本发明涉及一种新化合物，尤其是一种基于扎托布洛芬(zpf)母体结构的新化合物，本发明还涉及该化合物的制备方法及其在制备抗炎药物中的用途。
背景技术：
zpf是一种新型强效非甾体抗炎药，主要通过选择性抑制cox-2和pge2的合成，起到解热镇痛抗炎作用。zpf在高剂量的情况下存在轻微的胃肠损伤现象，可能与zpf羧基基团的存在密切的关系。与单靶点药物相比，多靶点药物在炎症、癌症等疾病的治疗方面具有更好的效果。
环氧合酶-2(cox-2)和过氧化物酶增殖物激活受体(ppar-γ)均在炎症反应中发挥着重要的作用，因此基于cox-2和ppar-γ双重靶点的新型非甾体抗炎药的开发具有远大的前景。此外，有研究报道3-噻吩基的存在能够显著表现出较好的cox-1/cox-2的选择性，且具有很好的抗炎活性；酰胺衍生物结构的存在展现了很好的cox-2的抑制能力；呋咱和呋咱氮氧化物作为no释放基团能够有效的降低对胃肠的刺激性，且具有很好的抗炎效果。
因此，本发明基于zpf的母体结构出发，以cox-2和ppar-γ作为双重靶点为基础，对zpf的母体结构以及羧基基团进行改造，并采用骈合的方法将噻吩基、呋咱氮氧化物作为羧基的取代物进行骈合，设计具有cox-2和ppar-γ作为双重靶点潜能的新型非甾体抗炎药物。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种新化合物，通过将扎托布洛芬及其衍生物与噻吩类或苯磺酰基呋咱类化合物进行拼接，从而使其发挥更好的抗炎活性，本发明还提供该化合物的制备方法及其用途。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
一种化合物，该化合物是扎托布洛芬或其衍生物与结构如下式(1)或式(2)所示的化合物拼接而成，
其中，r1为c1－c5醇；r2为h或苯环上的常规取代基；r3为h或噻吩环上的常规取代基。
优选地，r1为丙醇，r2为h。
优选地，r3为h。
优选地，所述扎托布洛芬衍生物包括结构式如下所示的两种化合物，
在制备上述化合物时，通过将扎托布洛芬或其衍生物上的羧基与式(1)所示化合物上的羟基、式(2)所示化合物上的氨基进行酯化反应，从而将两种化合物进行拼接。
体外细胞试验表明，本发明所合成的化合物能拮抗lps诱导的raw264.7细胞的cox-2的表达，且抑制效果要显著强于zpf及其衍生物。此外，化合物对lps诱导的raw264.7细胞的ppar-γ蛋白水平的降低具有调节作用。从而证明该化合物具有cox-2和ppar-γ的双重靶点潜能，能拮抗细胞炎症反应。
进而，采用lps诱导小鼠急性肺水肿模型并评价化合物的治疗效果，结果表明，该化合物能降低肺组织含水量从而发挥对肺水肿的治疗作用；能缓解急性肺损伤导致的炎症反应且对肺组织几乎没有毒性作用；免疫组化检测肺组织中cox-2、ppar-γ表达水平，结果发现化合物可显著降低lps诱导的cox-2水平高表达，并且能够显著改善lps诱导的ppar-γ低表达。上述研究表明，新化合物可通过cox-2和ppar-γ双重靶点发挥抗炎作用。
因此，该化合物可用于制备抗炎药物，尤其是抗肺炎药物，在制备所述药物时，该化合物既可单独作为活性成分，也能与其它抗炎药物共同作为活性成分，从而发挥更好的协同作用。
更具体的技术方案参见实施例所述。
附图说明
图1：westernblot测定raw264.7细胞cox-2和ppar-γ的表达量。
图2：急性肺水肿小鼠模型的肺组织含水量测定结果。
图3：小鼠急性肺水肿的病理切片检查结果(空白对照组和lps组)。
图4：小鼠急性肺水肿的病理切片检查结果(d63组和d63 lps组)。
图5：小鼠急性肺水肿的病理切片检查结果(e63组和e63 lps组)。
图6：小鼠急性肺水肿的病理切片检查结果(jmc2组和jmc2组 lps组)。
图7：小鼠急性肺水肿的病理切片检查结果(jmc5组和jmc5组 lps组)。
图8：小鼠急性肺水肿的病理切片检查结果(jmc6组和jmc6组 lps组)。
图9：免疫组化检测不同组别肺组织中cox-2的表达水平。
图10：免疫组化检测不同组别肺组织中ppar-γ的表达水平。
具体实施方式
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例对本申请进行详细的说明。应该指出，以下说明都是示例性的，不用来限制本发明的保护范围。此外，说明书中所涉及的实验操作，文中没有特别说明的部分，均为本领域的常规技术，本领域的技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。
实施例1化合物的制备
1.主要材料和试剂
乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚、无水乙醇、二甲亚砜、甲醇、无水硫酸钠、氢氧化钠、四氢呋喃、冰醋酸、1,3丙二醇、n,n-二甲基甲酰胺等购自国药集团化学试剂有限公司；zpf、4-二甲氨基吡啶、n-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐购自上海源叶生物科技有限公司；双圈定性滤纸购自杭州沃华滤纸有限公司；柱层析硅胶购自青岛海洋化工厂分厂；薄层层析硅胶板购自青岛海洋化工厂分厂。
2.中间体的合成
m3的合成：按zpf：硼氢化钠的物质的量为1:2.5，溶于甲醇，45℃搅拌2h，tlc监测反应进程。待反应完全后，稀盐酸调节反应液ph至中性，抽滤，收集滤液后减压蒸馏去除甲醇；随后加入乙酸乙酯溶解，再加入等量水进行萃取，收集有机相，水相重复萃取3～5次，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥除水，减压蒸馏去除有机相，甲醇溶解后，再次减压蒸馏蒸干溶剂，即得目标产物m3。
m282的合成：取5gm3溶解在40ml乙酸中，并逐滴滴加3ml浓硫酸，室温搅拌反应15min，然后45℃搅拌反应15min，tlc监控反应进程。待反应完全后，加入氢氧化钠溶液调节反应液ph至弱酸性，加入乙酸乙酯进行萃取(100ml×3)，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥除水，减压蒸馏去除有机相，即得产物m282。
m6的合成：取2gm282溶解于25ml乙酸中，并逐滴缓慢滴加1ml30％双氧水，滴加完毕后于45℃搅拌反应5h，tlc监控反应进程，每小时一次。待反应完全后，加入氢氧化钠溶液调节反应液ph至弱酸性，加入乙酸乙酯进行萃取(100ml×3)，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥除水，减压蒸馏去除有机相，得到淡黄色液体，硅胶柱层析或硅胶板纯化，即得产物m6。
合成路线下：
zpf衍生物的合成
3-苯磺酰基-4-丙醇-呋咱的合成：取2g3,4-二苯磺酰基-呋咱溶解于20ml四氢呋喃中，随后加入3g1,3-丙二醇，并分批加入1mlnaoh(25％)溶液作为反应的催化剂，于40℃搅拌反应，tlc监控反应进程，每小时一次。待反应完全后，减压蒸馏去除溶剂，随后加入乙酸乙酯溶解，再加入等量水进行萃取，收集有机相，水相重复萃取3～5次，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥除水，减压蒸馏去除有机相进行浓缩，浓缩后经硅胶柱层析进行纯化，获得目标化合物。合成路线如下：
3-苯磺酰基-4-丙醇-呋咱的合成
2-噻吩甲醛腙的合成：取1.5ml2-噻吩甲醛置于7ml四氢呋喃中，缓慢滴加1ml水合肼进行反应，反应于室温下进行，tlc监控反应进程，待反应完全后，减压蒸馏去除溶剂，即得到目标化合物2-噻吩甲醛腙，无需纯化，可直接用于后续反应。合成路线如下：
2-噻吩甲醛腙的合成
3.目标化合物的合成
jmc2的合成：精确称取400mg的m6溶解于n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，随后加入491mg的4-二甲氨基吡啶(dmap)、308mg的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)以及512mg的1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc·hcl)，于35℃搅拌反应2h，对m6结构上的羧基进行活化，活化后加入430mg的3-苯磺酰基-4-丙醇-呋咱进行反应，tlc监控反应进程，待反应完全后，减压蒸馏去除溶剂，随后加入乙酸乙酯溶解，再加入等量水进行萃取，收集有机相，水相重复萃取3次，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥除水，减压蒸馏去除有机相进行浓缩，浓缩后经硅胶柱层析进行纯化，获得目标化合物。合成路线如下：
jmc2的合成
jmc5的合成：精确称取400mg的zpf溶解于dmf中，随后加入491mg的dmap、308mg的nhs以及512mg的edc·hcl，于35℃搅拌反应2h，对zpf结构上的羧基进行活化，活化后加入430mg的3-苯磺酰基-4-丙醇-呋咱进行反应，tlc监控反应进程，待反应完全后，减压蒸馏去除溶剂，随后加入乙酸乙酯溶解，再加入等量水进行萃取，收集有机相，水相重复萃取3次，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥除水，减压蒸馏去除有机相进行浓缩，浓缩后经硅胶柱层析进行纯化，获得目标化合物，合成路线如下：
jmc5的合成
jmc6的合成：精确称取420mg的m2溶解于dmf中，随后加入491mg的dmap、308mg的nhs以及512mg的edc·hcl，于35℃搅拌反应2h，对m2结构上的羧基进行活化，活化后加入430mg的3-苯磺酰基-4-丙醇-呋咱进行反应，tlc监控反应进程，待反应完全后，减压蒸馏去除溶剂，随后加入乙酸乙酯溶解，再加入等量水进行萃取，收集有机相，水相重复萃取3次，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥除水，减压蒸馏去除有机相进行浓缩，浓缩后经硅胶柱层析进行纯化，获得目标化合物，合成路线如下：
jmc6的合成
d63的合成：精确称取400mg的zpf溶解于dmf中，随后加入491mg的dmap、308mg的nhs以及512mg的edc·hcl，于35℃搅拌反应2h，对zpf结构上的羧基进行活化，活化后加入169mg的2-噻吩甲醛腙进行反应，tlc监控反应进程，待反应完全后，将反应液倒入冰水中，有固体析出，抽滤，滤饼进行重结晶，即可得到d63，合成路线如下：
d63的合成
e63的合成：精确称取400mg的m6溶解于dmf中，随后加入491mg的dmap、308mg的nhs以及512mg的edc·hcl，于35℃搅拌反应2h，对m6结构上的羧基进行活化，活化后加入169mg的2-噻吩甲醛腙进行反应，tlc监控反应进程，待反应完全后，将反应液倒入冰水中，有固体析出，抽滤，滤饼进行重结晶，即可得到e63，合成路线如下：
e63的合成
4.化合物的结构表征
化合物的质谱鉴定：称取各化合物约1mg,用甲醇溶解后再稀释配成0.5μg/ml的溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤后，使用lc/ms-it-tof进行检测，确定化合物的分子量。
化合物的核磁共振氢谱(1h-nmr)鉴定：称取各化合物约5mg溶解于dmso-d6(氘代二甲亚砜)或cdcl3(氘代氯仿)中，将溶液装入核磁管中，以tms为基准试剂进行测定。
所有的化合物经质谱鉴定其检测的分子量与理论计算分子量相符，d63(c22h18n2o2s2，理论分子量406.52，检测分子量[m h] 407.0832)、e63(c22h18n2o2s2，理论分子量406.52，检测分子量[m h] 407.0837)、jmc2(c28h24n2o8s2，理论分子量580.63，检测分子量[m h] 581.1061)、jmc5(c28h24n2o8s2，理论分子量580.63，检测分子量[m na] 603.0828)和jmc6(c28h24n2o9s2，理论分子量596.63，检测分子量[m na] 519.0783)。
jmc2:yellowoil.1hnmr(600mhz,cdcl3)δ8.03(d,j＝8.3hz,2h),7.73(td,j＝7.6,0.9hz,1h),7.63–7.40(m,8h),7.35(t,j＝7.5hz,1h),7.18(dd,j＝12.0,4.3hz,1h),7.10(dt,j＝8.1,2.1hz,1h),4.35–4.19(m,4h),3.71(dd,j＝15.8,8.6hz,1h),2.12(p,j＝6.1hz,2h),1.50(d,j＝7.2hz,3h).jmc5:whitesolid.1hnmr(600mhz,cdcl3)δ8.15(dd,j＝8.0,1.5hz,1h),8.07–8.00(m,2h),7.75–7.71(m,1h),7.58(ddd,j＝17.5,8.1,6.0hz,4h),7.45–7.40(m,1h),7.36(d,j＝1.8hz,1h),7.30(td,j＝7.8,1.2hz,1h),7.12(ddd,j＝12.4,8.0,1.9hz,1h),4.37–4.28(m,4h),4.24(qt,j＝11.4,5.7hz,2h),3.73(q,j＝7.1hz,1h),2.18–2.11(m,2h),1.49(d,j＝7.2hz,3h).jmc6:whitesolid.1hnmr(600mhz,cdcl3)δ8.19–8.14(m,1h),8.06(ddd,j＝14.2,12.0,8.2hz,4h),7.64–7.59(m,3h),7.58–7.51(m,2h),7.39–7.34(m,1h),7.30(d,j＝0.7hz,1h),4.62–4.44(m,2h),4.38–4.31(m,2h),4.25(ddd,j＝6.2,3.9,1.7hz,2h),3.89(t,j＝5.8hz,1h),2.14(dd,j＝11.8,5.9hz,2h),1.49(d,j＝7.2hz,3h).d63:whitesolid.1hnmr(600mhz,cdcl3)δ9.13(s,1h),7.81(s,1h),7.61–7.55(m,3h),7.53(d,j＝1.7hz,1h),7.46–7.38(m,4h),7.18(dd,j＝3.6,0.7hz,1h),7.04(dd,j＝5.1,3.6hz,1h),4.39–4.36(m,2h),4.05(q,j＝7.2hz,1h),1.50(d,j＝7.1hz,3h).e63:whitesolid.1hnmr(600mhz,cdcl3)δ9.44(s,1h),8.00–7.75(m,3h),7.75–7.63(m,1h),7.58(dd,j＝10.7,7.2hz,1h),7.48–7.31(m,4h),7.23–7.07(m,3h),7.07–7.00(m,1h),4.04(q,j＝7.2hz,1h),1.51(t,j＝7.0hz,3h).
实施例2化合物对lps诱导的raw264.7细胞cox-2和ppar-γ表达的影响
1.主要材料和试剂
raw264.7小鼠单核巨噬细胞株，购自武汉大学保藏中心。
zpf购自上海源叶生物科技有限公司；zpf的主要代谢物m2由本实验室提供；lps(ultrapure,tlr4激活剂)购自购自上海碧云天生物技术有限公司；dmem高糖培养液购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；南美来源的胎牛血清购自pantmseratech公司；青链霉素双抗、胰蛋白酶-edta消化液购自hyclone公司；dmso(细胞级)购自美国sigma公司；无血清细胞冻存液购自苏州新赛美生物科技有限公司；pbs缓冲液(干粉)购自武汉赛维尔生物科技有限公司；page凝胶快速制备试剂盒(10％)购自翌圣生物科技(上海)有限公司；cck-8试剂盒购自翌圣生物科技(上海)有限公司；ripa裂解液(强)、蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物(哺乳动物样品抽提用，50×)、bca蛋白浓度测定试剂盒(增强型)、sda-page蛋白上样缓冲液(5×)购自上海碧云天生物技术有限公司；pvdf膜购自美国millipore公司；蛋白预染marker、ecl化学发光底物(增强型)、cox-2rabbitpab、ppargammarabbitpab、gapdhmousemab、hrpgoatanti-mouseigg(h l)、hrpgoatanti-rabbitigg(h l)购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。
2.方法
2.1细胞培养
raw264.7细胞是小鼠单核巨噬细胞，使用dmem完全培养液(含有10％fbs，1％谷氨酰胺和双抗)，于37℃，5％co2培养箱中培养。
2.2westernblot
1.按3.1部分方法培养raw264.7细胞，当细胞进入对数生长期后用于试验。细胞密度调整为0.5～l×106/ml，接种于6孔板中，于37℃，5％co2培养箱继续培养细胞12h，换用无血清的dmem基础培养液，加入终浓度为10μmjmc2，40μmjmc6，160μmd63、e63、jmc5、zpf和m2预处理细胞2h，0.1μg/mllps继续处理22h，每个处理组设置三个重复。
2.取处理后的细胞，收集细胞于1.5ml无酶ep管中，800rpm离心5min，pbs洗两次，每管加入100μlripa细胞裂解液、1μlpmsf(100mm)和1μl蛋白磷酸酶抑制剂混合物，冰上裂解15min,用细胞刮仔细挂下已裂解的细胞，转移到1.5ml的ep管中。用超声波细胞粉碎机超声破碎细胞(40％功率，超声30s，超声3次，每次10s，中间间隔15s)。采用bca对蛋白浓度进行测定，每组20μg细胞蛋白变性处理，在10％sds-page凝胶上分离后，转印到pvdf膜上。随后将膜用5％bsa封闭缓冲液封闭1h，洗涤，然后与一抗4℃孵育过夜。将膜用tbst洗涤3次，然后与辣根过氧化物酶偶联的二抗igg抗体室温孵育1.5h。用dab辣根过氧化物酶显色试剂盒进行曝光显影。
3.实验结果
通过westernblot试验得出，各化合物均具有不同程度的拮抗lps诱导的raw264.7细胞的cox-2表达的作用，且抑制效果要显著强于zpf及m2。此外，各化合物对lps诱导的raw264.7细胞的ppar-γ蛋白水平的降低具有缓解作用(图1)。上述试验结果表明新型衍生物具有cox-2和ppar-γ的双重靶点潜能，进而发挥拮抗lps诱导的raw264.7细胞的炎症反应，且抗炎效果显著强于zpf及m2。
实施例3化合物改善lps诱导的c57bl/6小鼠急性肺损伤的作用
1.主要材料和试剂
spf级雄性c57bl/6小鼠，6～8周龄，体重18～22g，华中农业大学实验动物中心。
多聚甲醛固定液(中性)购自武汉赛维尔生物科技有限公司；lps购自武汉赛维尔生物科技有限公司；电泳缓冲液(干粉)购自武汉赛维尔生物科技有限公司；tbs缓冲液(干粉)购自武汉赛维尔生物科技有限公司；转膜缓冲液(干粉)购自武汉赛维尔生物科技有限公司；bsa购自武汉赛维尔生物科技有限公司；吐温-20购自国药集团化学试剂有限公司；二甲苯购自国药集团化学试剂有限公司；苏木素-伊红染液购自武汉百仟度生物科技有限公司；pbs溶液(0.01m)购自武汉百仟度生物科技有限公司；10×edta修复液购自武汉百仟度生物科技有限公司；苏木素染液购自武汉百仟度生物科技有限公司；h2o2购自武汉百仟度生物科技有限公司；dab显色试剂盒购自dako公司；载玻片及盖玻片购自江苏世泰实验器材有限公司；盐酸、氨水、中性树胶购自国药集团化学试剂有限公司。
2.方法
2.1lps诱导的小鼠肺水肿模型
spf级雄性c57bl/6小鼠，6～8周龄，体重18～22g，由华中农业大学实验动物中心提供。动物饲养在环境良好的spf动物房内，温度20～26℃，相对湿度40～70％，光照/黑暗循环12h。在维期一周的适应期中，所有动物均自由摄取基础饲料和无菌水。
雄性c57bl/6小鼠随机分为12组每组n＝8：空白对照组(腹腔注射等体积pbs-dmso溶液 等体积生理盐水)；lps组(腹腔注射等体积pbs-dmso溶液 腹腔注射10mg/kgb.w.lps)；d63组(腹腔注射30mg/kgb.w.d63 等体积生理盐水)；e63组(腹腔注射30mg/kgb.w.e63 等体积生理盐水)；jmc2组(腹腔注射30mg/kgb.w.jmc2 等体积生理盐水)；jmc5组(腹腔注射30mg/kgb.w.jmc5 等体积生理盐水)；jmc6组(腹腔注射30mg/kgb.w.jmc6 等体积生理盐水)；d63 lps组(腹腔注射30mg/kgb.w.d63 腹腔注射10mg/kgb.w.lps)；e63 lps组(腹腔注射30mg/kgb.w.e63 腹腔注射10mg/kgb.w.lps)；jmc2 lps组(腹腔注射30mg/kgb.w.jmc2 腹腔注射10mg/kgb.w.lps)；jmc5 lps组(腹腔注射30mg/kgb.w.jmc5 腹腔注射10mg/kgb.w.lps)；jmc6 lps组(腹腔注射30mg/kgb.w.jmc6 腹腔注射10mg/kgb.w.lps)。所有组均采用化合物/pbs-dmso腹腔注射2h，随后lps/生理盐水腹腔注射6h。lsp/生理盐水腹腔注射6h后，所有的小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(100mg/kgb.w.)处死。
2.2肺组织含水量的测定
所有小鼠麻醉放血后开胸迅速剥离左肺，用吸水纸吸干表面水分和血液，电子天平称湿重。将左肺置80℃烘箱内烘烤72h至恒重，再称重，此为干重。依据公式计算肺组织含水量(％)＝[(湿重-干重)/湿重]×100％，反映肺水肿的严重程度。
2.3肺组织病理he染色
1.取材：新鲜右肺上叶组织固定于4％多聚甲醛24h以上。将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。
2.脱水：将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75％酒精4h-85％酒精2h-90％酒精2h-95％酒精1h-无水乙醇i30min-无水乙醇ii30min-醇苯5～10min-二甲苯i5～10min-二甲苯ii5～10min-石蜡i1h-石蜡ii1h-石蜡iii1h。
3.包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。
4.切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃烘箱内烤片，待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。
5.石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯ⅰ20min-二甲苯ⅱ20min-无水乙醇ⅰ10min-无水乙醇ⅱ10min-95％酒精5min-90％酒精5min-80％酒精5min-70％酒精5min-蒸馏水洗。
6.苏木素染细胞核：切片入harris苏木素染3～8min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。
7.伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色1～3min。
8.脱水封片：将切片依次放入95％酒精i5min-95％酒精ii5min-无水乙醇ⅰ5min-无水乙醇ⅱ5min-二甲苯ⅰ5min-二甲苯ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
9.镜检分析：显微镜镜检，图像采集分析。
2.4免疫组织化学检测肺组织cox-2和ppar-γ表达
1.石蜡切片脱蜡至水：石蜡切片置于65℃烘箱中烘片2h，脱蜡至水(依次将切片放入二甲苯ⅰ20min-二甲苯ⅱ20min-无水乙醇ⅰ10min-无水乙醇ⅱ10min-95％酒精5min-90％酒精5min-80％酒精5min-70％酒精5min-用pbs洗三次，每次5min。
2.抗原修复：切片置于柠檬酸ph6.0或edtaph9.0，8.0缓冲液中微波修复，中火8min，降温8min后中低火7min后断电。
3.阻断内源性过氧化物酶：切片放入3％双氧水溶液，室温避光孵育25min，将玻片置于pbs(ph7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4.血清封闭：在组化圈内滴加3％bsa均匀覆盖组织，室温封闭30min。
5.一抗孵育：去除bsa液，每张切片加入约50μl稀释的一抗(cox-2、ppar-γ)覆盖组织，4℃过夜孵育。
6.二抗孵育：pbs洗3次，每次5min，去除pbs液，每张切片加50～100μl相应种属的二抗，常温孵育50min。
7.dab显色：pbs洗3次，每次5min，去除pbs液，每张切片加50～100μl新鲜配制dab溶液，显微镜控制显色。
8.复染细胞核：显色完全后，蒸馏水或自来水冲洗，苏木素复染，1％盐酸酒精分化(约1s)，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。
9.脱水封片：将切片依次放入75％酒精5min-85％酒精5min-无水乙醇ⅰ5min-无水乙醇ⅱ5min-正丁醇5min-二甲苯ⅰ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
10.镜检分析：显微镜镜检，图像采集分析。
3.实验结果
本发明采用lps诱导雄性c57bl/6的急性肺水肿模型，进而评价各化合物的治疗效果。结果如图2所示，lps能够显著的诱导肺组织中的含水量，与lps组相比，各化合物均能不同程度的降低肺组织中的含水量，且与空白组相比无显著差异。该试验结果表明，各化合物对于治疗lps诱导的小鼠肺水肿具有很好的治疗效果。
为了进一步的评价各化合物对lps诱导的小鼠肺水肿的治疗效果，本发明从病理损伤和免疫组化的角度对化合物的治疗效果进行评价。病理切片检查结果如图3-8所示，与空白对照组相比，lps组肺组织结构异常，部分肺泡壁增厚，肺泡萎缩塌陷，肺实质化(箭头)；肺实质中可见大量中性粒细胞(箭头)，提示lps组的肺部组织呈现高度的炎性细胞浸润。d63、e63和jmc5组肺组织结构轻度异常，部分肺泡壁增厚(箭头)，组织未见明显炎症细胞浸润；jmc2组和jmc6组肺组织结构正常，肺泡结构清晰，肺泡壁未见增厚，组织未见大量炎症细胞，部分肺泡腔中充盈红细胞(箭头)，提示各化合物对小鼠肺组织几乎没有毒性作用。d63 lps组肺组织结构轻度异常，肺泡结构不清晰，少量肺泡萎缩，部分肺泡壁上毛细血管扩张(箭头)；组织可见少量中性粒细胞(箭头)，炎症细胞明显少于lps组；e63 lps组肺组织结构轻度异常，肺泡结构不清晰，少量肺泡萎缩(箭头)；组织可见少量中性粒细胞(箭头)；炎症细胞明显少于lps组；jmc2 lps组肺组织结构轻度异常，部分肺泡壁增厚，并可见少量炎症细胞(箭头)；部分肺泡融合扩张(箭头)；jmc5 lps组肺组织结构异常，部分肺泡萎缩塌陷，肺实质化(箭头)；并可见少量炎症细胞(箭头)；jmc6 lps组肺组织结构轻度异常，肺泡结构较为清晰，组织可见少量炎症细胞(箭头)。上述结果表明各化合物均具有不同程度的缓解lps所致的雄性c57bl/6小鼠的急性肺损伤的炎症反应作用。
为了进一步探究各化合物是否在双靶点cox-2和ppar-γ治疗lps诱导的小鼠肺损伤中同样发挥着至关重要的作用，本研究应用免疫组化检测不同组别肺组织中cox-2、ppar-γ的表达水平，结果如图9-10所示。lps可显著提高cox-2的表达和降低ppar-γ的表达，而各化合物均可不同程度的显著降低lps诱导的cox-2水平的表达，并且能够显著的改善lps诱导的ppar-γ水平的降低现象，进而发挥治疗lps诱导的小鼠肺部病理损伤的作用。上述研究表明，各化合物可通过cox-2和ppar-γ依赖的方式缓解lps诱导的雄性c57bl/6小鼠急性肺损伤的炎症反应作用。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
1.一种化合物，该化合物是扎托布洛芬或其衍生物与结构如下式(1)或式(2)所示的化合物拼接而成，
其中，r1为c1－c5醇；r2为h或苯环上的常规取代基；r3为h或噻吩环上的常规取代基。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于：r1为丙醇，r2为h。
3.如权利要求1所述的化合物，其特征在于：r3为h。
4.如权利要求1所述的化合物，其特征在于：所述扎托布洛芬衍生物包括结构式如下所示的两种化合物，
5.一种合成权利要求1-4任一项所述化合物的方法，其特征在于：通过将扎托布洛芬或其衍生物上的羧基与式(1)所示化合物上的羟基、式(2)所示化合物上的氨基进行酯化反应，从而将两种化合物进行拼接。
6.权利要求1-4任一项所述化合物在制备抗炎药物中的用途，其特征在于：该化合物通过作用于cox-2和ppar-γ双重靶点发挥抗炎活性。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于：所述抗炎药物为抗肺炎药物。
8.一种抗炎药物，其活性成分中含有权利要求1-4任一项所述的化合物。
技术总结