本发明涉及动物食品加工
技术领域：
，具体涉及一种具有缓解疲劳和改善骨密度功能的牛骨胶原蛋白肽及其制备方法。
背景技术：
：畜禽骨占其体重的比例为10％～20％，每年仅畜禽骨的下脚料就达几千万吨，是肉类加工工业中非常重要的副产物，但是大多没有得到充分的利用，被深加工的不足2％，造成极大的浪费。尽管畜禽骨资源非常丰富，但是对畜禽骨的开发利用比较落后，除直接用于日常饮食中的排骨和腔骨以及生产明胶外，还有大量的畜禽骨被加工成骨粉饲料或传统原料等附加值很低的初级产品，甚至被直接丢弃，造成资源浪费和环境污染。畜禽骨营养丰富，尤其是蛋白质含量很高而且生物效价高，加大对畜禽骨的研究利用有利于解决蛋白质资源紧缺的问题。骨质疏松症是由于多种原因导致骨密度下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，从而容易发生骨折的全身性骨病。雌激素水平降低等可能导致骨质疏松发生，骨重建过程中骨吸收作用大于骨形成作用致使骨质流失，最终使骨量减少、骨组织微结构破坏、骨强度下降和骨脆性增加，因此极易发生骨折。研究表明，骨折的发生是可预防、诊断和治疗的，长期规律的治疗是增加骨密度、降低骨折风险的重要保障。畜禽骨经酶解后生成的小分子肽有利于人体的消化吸收，还具有功能特性。由此开发骨蛋白制品和功能性食品，不仅可以产生很高的经济效益，同时解决了资源浪费和环境污染的问题，形成一个健康、持续发展的产业。牛骨中的蛋白经酶解后的多肽产物组成十分复杂，其中包含大量未知序列、未知功能的多肽，而具有特定功能的活性肽可能包含具有不同氨基酸组成、不同分子量大小的多种肽，较难通过某些共性特征将其区分。这些都对具有特定功能的牛骨肽的开发造成较大困难。现有技术中的牛骨肽很多并不具有特定的功能，同时具有较好的缓解疲劳和改善骨密度功能的牛骨肽更是甚少。此外，现有技术在酶解过程中，多需要添加酸碱调节ph，这不仅增加了工艺的复杂性和成本，而且，也可能会影响产品的功能特性，增加产品灰分含量。技术实现要素：本发明的目的是提供一种牛骨胶原蛋白肽，该牛骨胶原蛋白肽同时具有缓解疲劳和改善骨密度的功能。本发明的另一目的是提供该牛骨胶原蛋白肽的制备方法。本发明以开发同时具有缓解疲劳和改善骨密度功能的牛骨胶原蛋白肽为研究目标，针对牛骨的原料特性和成分组成特点，开发以牛骨为原料生产具有缓解疲劳和改善骨密度功能的制备工艺。本发明在研发过程中尝试多种单一酶解和复合酶解，很多方法虽然能够获得分子量较小的肽，但获得的肽根本不具有缓解疲劳和改善骨密度的功能，或者功能较差。在众多方法中，本发明确定了适于牛骨的、在不依赖酸或碱进行ph的调节的情况下，能够获得具有较好的缓解疲劳和改善骨密度功能的牛骨肽的制备工艺。具体地，本发明提供以下技术方案：本发明提供一种牛骨胶原蛋白肽的制备方法，该方法包括如下步骤：以牛骨为原料，将经预处理的原料经复合蛋白酶解制得酶解物；所述复合蛋白酶为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶。优选地，所述复合蛋白酶中，中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的质量之比为(2-4)：(2-5)：(1-2)，所述中性蛋白酶的酶活为100,000-650,000u/g，所述木瓜蛋白酶的酶活为100,000-1,000,000u/g，所述风味蛋白酶的酶活为80,000-250,000u/g。本发明发现，采用上述复合蛋白酶的酶解方法不仅能够充分酶解牛骨蛋白，获得高含量的小分子多肽，还能够显著提高酶解产物中具有缓解疲劳和改善骨密度功能的多肽含量。优选地，所述酶解中，复合蛋白酶的用量与原料蛋白的质量比为1‰-5‰，酶解条件为45-60℃酶解3-6h。上述酶解工艺能够将牛骨蛋白充分降解为小分子肽，同时保证小分子肽中具有缓解疲劳和改善骨密度功能的多肽含量。经鉴定，经上述酶解可获得高含量的序列为rhvwyge(arg-his-val-trp-tyr-gly-glu)、echgrg(glu-cys-his-gly-arg-gly)、ghrgf(gly-his-arg-gly-phe)的多肽，这些多肽均具有较好的缓解疲劳和改善骨密度的功能。本发明的牛骨胶原蛋白肽的制备方法还包括在酶解前对牛骨进行预处理的步骤。具体地，所述预处理包括：将牛骨经破碎、高温蒸煮和过滤除脂得到原料蛋白液。优选地，高温蒸煮的条件为：温度100-125℃，压力0.1-0.5mpa，时间2-6h。上述高温蒸煮处理提高了蛋白原料与酶的接触，能够更好地提高酶解效率，降低酶的使用量，同时减少对功能性多肽的不利影响。本发明的牛骨胶原蛋白肽的制备方法还包括将所述酶解物进行灭酶处理后，再进行过滤和目标肽的分离的步骤。其中，过滤步骤包括：将所述酶解物经陶瓷膜过滤，收集过滤液；再经过纳滤处理，收集截留液；将收集的截留液先利用孔径为5000道尔顿的超滤膜超滤，收集过滤液；再将过滤液通过孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离。采用上述多膜联用过滤，减少了牛骨胶原蛋白肽在生产过程中的损失，可有效截留目标物，去除大分子和小分子杂质。在过滤后，进行目标肽分离的步骤包括：将所述分子量为小于2000的蛋白肽，先经过sephadexg-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；再用rp-hplc反相高效液相色谱进行分离，分离条件如下：采用c18色谱柱，以含0.1％tfa的水溶液为流动相a，含0.1％tfa的乙腈溶液为流动相b，采用梯度洗脱进行分离：0-5min，5％的流动相b；5-45min，5-45％的流动相b；45-55min，45-5％的流动相b，流速为1ml/min，收集8-11.5分钟分离的蛋白肽溶液。作为本发明的优选方案，所述牛骨胶原蛋白肽的制备方法包括如下步骤：(1)牛骨清洗：取牛骨，冷水浸泡、清洗除血污；(2)破碎：牛骨洗净后在破骨机中破碎处理至1-7cm；(3)蒸煮：将破碎牛骨置于2.0～5.0倍的水中，于0.1-0.5mpa、100-125℃下高温蒸煮2-6h，冷却；(4)除脂：利用碟式分离机对蒸煮后的骨汤进行过滤，除去骨汤里面的脂肪；(5)酶解：向步骤(4)得到的骨汤中添加原料蛋白质量1‰-5‰的复合蛋白酶，该复合蛋白酶为酶活单位比为(2-26)：(2-50)：(0.8-5)的中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶，在45～60℃条件下进行酶解反应3-6h，酶解完成后高温灭酶，离心取上清液，得到牛骨酶解液；(6)过滤：将牛骨酶解液经过陶瓷膜进行过滤处理，收集过滤液；过滤后的澄清过滤液再经过纳滤处理，收集截留液；将收集的截留液通过二步超滤方法进行处理：首先利用孔径为5000道尔顿的超滤膜超滤，收集过滤液；再将过滤液通过孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来。(7)分离：取分子量为小于2000的蛋白肽液，先经过sephadexg-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；再用rp-hplc反相高效液相色谱进行1次分离，分离条件如下：采用c18色谱柱，以含0.1％tfa的水溶液为流动相a，含0.1％tfa的乙腈溶液为流动相b，采用梯度洗脱进行分离：0-5min，5％的流动相b；5-45min，5-45％的流动相b；45-55min，45-5％的流动相b，流速为1ml/min，取9-11分钟收集的分离蛋白肽溶液；(8)浓缩干燥：将步骤(7)得到的蛋白肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到具有特定功能的牛骨胶原蛋白肽粉。将上述制备的牛骨胶原蛋白肽通过lc-ms/ms对蛋白肽的主要成分进行测定，其中，氨基酸序列为rhvwyge、echgrg、ghrgf的肽的含量为≥80％。上述制备方法中，以牛骨为原料，在不添加任何酸碱辅助的条件下，利用复合蛋白酶对牛骨进行深度提取，充分将牛骨中的胶原蛋白转化为小分子的牛骨肽，通过膜分离、凝胶分离及反相hplc分离技术，获得了具有特定氨基酸多肽序列、具有缓解疲劳和改善骨密度的牛骨胶原蛋白肽。进一步地，本发明提供一种牛骨胶原蛋白肽，其由所述牛骨胶原蛋白肽的制备方法制备得到。优选地，所述牛骨胶原蛋白肽含有质量百分含量为≥80％的功能肽，所述功能肽的序列如seqidno.1-3任一所示。本发明还提供一种功能性多肽，其具有如seqidno.1-3任一所示的氨基酸序列。本发明通过实验验证，如seqidno.1-3任一所示的功能性多肽具有较好的缓解疲劳和改善骨密度的功能。本发明还提供所述牛骨胶原蛋白肽或所述功能性多肽在制备药品、食品或食品添加剂中的应用。优选地，所述药品或所述食品具有缓解疲劳或改善骨密度的功能。本发明还提供含有所述牛骨胶原蛋白肽或所述功能性多肽的药品、食品或食品添加剂。所述药品、食品或食品添加剂除含有所述牛骨胶原蛋白肽或所述功能性多肽外，还可含有药品或食品领域允许的辅料。本发明的有益效果在于：本发明以牛骨为原料制备牛骨胶原蛋白肽，制得的牛骨胶原蛋白肽的小分子肽含量高，分子量主要分布在200-2000da之间；水溶性好，易被人体吸收，无不良气味；具有很好的缓解疲劳和改善骨密度的功效；本发明的制备方法操作简单，便于工业化生产。附图说明图1为本发明实施例1中牛骨胶原蛋白肽的检测图。图2为本发明实施例2中牛骨胶原蛋白肽的检测图。图3为本发明实施例3中牛骨胶原蛋白肽的检测图。图4为本发明实施例1中牛骨胶原蛋白肽的lc-ms图。图5为本发明实施例2中牛骨胶原蛋白肽的lc-ms图。图6为本发明实施例3中牛骨胶原蛋白肽的lc-ms图。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实施例中使用的中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的活性单位含量分别为350,000u/g、500,000u/g、180,000u/g。以下实施例中，反相hplc的分离条件具体如下：液相系统：岛津lc-16；检测器：紫外检测器220nm；流动相：a-含0.1％tfa的水溶液，b-含0.1％tfa的乙腈溶液为流动相b；柱子：cosmosil5c18-paqcolumn(4.6×250mm,nacalaitesque,kyoto,japan)；流速：1ml/min；洗脱程序：0-5min，5％的流动相b；5-45min，5-45％的流动相b；45-55min，45-5％的流动相b。实施例1具有缓解疲劳和改善骨密度的牛骨胶原蛋白肽的制备方法本实施例提供一种具有缓解疲劳和改善骨密度的牛骨胶原蛋白肽的制备方法，具体如下：(1)牛骨清洗：取新鲜冷冻牛骨，冷水浸泡、清洗除血污；(2)破碎：牛骨洗净后破骨机中破碎处理至1cm；(3)蒸煮：将破碎牛骨置于3.0倍符合饮用水卫生标准的水中，于125℃、0.2mpa下高温蒸煮3h，冷却；(4)除脂：利用碟式分离机对蒸煮后的骨汤进行过滤，除去骨汤里面的脂肪；(5)骨汤酶解：向骨汤中添加原料重量2‰的复合蛋白酶(质量比为2：2：1的中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶)，在55℃条件下进行酶解反应3h，酶解完成后高温灭酶，离心取上清液，得到牛骨酶解液；(6)过滤：将牛骨酶解液经过陶瓷膜进行过滤处理，收集过滤液；过滤后的澄清过滤液再经过纳滤处理，收集截留液；将收集的截留液通过二步超滤方法进行处理：首先利用孔径为5000道尔顿的超滤膜超滤，收集过滤液；再将过滤液通过孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来；(7)分离：取分子量为小于2000的蛋白肽液，先经过sephadexg-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到牛骨蛋白肽；再用rp-hplc反相高效液相色谱进行1次分离，取10.5-11分钟收集的分离蛋白肽溶液；(8)浓缩干燥：将步骤(7)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到具有特定功能的牛骨胶原蛋白肽粉。本实施例还提供采用上述制备方法制备得到的牛骨胶原蛋白肽。通过lc-ms/ms对步骤(8)得到的具有特定功能的牛骨胶原蛋白肽粉的主要成分进行测定，其中，氨基酸序列为rhvwyge的肽的含量为85.15％。实施例2具有缓解疲劳和改善骨密度的牛骨胶原蛋白肽的制备方法本实施例提供一种具有缓解疲劳和改善骨密度的牛骨胶原蛋白肽的制备方法，具体如下：(1)牛骨清洗：取新鲜冷冻牛骨，冷水浸泡、清洗除血污；(2)破碎：牛骨洗净后破骨机中破碎处理至3cm；(3)蒸煮：将破碎牛骨置于4.0倍符合饮用水卫生标准的水中，于115℃、0.15mpa下高温蒸煮4h，冷却；(4)除脂：利用碟式分离机对蒸煮后的骨汤进行过滤，除去骨汤里面的脂肪；(5)骨汤酶解：向骨汤中添加原料重量3‰的复合蛋白酶(质量比为3：4：1的中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶)，在60℃条件下进行酶解反应4.5h，酶解完成后高温灭酶，离心取上清液，得到牛骨酶解液；(6)过滤：将牛骨酶解液经过陶瓷膜进行过滤处理，收集过滤液；过滤后的澄清过滤液再经过纳滤处理，收集截留液；将收集的截留液通过二步超滤方法进行处理：首先利用孔径为5000道尔顿的超滤膜超滤，收集过滤液；再将过滤液通过孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来；(7)分离：取分子量为小于2000的蛋白肽液，先经过sephadexg-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到牛骨胶原蛋白肽；再用rp-hplc反相高效液相色谱进行1次分离，取10-11.4分钟收集的分离蛋白肽溶液；(8)浓缩干燥：将步骤(7)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到具有特定功能的牛骨胶原蛋白肽粉。本实施例还提供采用上述制备方法制备得到的牛骨胶原蛋白肽。通过lc-ms/ms对步骤(8)得到的具有特定功能的牛骨胶原蛋白肽粉的主要成分进行测定，其中，氨基酸序列为echgrg的肽的含量为88.48％。实施例3具有缓解疲劳和改善骨密度牛骨胶原蛋白肽的制备方法本实施例提供一种具有缓解疲劳和改善骨密度的牛骨胶原蛋白肽的制备方法，具体如下：(1)牛骨清洗：取新鲜冷冻牛骨，冷水浸泡、清洗除血污；(2)破碎：牛骨洗净后破骨机中破碎处理至5cm；(3)蒸煮：将破碎牛骨置于5.0倍符合饮用水卫生标准的水中，于100℃、0.1mpa下高温蒸煮6h，冷却；(4)除脂：利用碟式分离机对蒸煮后的骨汤进行过滤，除去骨汤里面的脂肪；(5)骨汤酶解：向骨汤中添加原料重量5‰的复合蛋白酶(质量比为4：5：2的中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶组成)，在45℃条件下进行酶解反应6h，酶解完成后高温灭酶，离心取上清液，得到牛骨酶解液；(6)过滤：将牛骨酶解液经过陶瓷膜进行过滤处理，收集过滤液；过滤后的澄清过滤液再经过纳滤处理，收集截留液；将收集的截留液通过二步超滤方法进行处理：首先利用孔径为5000道尔顿的超滤膜超滤，收集过滤液；再将过滤液通过孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来；(7)分离：取分子量为小于2000的蛋白肽液，先经过sephadexg-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到牛骨胶原蛋白肽；再用rp-hplc反相高效液相色谱进行1次分离取8-9.2分钟收集的分离蛋白肽溶液；(8)浓缩干燥：将步骤(7)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到具有特定功能的牛骨胶原蛋白肽粉。本实施例还提供采用上述制备方法制备得到的牛骨胶原蛋白肽。通过lc-ms/ms对步骤(8)得到的具有特定功能的牛骨胶原蛋白肽粉的主要成分进行测定，其氨基酸序列为ghrgf的肽的含量为83.32％。实施例1、2和3的具有特定功能的牛骨胶原蛋白肽粉的分子量检测结果分别如图1、图2和图3所示，lc-ms/ms检测结果分别如图4、图5和图6所示。实验例1牛骨胶原蛋白肽缓解疲劳的测定试验对实施例1-3得到的牛骨胶原蛋白肽粉进行功能性评价。试验动物：bac小鼠，体重18-22g，购于北京大学医学部。试验动物分组：所有的动物进入实验室后，正常饲养3天，以适应饲养环境。实验要求根据随机排列表随机将实验动物分组，每组12只。试验动物饲养：实验组每天以灌胃的方式给予0.1g/kg的牛骨胶原蛋白肽粉，对照组给喂等量的蒸馏水，每次灌胃前断食2小时，基础饲料自由摄食，两天换水一次。对试验动物进行负重游泳实验、常压耐缺氧实验。(1)负重游泳实验各组小白鼠按上述方法正常饲养4周，末次给予受试物30min后，按体重于尾根部负荷5％体重的铅皮，在游泳箱(70cm×70cm×60cm)中游泳。水深50cm，水温25±0.5℃，按组进行，以准确记录运动时间并避免各小鼠之间的相互影响。力竭标准为小鼠头部浸入水中8s不能游回水面。逐只记录运动开始至力竭的时间，作为小鼠游泳时间(min)。小鼠力竭后，迅速将其捞出水池，置于保温箱内用吹风筒吹干放入笼中正常饲养。(2)常压耐缺氧实验负重游泳实验后，所有动物休息5d，按上述方法继续饲养。末次灌喂60min后，进行常压耐缺氧实验。方法为将小鼠放入250ml密封性好的磨口玻璃瓶内，每瓶一只小鼠，瓶内用纱布包有15g钠石灰，以吸收水分和二氧化碳，造成缺氧环境。将小鼠放入瓶中后，立即用凡士林密封盖紧，记录从密封至小鼠发生全身痉孪的时间，当小鼠发生全身痉孪后，立即开启瓶盖将其取出救活。结果如表1所示，对小鼠分别灌胃实施例1-3的牛骨胶原蛋白肽粉后，小鼠的体力明显优于对照组，说明本发明的牛骨肽粉具有很好的缓解疲劳的功效。表1小鼠负重游泳实验、常压耐缺氧实验测试结果负重游泳时间(min)耐缺氧时间(min)对照组9.7617.98实施例112.1618.69实施例214.1119.21实施例314.8720.05实验例2增加骨密度功效评价试验(1)选育8月龄昆明种雌性大鼠，体重在260-280g之间，按清洁级标准饲养，自由进食和饮水。大鼠分笼饲养，自由摄食和摄水，使用标准饲料，其中钙含量1.25％，磷含量0.90％。随机分为假手术组、去卵巢组、阳性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组12只。除假手术组(单纯切开皮肤不做卵巢切除)大鼠外，其余组均做双侧卵巢切除术，所有动物给药时间为5周，每周称体质量1次，按体质量变化调整给药量，各组体质量均无明显差异。此外，各组大鼠的雌激素水平都采用雌二醇试剂盒(sigma公司)严格监控，在整个饲养过程中都没有明显变化。(2)对实施例1-3得到的牛骨胶原蛋白肽粉混合后再对混合物进行功能性评价。(3)假手术组：自由进食饮水；去卵巢组：自由进食饮水；阳性对照组：碳酸钙药剂量为2.4mg/kg·d进行灌胃；高剂量牛骨胶原蛋白肽组：100mg/kg·d；中剂量牛骨胶原蛋白肽组：50mg/kg·d；低剂量牛骨胶原蛋白肽组：25mg/kg·d。(4)全自动生化分析仪测定血清总钙、血清游离钙的浓度及碱性磷酸酶的活性，结果如表2所示；采用x线骨密度仪检测腰椎骨和左股骨的骨密度，结果如表3所示。表2牛骨胶原蛋白肽粉对血清总钙、血清游离钙浓度及碱性磷酸酶活性影响组别血清总钙(mol/l)血清游离钙(mol/l)碱性磷酸酶(u/l)假手术组2.81±0.020.77±0.2676.98±3.1去卵巢组2.62±0.290.57±0.37135.8±4.2阳性对照组2.65±0.270.64±0.1897.6±2.9低剂量组2.70±0.140.68±0.0989.4±1.9中剂量组2.75±0.160.70±0.1386.12±2.4高剂量组2.81±0.170.74±0.2282.2±1.8从表2中可以看出，去卵巢组大鼠的血清总钙、血清游离钙的浓度与假手术组相比均有所降低，但随着牛骨胶原蛋白粉剂量的增加，平均水平与假手术组接近；去卵巢组大鼠与假手术组相比，碱性磷酸酶明显升高，剂量组的碱性磷酸酶的浓度下降，且呈明显的量效关系。在血清生化指标中，碱性磷酸酶是最常用的评价骨形成的指标，磷酸酶值升高是高转换型骨质疏松症的表现之一。表3牛骨胶原蛋白肽粉对骨密度影响如表3所示，随着牛骨胶原蛋白肽粉剂量的增加，大鼠的骨密度腰椎骨和左股骨的骨密度逐渐接近假手术组水平，且均高于去卵巢组，说明本发明的牛骨胶原蛋白肽能够有效的促进骨细胞的增值，增加骨密度。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>国肽生物工程（常德）有限公司<120>一种具有缓解疲劳和改善骨密度功能的牛骨胶原蛋白肽及其制备方法<130>khp211111004.1<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>7<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1arghisvaltrptyrglyglu15<210>2<211>6<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2glucyshisglyarggly15<210>3<211>5<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>3glyhisargglyphe15当前第1页1 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技术特征：1.一种牛骨胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以牛骨为原料，将经预处理的原料经复合蛋白酶解制得酶解物；
所述复合蛋白酶为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的牛骨胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述复合蛋白酶中，中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的质量之比为(2-4)：(2-5)：(1-2)，所述中性蛋白酶的酶活为100,000-650,000u/g，所述木瓜蛋白酶的酶活为100,000-1,000,000u/g，所述风味蛋白酶的酶活为80,000-250,000u/g。
3.根据权利要求1或2所述的牛骨胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述酶解中，复合蛋白酶的用量与原料蛋白的质量比为1‰-5‰，酶解条件为45-60℃酶解3-6h。
4.根据权利要求1～3任一项所述的牛骨胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述预处理包括：将牛骨经破碎、高温蒸煮和过滤除脂得到原料蛋白液；
优选地，所述高温蒸煮为在100-125℃、0.1-0.5mpa条件下蒸煮2-6h。
5.根据权利要求1～4任一项所述的牛骨胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：将所述酶解物进行灭酶处理后，再进行过滤和目标肽的分离；
所述过滤包括：将所述酶解物经陶瓷膜过滤，收集过滤液；再经纳滤处理，收集截留液；
将所述截留液先利用孔径为5000道尔顿的超滤膜超滤，收集过滤液；再将过滤液通过孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离。
6.根据权利要求5所述的牛骨胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述目标肽的分离包括：
将所述分子量为小于2000的蛋白肽，先经过sephadexg-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；再用rp-hplc反相高效液相色谱进行分离；分离条件如下：采用c18色谱柱，以含0.1％tfa的水溶液为流动相a，含0.1％tfa的乙腈溶液为流动相b，采用梯度洗脱进行分离：0-5min，5％的流动相b；5-45min，5-45％的流动相b；45-55min，45-5％的流动相b，流速为1ml/min，收集8-11.5分钟分离的蛋白肽溶液。
7.一种牛骨胶原蛋白肽，其特征在于，其由权利要求1～6任一项所述的牛骨胶原蛋白肽的制备方法制备得到；
优选地，所述牛骨胶原蛋白肽含有质量百分含量为≥80％的功能肽，所述功能肽的序列如seqidno.1-3任一所示。
8.功能性多肽，其特征在于，其具有如seqidno.1-3任一所示的氨基酸序列。
9.权利要求7所述的牛骨胶原蛋白肽或权利要求8所述的功能性多肽在制备药品、食品或食品添加剂中的应用；
优选地，所述药品或所述食品具有缓解疲劳和改善骨密度的功能。
10.含有权利要求7所述的牛骨胶原蛋白肽或权利要求8所述的功能性多肽的药品、食品或食品添加剂。
技术总结本发明涉及动物食品加工技术领域，具体涉及一种具有缓解疲劳和改善骨密度功能的牛骨胶原蛋白肽及其制备方法。本发明的牛骨胶原蛋白肽的制备方法包括如下步骤：以牛骨为原料，将经预处理的原料经复合蛋白酶解制得酶解物；所述复合蛋白酶为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶。该方法制得的牛骨胶原蛋白肽的小分子肽含量高；水溶性好，易被人体吸收，无不良气味；具有很好的缓解疲劳和改善骨密度的功效；且制备方法操作简单，便于工业化生产。
技术研发人员：刘怀高;罗永康;崔景林;邱瑞华;张恒
受保护的技术使用者：国肽生物工程(常德)有限公司
技术研发日：2021.04.19
技术公布日：2021.08.03
