本发明属于制糖
技术领域：
，特别涉及一种抗右旋糖酐单克隆抗体d24及其在测定糖产品中右旋糖酐酶酶活中的应用。
背景技术：
：右旋糖酐酶(ec3.2.1.11)是一种能水解右旋糖酐α-1,6糖苷键的酶。右旋糖酐是一种聚d-葡萄糖，其葡萄糖残基以α-1,6-糖苷键连接成主链，支链由葡萄糖残基或葡萄糖链(简单或复杂的)以α-1,2-、α-1,3-或α-1,4-糖苷键连接在主链上。右旋糖酐是普遍存在于制糖过程的杂质，它对制糖过程有多种不利影响。利用右旋糖酐酶能水解右旋糖酐，消除其对制糖过程的不利影响。制糖过程某些工段的物料温度较高，会影响右旋糖酐酶的活性。随着右旋糖酐酶的深入开发，右旋糖酐酶的耐热性能越来越好，能更好地在制糖过程中应用。但随之带来了另一个问题，就是有活性的右旋糖酐酶可能会残留到最终糖产品中。右旋糖酐存在于制糖过程中是不利的，但存在于某些食品中却是有利的，比如：一，某些泡菜等发酵食品，其中的右旋糖酐调节了食品粘稠度和口感；二，某些面团中可能添加了右旋糖酐产生菌或直接添加右旋糖酐，其作用是改善面团的品质，包括增加延伸度、减少水分损失、延长保存期等；三，某些保健品中会添加低聚右旋糖酐作为益生元。若残留有有活性的右旋糖酐酶的糖产品添加到这些食品中，右旋糖酐酶可能会将右旋糖酐水解，影响食品品质。所以，需要一种测定糖产品中右旋糖酐酶酶活的方法。目前没有有关测定糖产品(包括白砂糖、精糖、红糖、液体糖等)中右旋糖酐酶酶活的公开报道。在公开资料中，有一种测定右旋糖酐酶酶制剂酶活的检测方法，是一种dns法，其原理是右旋糖酐酶酶解右旋糖酐，会产生一个糖链的还原端，而3,5-二硝基水杨酸(dns)能与还原端发生氧化还原反应，生成棕色物质，通过测定一定波长的吸光度可计算其含量，从而计算酶的活性，其缺点是检出限较高，但残留在糖产品中的右旋糖酐酶含量较少，酶活较低，故无法用dns法检出。在另外一些公开资料中，有提出测定糖产品中右旋糖酐含量的免疫比浊法和免疫比色法，其原理是样品所含右旋糖酐与抗右旋糖酐单克隆抗体特异性识别反应，形成右旋糖酐-抗右旋糖酐单克隆抗体复合物析出，使反应体系浊度增加或某一波长的吸光度增加，浊度增量或吸光度增量与右旋糖酐含量成正比，与标准系列比较定量。但由于右旋糖酐酶酶解右旋糖酐后，酶解产物仍然是右旋糖酐，它的含量没有显著变化(因为酶解过程仅将α-1,6-糖苷键切断，糖链一分为二，但总质量基本不变)，所以无法直接用公开的方法通过测定酶解前后右旋糖酐含量变化来推算右旋糖酐酶酶活。技术实现要素：为了解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种抗右旋糖酐单克隆抗体d24。本发明的另一个目的在于提供上述抗右旋糖酐单克隆抗体d24在测定糖产品中右旋糖酐酶酶活中的应用。本发明的再一目的在于提供一种测定糖产品中右旋糖酐酶酶活的方法。利用对右旋糖酐分子量变化敏感的抗右旋糖酐单克隆抗体d24，能够检测出糖产品中微量的右旋糖酐酶的酶活。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种抗右旋糖酐单克隆抗体d24，由保藏编号为cgmccno.21002的葡聚糖杂交瘤细胞株d24产生。所述的抗右旋糖酐单克隆抗体d24在测定糖产品中右旋糖酐酶酶活中的应用。一种测定糖产品中右旋糖酐酶酶活的方法，包括如下步骤：(1)标准曲线的绘制：(a)配制右旋糖酐酶酶活标准系列溶液；(b)将标准系列溶液各取1ml分别与100～300mg/l右旋糖酐溶液混合，反应，沸水浴中止反应，得反应液1，冷却备用；测量0.1～0.3mg/ml抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液的散射浊度，即为反应前的散射浊度；向上述抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液中加入反应液1，混合反应1～3min后测其散射浊度，即为反应后的散射浊度，反应前后的散射浊度之差即为散射浊度差；以右旋糖酐酶酶活为横坐标，以散射浊度差为纵坐标，建立右旋糖酐酶酶活标准曲线；(2)样品的测定：将100～200g/l待测样品溶液与100～300mg/l右旋糖酐溶液混合，反应，沸水浴中止反应，得反应液2，冷却备用；测量0.1～0.3mg/ml抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液的散射浊度，即为反应前的散射浊度；向上述抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液中加入反应液2，混合反应1～3min后测其散射浊度，即为反应后的散射浊度，反应前后的散射浊度之差即为散射浊度差；利用步骤(1)的标准曲线即可计算出待测样品溶液中的右旋糖酐酶酶活。所述的右旋糖酐酶酶活标准系列溶液通过利用右旋糖酐酶酶液加水稀释得到；所述的右旋糖酐酶优选为商品化右旋糖酐酶。所述的右旋糖酐酶酶活的标准系列溶液优选为0～0.00001u/ml的右旋糖酐酶酶活标准系列溶液；更优选为0、0.000002u/ml、0.000004u/ml、0.000006u/ml、0.000008u/ml、0.00001u/ml的右旋糖酐酶酶活标准系列溶液。所述的右旋糖酐溶液优选以缓冲液为溶剂制备得到；所述的缓冲液优选ph为4.5～6.5、0.1～0.2mol/l的缓冲液；所述的缓冲液的种类优选包括但不限于磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中的至少一种。所述的右旋糖酐优选为分子量不低于50万的右旋糖酐；进一步优选为分子量为50万～200万的右旋糖酐；更优选为右旋糖酐t-2000和右旋糖酐t-500中的至少一种。所述的抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液优选以ph为7.2～7.4、0.1mol/l的pbs缓冲液为溶剂制备而成。步骤(b)中所述的标准系列溶液与右旋糖酐溶液优选按体积比(1～2):1计算。步骤(b)中所述的反应的条件优选为40～65℃反应0.5～2h。步骤(b)中所述的沸水浴中止反应的时间优选为5min。步骤(b)中所述的抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液与反应液1优选按体积比100:(1～2)计算。步骤(2)中所述的待测样品优选包括但不限于固体糖和液体糖中的至少一种。所述的固体糖优选包括但不限于白砂糖和精糖中的至少一种。所述的液体糖优选为全蔗糖糖浆和转化糖浆中的至少一种；更优选为全蔗糖糖浆。步骤(2)中所述的待测样品溶液的溶剂为水；更优选为蒸馏水。步骤(2)中所述的待测样品溶液与右旋糖酐溶液优选按体积比(1～2):1计算。步骤(2)中所述的反应优选为40～65℃反应0.5～2h。步骤(2)中所述的沸水浴中止反应的时间优选为5min。步骤(2)中所述的抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液与反应液2优选按体积比100:(1～2)计算。与现有技术相比，本发明具有如下的优点及有益效果：(1)本申请人意外发现，抗右旋糖酐单克隆抗体d24对右旋糖酐分子量变化比较敏感，而右旋糖酐酶能够将大分子量的右旋糖酐降解为更小分子量的右旋糖酐，因此可将其用于测定糖产品中的右旋糖酐酶。(2)本发明提供了一种测定糖产品中右旋糖酐酶酶活的方法，该方法操作简单，检出限低、不受右旋糖酐外切酶的干扰。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。右旋糖酐酶购自中诺生物科技发展江苏有限公司；右旋糖酐t-2000(分子量2000000)、右旋糖酐t-500(分子量500000)、t-70(分子量70000)、t40(分子量40000)、t20(分子量20000)、t10(分子量10000)均购于上海泽叶生物科技有限公司；抗右旋糖酐单克隆抗体d24由保藏编号为：cgmccno.21002的葡聚糖杂交瘤细胞株d24产生。白砂糖购于广州华糖食品有限公司；全蔗糖糖浆购于广州华糖食品有限公司；精糖购于广州市华侨糖厂。实施例1：抗右旋糖酐单克隆抗体d24的制备将体格强健、生长状况良好的6～8周龄balb/c小鼠(购自南方医科大学实验动物中心)腹腔接种液体石蜡，每只小鼠0.5ml，两周后，腹腔接种用无血清培养基(购自thermofisherscientific)稀释的葡聚糖杂交瘤细胞株d24(保藏编号为：cgmccno.21002)，每只小鼠5×105个/0.2ml。间隔8天后，每天观察小鼠腹水产生情况，待腹水尽可能多而小鼠濒于死亡时，处死小鼠，无菌条件下将腹水吸出。室温静止30min，10000rpm离心10min，收集上清，-70℃冻存备用。纯化方案为辛酸-硫酸铵沉淀法。取1份预处理过的腹水加2份0.06mol/lph4.0醋酸缓冲液，用1mol/lhcl调ph至4.5；按每毫升稀释腹水加11μl辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30min内加完，4℃静置2h，取出12000rpm离心30min，弃沉淀；上清经尼龙筛过滤(尼龙筛直径125μm)，加入1/10体积的0.1mol/lph7.2pbs缓冲液，用1mol/lnaoh调ph至7.2；在4℃下加入饱和硫酸铵至45％饱和度，轻轻混匀30min，静置1h；12000rpm离心30min，弃上清；沉淀溶于50～100倍体积的pbs缓冲液中，用50～100倍体积的pbs透析，4℃过夜；取出12000rpm离心30min，除去不溶性沉淀，冷冻干燥，得到冻干粉，命名为抗右旋糖酐单克隆抗体d24冻干粉，备用。实施例2：抗右旋糖酐单克隆抗体d24和α-葡聚糖单克隆抗体对右旋糖酐分子量敏感性试验以ph5.5、0.1mol/l的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为溶剂分别配制100mg/l的右旋糖酐t-2000(分子量2000000)、右旋糖酐t-500(分子量500000)、右旋糖酐t-70(分子量70000)、右旋糖酐t-40(分子量40000)、右旋糖酐t-20(分子量20000)、右旋糖酐t-10(分子量10000)溶液。α-葡聚糖单克隆抗体通过中国专利申请201010606983.5α-葡聚糖抗原及特异性单克隆抗体的制备方法中记载的方法制备得到，具体地，α-葡聚糖单克隆抗体从注射保藏编号为cctccc2010107的杂交瘤细胞株d9的小鼠腹水中纯化得到(本实验室已发表的专利申请201310625649.8，单克隆抗体免疫比浊定量检测α-葡聚糖的试剂盒中也有记载)。以ph7.2、0.1mol/lpbs缓冲液为溶剂分别配制0.3mg/ml抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液和α-葡聚糖单克隆抗体冻干粉剂溶液。分别取1.5ml抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液和α-葡聚糖单克隆抗体冻干粉剂溶液测量其散射浊度，即反应前的散射浊度；然后向上述抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液和α-葡聚糖单克隆抗体冻干粉剂溶液中分别加入15μl右旋糖酐(右旋糖酐t-2000、右旋糖酐t-500、右旋糖酐t-70、右旋糖酐t-40、右旋糖酐t-20、右旋糖酐t-10)溶液，开始计时，加盖摇匀，精确测量1min后的散射浊度，即反应后的散射浊度，计算反应前后的散射浊度差。分别用抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液和α-葡聚糖单克隆抗体冻干粉剂溶液测定上述6种分子量的右旋糖酐，得到以下数据。表2-1：t-2000t-500t-70t-40t-20t-10抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液30.429.926.525.021.512.2α-葡聚糖单克隆抗体冻干粉剂溶液30.530.430.430.530.230.3从上述数据可知，抗右旋糖酐单克隆抗体d24对右旋糖酐分子量敏感；而α-葡聚糖单克隆抗体对右旋糖酐分子量不敏感。由于右旋糖酐酶需要与右旋糖酐反应，若选择的右旋糖酐的分子量低于50万，不易与右旋糖酐酶反应完全，故在本申请中需要选择分子量不低于50万的右旋糖酐。实施例3：一种测定白砂糖中右旋糖酐酶酶活的方法(1)标准曲线的绘制配制右旋糖酐酶酶活分别为0、0.000002u/ml、0.000004u/ml、0.000006u/ml、0.000008u/ml、0.00001u/ml的标准系列溶液。以ph5.5、0.1mol/l的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为溶剂配制200mg/l右旋糖酐t-2000溶液。取6支5mlep管，分别加入1ml右旋糖酐t-2000溶液和1ml上述标准系列溶液，在65℃反应30min后，沸水浴5min；得反应液1，冷却到室温，备用。用ph7.2、0.1mol/lpbs缓冲液配制0.3mg/ml对右旋糖酐分子量变化敏感的抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液。取1.5ml抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液测量其散射浊度，即反应前的散射浊度；然后向上述抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液中加入15μl反应液1，开始计时，加盖摇匀，精确测量1min后的散射浊度，即反应后的散射浊度，计算反应前后的散射浊度差。重复上述试验，得出6个标准系列点，数据如下：表3-1：绘制出右旋糖酐酶酶活(x)与散射浊度差(y)的线性关系式y＝ax b。其中a＝-2.724×106，b＝30.121，r2＝0.998。(2)样品的测定将白砂糖用蒸馏水配制成浓度为200g/l的白砂糖溶液，按步骤(1)所述方法配制200mg/l右旋糖酐t-2000溶液。取1支5mlep管，加入1ml右旋糖酐t-2000溶液和1ml白砂糖溶液，在65℃反应30min后，沸水浴5min，得反应液2，冷却到室温，备用。按步骤(1)所述方法配制0.3mg/ml对右旋糖酐分子量变化敏感的抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液。取1.5ml抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液测量其散射浊度，即反应前的散射浊度；然后向上述抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液中加入15μl上述反应液2，开始计时，加盖摇匀，精确测量1min后的散射浊度，即反应后的散射浊度，计算反应前后的散射浊度差。利用上述关系式计算出白砂糖溶液中右旋糖酐酶酶活，再计算出待测白砂糖中右旋糖酐酶酶活，结果如下：表3-2：实施例4：一种测定全蔗糖糖浆中右旋糖酐酶酶活的方法(1)标准曲线的绘制配制右旋糖酐酶酶活分别为0、0.000002u/ml、0.000004u/ml、0.000006u/ml、0.000008u/ml、0.00001u/ml的标准系列溶液。以ph4.5、0.2mol/l的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液为溶剂配制300mg/l右旋糖酐t-500溶液。取6支5mlep管，分别加入1ml右旋糖酐t-500溶液和2ml上述标准系列溶液，在40℃反应2h后，沸水浴5min，得反应液1，冷却到室温，备用。用ph7.40.1mol/lpbs缓冲液配制0.2mg/ml对右旋糖酐分子量变化敏感的抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液。取1.5ml抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液测量其散射浊度，即反应前的散射浊度；然后向上述抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液中加入30μl反应液1，开始计时，加盖摇匀，精确测量3min后的散射浊度，即反应后的散射浊度，计算反应前后的散射浊度差。重复上述试验，得出6个标准系列点，数据如下：表4-1：绘制出标准系列溶液酶浓度(x)与散射浊度差(y)的线性关系式y＝ax b。其中a＝-3.178×106，b＝34.514，r2＝0.993。(2)样品的测定将全蔗糖糖浆用蒸馏水配制成浓度为150g/l的全蔗糖糖浆溶液，按步骤(1)所述方法配制300mg/l右旋糖酐t-500溶液。取1支5mlep管，加入1ml右旋糖酐t-500溶液和1ml全蔗糖糖浆溶液，在40℃反应2h后，沸水浴5min，得反应液2，冷却到室温，备用。按步骤(1)所述方法配制0.2mg/ml对右旋糖酐分子量变化敏感的抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液。取1.5ml抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液测量其散射浊度，即反应前的散射浊度；然后向上述抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液中加入15μl上述反应液2，开始计时，加盖摇匀，精确测量3min后的散射浊度，即反应后的散射浊度，计算反应前后的散射浊度差。利用上述关系式计算出全蔗糖糖浆溶液中右旋糖酐酶酶活，再计算出待测全蔗糖糖浆中右旋糖酐酶酶活，结果如下：表4-2：实施例5：一种测定精糖中右旋糖酐酶酶活的方法(1)标准曲线的绘制配制右旋糖酐酶酶活分别为0、0.000002u/ml、0.000004u/ml、0.000006u/ml、0.000008u/ml、0.00001u/ml的标准系列溶液。以ph6.5、0.15mol/l的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为溶剂配制100mg/l右旋糖酐t-2000溶液。取6支5mlep管，分别加入1ml右旋糖酐t-2000溶液和1.5ml标准系列溶液，在55℃反应1h后，沸水浴5min；得反应液1，冷却到室温，备用。用ph7.3、0.1mol/lpbs缓冲液配制0.1mg/ml对右旋糖酐分子量变化敏感的抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液。取1.5ml抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液测量其散射浊度，即反应前的散射浊度；然后向上述抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液中加入25μl反应液1，开始计时，加盖摇匀，精确测量2min后的散射浊度，即反应后的散射浊度，计算反应前后的散射浊度差；重复上述试验，得出6个标准系列点，数据如下：表5-1：绘制出右旋糖酐酶酶活(x)与散射浊度差(y)的线性关系式y＝ax b。其中a＝-1.452×106，b＝16.22，r2＝0.994。(2)样品的测定将精糖用蒸馏水配制成浓度为100g/l的精糖溶液，按步骤(1)所述方法配制右旋糖酐t-2000溶液。取1支5mlep管，加入1ml右旋糖酐t-2000溶液和1ml精糖溶液，在55℃反应1h后，沸水浴5min，得反应液2，冷却到室温，备用。按步骤(1)所述方法配制0.1mg/ml对右旋糖酐分子量变化敏感的抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液。取1.5ml抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液测量其散射浊度，即反应前的散射浊度；然后向上述抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液中加入15μl上述反应液2，开始计时，加盖摇匀，精确测量2min后的散射浊度，即反应后的散射浊度，计算反应前后的散射浊度差。利用上述关系式计算出精糖溶液中右旋糖酐酶酶活，再计算出待测精糖中右旋糖酐酶酶活，结果如下：表5-2：实施例6：dns法测定白砂糖中右旋糖酐酶酶活将白砂糖(跟实施例3为同一批次完全相同的样品)用蒸馏水配制成浓度为200g/l的溶液，取100ml上述白砂糖溶液分成两份，其中一份沸水浴5min灭活，为灭活白砂糖溶液。用ph5.5、0.2mol/l的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制20g/l葡聚糖t-2000溶液。取3支25ml比色管，分别加入0.9ml葡聚糖t-2000溶液，60℃水浴5min后，分别向水浴后的葡聚糖t-2000溶液中加入0.1ml蒸馏水、白砂糖溶液和灭活白砂糖溶液，反应10min，加入2mldns溶液，沸水浴5min，定容到25ml。以加蒸馏水的为空白，测定另外两管的od540。重复测定6次，结果如下：表6-1：白砂糖0.0010000.0010灭活白砂糖000.001-0.0010.0010经分析，两组数据没有显著性差异，说明dns法无法确定该白砂糖样品中是否有右旋糖酐酶，主要原因是dns法检出限太高。实施例7：使用α-葡聚糖单克隆抗体进行实施例2的相同试验α-葡聚糖单克隆抗体通过中国专利申请201010606983.5α-葡聚糖抗原及特异性单克隆抗体的制备方法中记载的方法制备得到，具体地，α-葡聚糖单克隆抗体从注射保藏编号为cctccc2010107的杂交瘤细胞株d9的小鼠腹水中纯化得到(本实验室已发表的专利申请201310625649.8，单克隆抗体免疫比浊定量检测α-葡聚糖的试剂盒中有记载)。下面将由注射杂交瘤细胞株d9的小鼠腹水中纯化得到的α-葡聚糖单克隆抗体简称为d9。本单位均有参与d9的研发过程和进行有关右旋糖酐含量测定的试验研究，故本单位将实施例3中的抗右旋糖酐单克隆抗体d24替换为d9进行研究，实验方法同实施例3，结果发现，d9并不适用于本申请实施例3所述的测定白砂糖中右旋糖酐酶酶活的方法，发明人分析原因可能是d9与同一浓度不同分子量的右旋糖酐进行反应后，其浊度增量(即散射浊度差)或吸光度增量(即免疫比色法中的吸光度差)响应一致。以下结合具体实验数据予以说明：(1)免疫比浊法的标准曲线绘制配制右旋糖酐酶酶活分别为0、0.000002u/ml、0.000004u/ml、0.000006u/ml、0.000008u/ml、0.00001u/ml的标准系列溶液。以ph5.5、0.2m的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为溶剂配制200mg/l右旋糖酐t-2000溶液。取6支5mlep管，分别加入1ml右旋糖酐t-2000溶液和1ml标准系列溶液，在65℃反应30min后，沸水浴5min，得反应液1，冷却到室温，备用。用ph7.2、0.1mol/lpbs缓冲液配制0.3mg/mld9溶液。取1.5mld9溶液测量其散射浊度，即反应前的散射浊度；然后向上述d9溶液中加入15μl反应液1，开始计时，加盖摇匀，精确测量1min后的散射浊度，即反应后的散射浊度；计算反应前后的散射浊度差。重复上述试验，得出6个标准系列点，数据如下：表7-1：结果发现：浓度相同的右旋糖酐t-2000溶液与不同右旋糖酐酶标准系列溶液反应后，可得到浓度相同但分子量不同的右旋糖酐溶液(酶量越大，右旋糖酐分子量越小)，但浓度相同分子量不同的右旋糖酐溶液与d9反应后，其散射浊度增量相同，无法区别，所以d9不适用于本发明所述方法。(2)免疫比色法的标准曲线绘制配制右旋糖酐酶酶活分别为0、0.000002u/ml、0.000004u/ml、0.000006u/ml、0.000008u/ml、0.00001u/ml的标准系列溶液。以ph＝5.5、0.2mol/l的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为溶剂配制200mg/l右旋糖酐t-2000溶液。取6支5mlep管，分别加入1ml右旋糖酐t-2000溶液和1ml标准系列溶液，在65℃反应30min后，沸水浴5min，得反应液1，冷却到室温，备用。用ph7.2、0.1mol/lpbs缓冲液配制0.3mg/mld9溶液。取1.5mld9溶液，测量其od720，然后向上述1.5mld9溶液中加入15μl反应液1，开始计时，加盖摇匀，测量15min后的od720，计算反应前后的吸光度差。重复上述试验，得出6个标准系列点，数据如下：表7-2：结果发现：浓度相同的右旋糖酐t-2000溶液与不同右旋糖酐酶标准系列溶液反应后，可得到浓度相同但分子量不同的右旋糖酐溶液(酶量越大，右旋糖酐分子量越小)，但浓度相同分子量不同的右旋糖酐溶液与d9反应后，其吸光度增量相同，无法区别。所以d9不适用于本发明所述方法。实施例8：逐步稀释法研究本申请所述方法的检出限配制右旋糖酐酶酶活分别为0.0000007u/ml、0.0000006u/ml、0.0000005u/ml、0.0000004u/ml的标准系列溶液。用ph＝5.5、0.2mol/l的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液为溶剂配制200mg/l葡聚糖t-2000溶液。取4支5mlep管，分别加入1ml右旋糖酐t-2000溶液和1ml标准系列溶液，在65℃反应30min后，沸水浴5min。得反应液1，冷却到室温，备用。用ph＝7.2、0.1mol/lpbs缓冲液配制0.3mg/ml对右旋糖酐分子量变化敏感的抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液。取1.5ml抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液测量其散射浊度，即反应前的散射浊度；然后向上述抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液中加入15μl反应液1，开始计时，加盖摇匀，精确测量1min后的散射浊度，即反应后的散射浊度；计算反应前后的散射浊度差。重复上述试验6次，数据如下：表8-1：从表8-1可以看出：本申请所述方法检出限为0.0000005u/ml。由此可见，本发明所述的测定糖产品中右旋糖酐酶酶活的方法，操作简单，检出限低、不受右旋糖酐外切酶的干扰。实施例9：灵敏度测定按照实施实例3的标准曲线可知，该实施例的灵敏度为1/(2.724×106)＝3.671×10-7u/ml/ntu。可见，本发明所述方法的灵敏度较高。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 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技术特征：1.一种抗右旋糖酐单克隆抗体d24，其特征在于，由保藏编号为cgmccno.21002的葡聚糖杂交瘤细胞株d24产生。
2.权利要求1所述的抗右旋糖酐单克隆抗体d24在测定糖产品中右旋糖酐酶酶活中的应用。
3.一种测定糖产品中右旋糖酐酶酶活的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)标准曲线的绘制：
(a)配制右旋糖酐酶酶活的标准系列溶液；
(b)将标准系列溶液各取1ml分别与100～300mg/l右旋糖酐溶液混合，反应，沸水浴中止反应，得反应液1，冷却备用；
测量0.1～0.3mg/ml抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液的散射浊度，即为反应前的散射浊度；向上述抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液中加入反应液1，混合反应1～3min后测其散射浊度，即为反应后的散射浊度，反应前后的散射浊度之差即为散射浊度差；以右旋糖酐酶酶活为横坐标，以散射浊度差为纵坐标，建立右旋糖酐酶酶活标准曲线；
(2)样品的测定：将100～200g/l待测样品溶液与100～300mg/l右旋糖酐溶液混合，反应，沸水浴中止反应，得反应液2，冷却备用；
测量0.1～0.3mg/ml抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液的散射浊度，即为反应前的散射浊度；向上述抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液中加入反应液2，混合反应1～3min后测其散射浊度，即为反应后的散射浊度，反应前后的散射浊度之差即为散射浊度差；利用步骤(1)的标准曲线即可计算出待测样品溶液中的右旋糖酐酶酶活。
4.根据权利要求3所述的测定糖产品中右旋糖酐酶酶活的方法，其特征在于，所述的右旋糖酐酶酶活的标准系列溶液为0～0.00001u/ml的右旋糖酐酶酶活标准系列溶液；
进一步为0、0.000002u/ml、0.000004u/ml、0.000006u/ml、0.000008u/ml、0.00001u/ml的右旋糖酐酶酶活标准系列溶液。
5.根据权利要求3所述的测定糖产品中右旋糖酐酶酶活的方法，其特征在于，所述的右旋糖酐溶液以缓冲液为溶剂制备得到；
所述的缓冲液ph为4.5～6.5、0.1～0.2mol/l的缓冲液；
所述的缓冲液的种类包括磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中的至少一种。
6.根据权利要求3所述的测定糖产品中右旋糖酐酶酶活的方法，其特征在于，
所述的右旋糖酐为分子量不低于50万的右旋糖酐；
进一步为分子量为50万～200万的右旋糖酐；
更进一步为右旋糖酐t-2000和右旋糖酐t-500中的至少一种；
所述的抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液以ph为7.2～7.4、0.1mol/l的pbs缓冲液为溶剂制备而成。
7.根据权利要求3所述的测定糖产品中右旋糖酐酶酶活的方法，其特征在于，
步骤(b)中所述的标准系列溶液与右旋糖酐溶液按体积比1～2:1计算；
步骤(b)中所述的反应的条件为40～65℃反应0.5～2h；
步骤(b)中所述的沸水浴中止反应的时间为5min；
步骤(b)中所述的抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液与反应液1按体积比100:1～2计算。
8.根据权利要求3所述的测定糖产品中右旋糖酐酶酶活的方法，其特征在于，
步骤(2)中所述的待测样品包括固体糖和液体糖中的至少一种；
所述的固体糖包括白砂糖和精糖中的至少一种；
所述的液体糖为全蔗糖糖浆和转化糖浆中的至少一种；进一步为全蔗糖糖浆。
9.根据权利要求3所述的测定糖产品中右旋糖酐酶酶活的方法，其特征在于，
步骤(2)中所述的待测样品溶液的溶剂为水；进一步为蒸馏水；
步骤(2)中所述的待测样品溶液与右旋糖酐溶液按体积比1～2:1计算；
步骤(2)中所述的反应为40～65℃反应0.5～2h；
步骤(2)中所述的沸水浴中止反应的时间为5min。
10.根据权利要求3所述的测定糖产品中右旋糖酐酶酶活的方法，其特征在于，
步骤(2)中所述的抗右旋糖酐单克隆抗体d24溶液与反应液2按体积比100:1～2计算。
技术总结本发明公开了一种抗右旋糖酐单克隆抗体D24及其在测定糖产品中右旋糖酐酶酶活中的应用，属于制糖技术领域。本发明所述的抗右旋糖酐单克隆抗体D24，由保藏编号为：CGMCC No.21002的葡聚糖杂交瘤细胞株D24产生。该抗右旋糖酐单克隆抗体D24能够用于测定糖产品中右旋糖酐酶酶活。本发明提供了一种测定糖产品中右旋糖酐酶酶活的方法，该方法操作简单，检出限低。
技术研发人员：常国炜;梁达奉;柳颖;刘桂云
受保护的技术使用者：广东省科学院生物工程研究所
技术研发日：2020.11.25
技术公布日：2021.08.03
