而且实验安全系数更高。
2、以本发明mil-88a@mips为吸附剂制备固相萃取柱，mil-88a@mips最大吸附量为8.14μgmg-1，36s可达到吸附平衡。优化固相萃取条件，得到：洗脱液为乙腈:水＝8:2(v/v)，洗脱体积为2.5ml。建立检测谷物样品中痕量黄曲霉毒素的方法。对方法进行评价，得到了该方法在样品基质中对黄曲霉毒素b1、b2、g1和g2的检出限分别为0.06μgkg-1、0.08μgkg-1、0.08μgkg-1和0.05μgkg-1，定量限分别为0.20μgkg-1、0.25μgkg-1、0.25μgkg-1和0.17μgkg-1。在加标回收实验中，回收率在60.21％-115.97％范围内，相对标准偏差在1.61％-5.32％。在对比实验和实际样品检测实验中，可以看到自制柱对样品中的afb1、afb2、afg1和afg2均具有良好的回收效果。
3、以mil-88a@mips为柱填料所制备的固相萃取柱在使用过程中表现出更独特的实用价值，mil-88a不仅在合成时相对更绿色环保，且比表面积超大，所以由此制备的固相萃取柱的柱压会更小。在以往的实验中我们发现自制的固相萃取柱在使用时大多需要外部施压，才能有较为合适的流速。而本发明制备的固相萃取柱不需要外部施压，其自然流速与免疫亲和柱相当，因此其在实际应用中具有更大的实用性和较高的经济价值。
本发明制备的表面印迹聚合物固相萃取柱，对目标物都具有较好的选择性识别吸附；可以代替市售的商品柱对谷物中的真菌毒素进行样品前处理，性价比更高，性能稳定；建立的检测方法可靠，具有较低的检出限。有很好的推广应用前景。
附图说明
图1为本发明流程图，其中，|:mil-88a@mips的合成路线；||:mil-88a@mipsspe柱的使用流程图。
图2为红外光谱图，其中，(a)mips，(b)mil-88a@mips，(c)mil-88a。
图3为sem扫描电镜和透射电镜图，其中，(a)mil-88a，(b)mil-88a@mips，c、d为mil-88a@mips。
图4为mil-88a和mil-88a@mips的粒径分布图。
图5为mil-88a和mil-88a@mips的xrd图。
图6为本发明聚合物吸附性能的测定，a:等温吸附曲线；b:frendlich等温吸附模型；c:吸附速率曲线；d:伪二级动力学吸附模型。
图7为本发明对洗脱液的优化柱状图。
图8为本发明洗脱体积的优化。
图9为检测柱的色谱图对比图，其中a：mil-88a@mipsspe柱；b：免疫亲和柱。
具体实施方式
为对本发明进行更好地说明，举实施例如下：
液相色谱条件：c18柱(150mm*4.6mm，5μm)；流动相为甲醇-水(45:55，v/v)；流速：0.8mlmin-1；进样量：10μl；柱温：30℃；激发波长360nm，发射波长440nm。
以下没有特别说明，百分含量均为质量百分含量。所用试剂均为市售品。
实施例1
1、mil-88a的合成
称取5mmol(1.3515g)的fecl3·6h2o，5mmol(0.5804g)的富马酸和30ml去离子水放入100ml的反应釜中，室温下磁子搅拌1h混合均匀。取出磁子后，封釜，65℃下反应12h。放置过夜，使其自然降温，取出产物，用水和乙醇依次洗涤，过滤后置入真空干燥烘箱中烘干得到mil-88a，待用。
2、mil-88a@mips的制备
(1)将mil-88a(1g)加入到盛有50ml乙醇的锥形瓶(150ml)中，封口超声50min混匀。
(2)将0.3mmol(0.0859g)的槲皮素和1.8mmol(0.1550g)的maa加入盛有30ml乙醇的三口瓶(250ml)中，封口超声至溶解，加入15mmol(2.9733g)的edma和0.1251g的aibn(其质量为单体和交联剂总质量的4％)继续超声至溶解。
(3)将(1)中的混合溶液完全转移到(2)中的三口瓶中，首先在室温下机械搅拌30min，使其充分接触。然后升温至85℃反应，保持5h。过滤，烘干；得到表面印迹聚合物模板。
(4)用滤纸包裹槲皮素表面印迹聚合物模板，利用索氏提取管洗脱，洗脱液为乙腈和水混合溶液(8：2v/v)。洗脱过程中间隔检测聚合物所在的提取液。直至检测不到模板，最后，将聚合物干燥，得到(mil-88a@mips)最终产品，备用。
3、mil-88a@mips的制备和表征
制备mil-88a@mips的过程如图1，反应时间会影响聚合物的产量，产量过多会导致mil-88a表面的聚合物包裹过厚；产量过少会出现包裹不完全的情况，反应时的室温也会影响到聚合速度，因此需要间断性的观察聚合情况，控制反应时间。
(1)由图2知，1613cm-1和1698cm-1处的谱带归因于富马酸中羰基的对称和不对称振动模式。此外，在3137-3720cm-1处的宽频带归因于空气中水分子的o-h。在649cm-1和669cm-1处的吸收带对应于mil-88a上fe-o配位键，该峰同时出现在mil-88a和mil-88a@mips中，说明表面印迹聚合物模板(mil-88a@mips)中有mil-88a的参与。2951cm-1和2983cm-1处特征峰是由饱和碳上c-h的伸缩振动引起的，该峰同时出现在mips和mil-88a@mips中，说明表面印迹聚合物模板(mil-88a@mips)中有mips的参与。这两种现象的同时存在，互相印证了：mips在mil-88a的表面聚合，从而顺利得到了相应的表面印迹聚合物(mil-88a@mips)。
(2)由扫描电镜图3中a可以看到mil-88a呈现出均匀的六角棒状结构，颗粒度明显，表面光滑；图3中b可以看到mil-88a@mips同样呈现出棒状结构，相较于mil-88a表面较为粗糙蓬松，呈现簇状，表面有蜂窝状的孔。由图3的透射电镜图c和d可以看到，mil-88a@mips以mil-88a为核，表面包裹了mips层，包裹的mips层均匀完整，很好的覆盖在mil-88a表面，为mil-88a@mips的合成成功提供了有力证据。
(3)由图4可知mil-88a为4.02μm，mil-88a@mips为6.38μm。mil-88a颗粒在反应过程中由于受到受热情况、加热前的搅拌程度的影响，导致mil-88a的生长程度出现不平衡的情况；mil-88a@mips在聚合过程中可以持续观察聚合的状态，因此其颗粒大小控制的较好。
(4)由图5可知，mil-88a在10.46°和11.97°出现了特征峰，mil-88a@mips不仅包含上述特征峰，其在22.67°和28.70°还出现了特征峰，说明mil-88a@mips在mil-88a的基础上还包含的新的物质。xrd图中两种物质的特征峰都比较尖锐，说明mil-88a和mil-88a@mips的晶粒比较大，结晶度较好。
(5)吸附性能的测定：mil-88a@mips和mips的等温吸附实验数据如图6中a所示。在模板溶液浓度为0-30μgml-1的范围中，mil-88a@mips对模板的吸附呈现出直线上升的趋势，mil-88a@mips的最大吸附量可达到8.14μgmg-1，明显高于mips的吸附量。mil-88a@mips和mips在静态中吸附模板分子的数据拟合的freundlich的线性形式显示在图6中b，根据公式(2)计算上述方程式的常数系数。
公式分别为：
其中qe是平衡吸附量(μgmg-1)，ce是平衡浓度(μgml-1)，
线性化的等温方程显示为表1：
表1freundlich等温方程和伪二级动力学模型的参数
mil-88a@mips和mips对模板的吸附更适合freundlich等温模型，它表明吸附是多层的。其中mil-88a@mips的n值大于mips，前者更容易吸附。如图6中c所示，在吸附动力学实验中，mil-88a@mips表现出较快的吸附速率，在1分钟内即可达到吸附饱和。结合图6中d对吸附动力学数据进行拟合计算，根据公式(3)计算得到的数据如表1中的伪二级吸附模型所示。槲皮素在mips和mil-88a@mips上的吸附方式更倾向于化学吸附。因此可以判断mips和mil-88a@mips对槲皮素的吸附方式遵循伪二级动力学，而且吸附过程更倾向为化学吸附。
伪二级：
其中t(min)是吸附时间；qt和qe(μgmg-1)分别是mil-88a@mips在任意时间t和平衡时的吸附量；k2(mgμg-1min-1)为吸附速率常数。
实施例2
1、mil-88a@mips吸附性能的测定
在静态吸附实验中，称取八组10mg的mil-88a@mips，然后分别加入盛有4ml(0.5、1、5、8、10、15、20、30μgml-1)槲皮素标准溶液的离心管中，振荡混匀后放置1h。过滤，利用紫外可见分光光度计测定。将该值代入同等条件下配置的标准溶液曲线方程中，得到上清液中槲皮素的浓度，利用吸附量公式(1)，计算对应浓度下mil-88a@mips的吸附量。
动态吸附实验中，称取八组10mg的mil-88a@mips，将其分别装入盛有4ml浓度为10μgml-1的槲皮素模板标准溶液的12支离心管中，震荡吸附，静置的时间分别为0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8和1分钟，快速过滤上清液，利用紫外可见分光光度计测定，从而确定不同吸附时间下，溶液中剩余的槲皮素的量，利用公式(1)得到对应时间下mil-88a@mips的吸附量，绘制吸附动态曲线。
其中c0是吸附前模板的浓度(μgml-1)，c1是吸附后模板的浓度(μgml-1)，v是溶液体积(4ml)，m为mil-88a@mips的质量(mg)。
2、实际样品的制备
按照gb5009.22-2016对实际样品进行提取。将样品粉碎后，取5.0±0.1g的样品，加20ml的乙腈/水(84:16，v/v)溶液，振摇20min，玻璃纤维滤纸过滤。取4ml滤液，并加入46ml的1％的tween-20pbs缓冲溶液，即得到样品基质溶液。
3、mil-88a@mipsspe柱的制备
以本发明制得的mil-88a@mips作为mil-88a@mipsspe柱的吸附剂。湿法装柱，150mgmil-88a@mips用甲醇润湿，将其完全转移到底部带有筛板的空spe柱中。然后，用另一个筛板在上层覆盖吸附剂，按压使吸附剂颗粒间保持合适的距离，以致自制mil-88a@mipsspe柱在具有好的性能的同时在使用时保持较低的柱压。依次使用甲醇(10ml)和水(15ml)通过mil-88a@mipsspe柱，进行净化。当净化步骤中的去离子水即将完全离开mil-88a@mipsspe柱时，加入一定体积的样品提取液，流速保持在大约2-3滴/秒，样品提取液从自制柱中流过，提取液中的afs保留在柱内的吸附剂中。然后，用2.5ml乙腈：水(8:2，v/v)溶液将mil-88a@mipsspe柱中保留的afs带出来，用有机滤头过滤后转入进样瓶中。利用hplc-fd测定洗脱液带出的afs的量，从而计算mil-88a@mipsspe柱对afs的回收率。
4、固相萃取条件的优化
(1)淋洗洗脱液的优化
评估不同溶剂对保留在mil-88a@mipsspe柱中的afs的分离能力。基于此，选择合适的溶剂作为除去mil-88a@mipsspe柱中杂质的淋洗液和回收mil-88a@mipsspe柱中afs的洗脱液。尝试过丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂，由于其极性较大，往往会将更多的杂质带出mil-88a@mipsspe柱，当杂质的保留时间与afs相同时会大大影响实验结果的准确性，即出现了回收率超过200％的情况。样品中afs为痕量组分，因此少量杂质也会产生较大的影响。经试验选用甲醇作为淋洗液。
不同有机溶剂对afs的回收率如图7示，回收率越高，说明该溶剂对afs的洗脱能力越强。选择合适的洗脱液，不仅可以节省溶剂，而且也可以保证回收率。在吸附过程中由于氢键等非共价键的作用，目标物被mil-88a@mips上保留的孔穴吸附。当使用极性较弱的溶剂作为洗脱液时只能将mil-88a@mips表面非特异性吸附的目标物洗脱下来。但也许考虑到目标物的痕量性，因此极性过大的溶剂在将更多目标物洗脱下来的同时也带下来更多的杂质，必须要考虑这些杂质在对目标物进行分析时产生的影响。通过实验，发现80％的乙腈溶液对黄曲霉毒素的回收率已经达到104.65％，因此选择乙腈：水(8:2，v/v)为洗脱溶液。
不同洗脱液用量下检测黄曲霉毒素得到的数据制备的色谱图如图8示，相同体积的洗脱液，洗脱顺序越靠后，回收率越低，直至检测不到目标物。这说明在检测不到afs的这次洗脱液之前累积的洗脱液用量足以将目标物全部洗脱下来。由图8可知洗脱体积增加到2ml时，依然能检测到afg2和afb1的目标峰。当再次增加0.5ml的洗脱量时检测不到目标峰，因此确定洗脱液用量为2.5ml。通过这个实验发现，洗脱时流速的控制非常重要，流速低，脱液与保留在自制柱内的afs充分接触，可以更好地将afs带出柱内，提高回收率和实验准确性。
实施例3方法验证
(1)重复使用性实验
在重复6次的使用过程中，mil-88a@mipsspe柱对四种毒素的回收率维持在83.05％-98.92％，表现较为稳定。
(2)选择性实验
表2mil-88a@mipsspe柱对不同毒素的选择回收率
对同一样品添加不同的标准毒素，按照国标中afs的提取方法进行提取后分别通过mil-88a@mipsspe柱，利用建立的检测方法进行分析测试。实验结果见表2，发现mil-88a@mipsspe柱对afb1、afb2和afg1的回收率浮动在100％上下，对afg2的回收率在60％以上。而mil-88a@mipsspe柱对ota和zea的回收率则呈现出明显的下降，其中mil-88a@mipsspe柱对ota的回收率在9.24％，对zea的回收率较高，但也只达到21.13％。说明mil-88a@mipsspe柱对ota的回收效果最差，对afb2的回收效果最佳。实验结果证明mil-88a@mipsspe柱对afs具有独特的选择性识别能力。
(3)方法线性
评估方法的准确度和精密度，为排除样品基质对标准曲线的不良影响，因此测定了样品基质体系下的afb1、afb2、afg1和afg2的线性方程、线性范围以及lod、loq，如表3所示：
表3检测方法的线性曲线、线性范围、lod和loq
在线性范围内，afb1、afb2、afg1和afg2的浓度与测定值均呈现为正比关系；在此区间内，方法可靠适用。通过对比经自制柱所处理的含有低浓度afs的样品溶液和空白样品基质的信号，以信噪比为3:1得到的检出限如表3所示，分别为0.060μgkg-1、0.08μgkg-1、0.08μgkg-1和0.05μgkg-1；定量限分别为0.20μgkg-1，0.25μgkg-1，0.25μgkg-1和0.17μgkg-1。
(4)加标回收实验
在分析方法验证过程中，为保证测量结果的正确度，在空白样品基质中添加了三个浓度水平下的afb1、afb2、afg1和afg2标准品；为避免样品本身萃取效率带来的影响，在实验中，特别选择了常见的紫米样品进行加标实验。结果如表4。
表4加标回收率
实施例5mil-88a@mipsspe柱与免疫亲和柱的对比
mil-88a@mipsspe柱与免疫亲和柱的对比如图9所示，免疫亲和柱处理后的色谱图更干净利落，mil-88a@mipsspe柱处理后的色谱图波动稍多；就目标峰而言，两者无较大差异，免疫亲和柱对afg2的回收效果略优于mil-88a@mipsspe柱，但对afb1、afb2和afg1的回收率要略低于mil-88a@mipsspe柱。即mil-88a@mipsspe柱的性能可以达到免疫亲和柱的效果。单纯就使用效果进行比较，mil-88a@mipsspe柱与免疫亲和柱不相上下，但是mil-88a@mipsspe柱在其他方面(成本低、可重复使用、储存方便等)具有明显的优势。因此认为mil-88a@mipsspe柱可以代替市售的免疫亲和柱用于谷物样品中真菌毒素的预处理中，具有极大的实用价值。
mil-88a@mips为吸附剂制备的固相萃取柱的柱内压力较小，使用顺畅。mil-88a@mipsspe柱的自然流速较快，虽然mil-88a@mipsspe柱与目标物的接触时间短，洗脱液与保留在柱内的目标物的接触时间也较短，但通过与免疫亲和柱的对比以及加标回收等一系列实验，发现mil-88a@mipsspe柱的使用效果好，具有极高的实用价值，有望大批量生产投入市场应用。
实施例6实际样品分析
利用本发明制备的mil-88a@mipsspe柱对放置一年以上的黑豆(glycinemax(l.)merr)、紫米(polishedglutinousrice)和小麦(triticumaestivuml.)进行检测，目测观察到不同样品出现不同程度的霉变，部分开始生虫，甚至已经出现飞蛾。对上述样品进行检测，测定afs的含量，不同样品由于自身外壳硬度和含水量的不同，霉变的速度和程度也呈现较大的差异。
得到样品提取液中afb1、afb2、afg1和afg2的浓度如表5所示。结果表明不同样品由于其本身的生长情况不同，样品内产生真菌毒素的情况也大不相同，每一个毒素的生长速度也都不同。样品内的毒素含量不仅因其发霉严重程度不同而产生差异，样品自身的性质对毒素的生长也有一定的影响。
表5实际样品分析
a：未检测到。
1.一种槲皮素表面印迹聚合物，其特征在于，通过如下方法制备而成：
（1）mil-88a加入到盛有乙醇的锥形瓶中，封口超声混匀；
（2）将槲皮素和甲基丙烯酸（maa）加入盛有乙醇的三口瓶中，封口超声至溶解，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯（edma），偶氮丁腈（aibn）继续超声至溶解；
（3）将步骤（1）中的混合溶液转移到步骤（2）溶液中，在室温下搅拌接触；然后升温反应，反应结束后烘干，得到槲皮素表面印迹聚合物模板；
(4)用滤纸包裹槲皮素表面印迹聚合物模板，利用索氏提取管洗脱，洗脱液为乙腈和水混合溶液；洗脱过程中间隔检测聚合物所在的提取液，直至检测不到槲皮素，最后，将聚合物干燥，得到槲皮素表面印迹聚合物，简称-88a@mips。
2.如权利要求1所述的槲皮素表面印迹聚合物，其特征在于，所述aibn质量为单体甲基丙烯酸（maa）和交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯（edma）总质量的4%；所述洗脱液乙腈和水混合溶液体积比为8:2。
3.如权利要求1或2所述的槲皮素表面印迹聚合物的应用，其特征在于，将mil-88a@mips作为柱填料制成固相萃取柱，用此固相萃取柱对谷物中黄曲霉素afg2，afg1，afb2和afb1进行选择性吸附，经乙腈和水混合溶液洗脱富集，然后利用hplc-fd进行定性或定量检测。
技术总结