靶向肿瘤表位的疫苗的制作方法

靶向肿瘤表位的疫苗
发明领域
1.本发明涉及免疫疗法的领域。特别地，本发明涉及用于治疗瘤形成疾病的治疗性免疫接种技术。
2.发明背景
3.患者中的恶性肿瘤的治疗在传统上集中于通过外科手术、放射疗法和/或化学疗法(以旨在优先杀死恶性细胞而不杀死非恶性细胞的用药方案，使用细胞毒性药物)来根除/去除恶性组织。
4.除了使用细胞毒性药物外，更近期的方法已集中于靶向癌细胞中的特异性生物学标志物以便减少由经典化学疗法所施加的全身副作用。靶向癌症相关抗原的单克隆抗体疗法在许多恶性肿瘤中已被证明在延长预期寿命方面是相当有效的。虽然是成功的药物，但是靶向癌症相关抗原的单克隆抗体就其性质而言只能被开发成靶向已知的且在多名患者中出现的表达产物，这意味着绝大多数的癌症特异性抗原无法通过该类型的疗法而得到解决，因为大量的癌症特异性抗原仅出现在来自单名患者的肿瘤中(参见下面)。
5.早在20世纪50年代后期，由burnet和thomas所提出的免疫监视理论就暗示，淋巴细胞识别并消除展现出经改变的抗原决定簇的自体细胞
–
包括癌细胞，并且今天普遍接受的是，免疫系统高程度地抑制癌发生。然而，免疫监视不是100％有效的，并且设计其中寻求免疫系统根除癌细胞的能力得到改善/刺激的癌症疗法是一项持续的任务。
6.一种方法是诱导针对癌症相关抗原的免疫性，但是即使这种方法具有是有前景的潜力，它仍遭受与抗体疗法相同的缺点，即仅仅有限数目的抗原可以得到解决。
7.许多(如果不是所有)肿瘤表达突变。这些突变可能产生新的可靶向的抗原(肿瘤抗原)，其在特异性t细胞免疫疗法中是潜在地有用的，如果可能在临床相关时间期限内鉴定出所述肿瘤抗原及其抗原决定簇。由于用目前的技术可能对细胞的基因组进行完全测序并且分析经改变的或新的表达产物的存在，因此可能设计出基于肿瘤抗原的个性化疫苗。然而，迄今为止，提供令人满意的临床终点的尝试已失败了。
8.因此，对于提供这样的抗癌疫苗存在现有需要，所述抗癌疫苗可以有效地靶向肿瘤抗原并且在经疫苗接种的个体中诱导在临床上显著的免疫应答。
9.发明目标
10.本发明的实施方案的一个目标是提供用于诱导针对包含肿瘤表位的肿瘤抗原的在治疗上有效的免疫应答的方法。一个进一步的目标是提供包含可以用于癌症免疫疗法的肿瘤表位材料的组合物。
11.发明概述
12.发明人已发现，具有某些阳离子脂质体佐剂的肿瘤肽的制剂以及使用相对高剂量的肿瘤肽的此类制剂的施用在经疫苗接种的个体中提供了经改善的免疫应答。而这被认为提供了在以包含肿瘤表位的表达产物的表达为特征的癌症的癌症免疫疗法方面的改进。
13.因此，在第一个方面，本发明涉及用于在哺乳动物患者中治疗肿瘤例如恶性肿瘤的方法，其中所述肿瘤展现出不被所述患者中的非瘤形成细胞所展现的t
‑
细胞表位(肿瘤
表位)，所述方法包括施用致免疫有效量的脂质体组合物，所述脂质体组合物包含：
14.1)至少一种肽(肿瘤肽)，其包含所述患者的瘤形成细胞的肿瘤表位的氨基酸序列，
15.2)溶剂，和
16.3)阳离子脂质体佐剂。
17.本发明的第二个方面涉及免疫原性组合物的单位剂量，所述单位剂量包含致免疫有效量的至少一种肽(肿瘤肽)，其包含患者的瘤形成细胞的肿瘤表位的氨基酸序列；阳离子脂质体佐剂；和溶剂。
18.本发明的第三个方面涉及具有作为本发明的第一个方面的一部分进行施用的脂质体组合物的特征的脂质体组合物。
19.相关方面涉及第二个方面的单位剂量和第三个方面的组合物，其用于在治疗性和预防性疗法中使用，特别地用于在本发明的第一个方面的方法中使用。
附图说明
20.图1：实施例1中的免疫接种研究的实验设计。
21.将小鼠要么以连续的每日免疫接种进行簇集初激(cluster prime)，要么遵循常规的初激
‑
加强(prime
‑
boost)方案进行免疫接种。在该图中指出了c22的剂量和免疫接种的日子。ip：腹膜内。
22.图2：mhc i多聚体测定法的概览。
23.产生mhc i类分子，并且加载以稳定肽(其通过将分子暴露于uv光而与c22最小表位kfkasrasi相交换)。通过偶联至经荧光标记的链霉抗生物素蛋白来使mhc i分子多聚化。为了鉴定肿瘤肽阳性的cd8 t细胞，将血液细胞用所述多聚体以及缀合有荧光团的抗
‑
cd3、抗
‑
cd4和抗
‑
cd8抗体进行共染色。然后，通过流式细胞术来分析样品并且计算mhc:c22阳性的cd8 的分数。
24.图3：在第21天时全血中肿瘤肽特异性cd8 t细胞的检测。
25.图3a描绘了在第一次免疫接种后21天在每个组中来自两只小鼠的血液中多聚体阳性的cd8 的百分比。在用与caf09b一起进行配制的10.0和50.0μg c22进行免疫接种的小鼠中检测到循环性的c22特异性cd8 t细胞，不论免疫接种规程为何。仅对来自每个组的两只小鼠的血液进行染色。在图3b和3c中，显示了来自流式细胞术分析的代表性图，其中对照在图3b中。
26.图4：在终点第28天时全血中肿瘤肽特异性cd8 t细胞的检测。
27.图4a描绘了在第一次免疫接种后28天在每个组中来自两只小鼠的血液中多聚体阳性的cd8 的百分比。在用与caf09b一起进行配制的10.0和50.0μg c22进行免疫接种的小鼠中检测到循环性的c22特异性cd8 t细胞，不论免疫接种规程为何。在用2.0μg c22进行簇集初激的小鼠中也看到了所述分数的小增加。在图4b和4c中，显示了来自流式细胞术分析的代表性图，其中对照显示在图4b中。
28.图5：肿瘤肽特异性脾cd8 t细胞的检测。
29.图5a描绘了在终点处(在第一次免疫接种后28天)来自经簇集初激的小鼠的多聚体阳性的脾cd8 t细胞的百分比。在用与caf09b一起进行配制的10.0和50.0μg c22进行免
疫接种的小鼠中检测到c22特异性cd8 t细胞。在图5b和5c中，显示了来自流式细胞术分析的代表性图，其中阴性对照显示在图5b中。
30.图6：来自“患者1”的免疫接种的数据。
31.a：elispot数据，其显示了来自于用包含肿瘤表位的疫苗的9种肽进行刺激的免疫接种后pbmc的ifn
‑
γ释放。健康对照组为来自在来自对照供者的pbmc上进行的平行实验的数据。以双倍剂量施用ca019。
32.b：来自在腹膜内免疫接种后获得的pbmc的流式细胞术数据。左侧图版显示了来自于未刺激的pbmc的tnf
‑
α和ifn
‑
γ释放，中间图版显示了来自于用不相关肽进行刺激的pbmc的tnf
‑
α和ifn
‑
γ释放，和右侧图版显示了来自于用该疫苗的9种肽进行刺激的pbmc的tnf
‑
α和ifn
‑
γ释放。
33.图7：来自“患者2”的免疫接种的数据。
34.a：elispot数据，其显示了来自于在免疫接种前获得的并且用包含肿瘤表位的疫苗的5种肽进行刺激的pbmc的ifn
‑
γ释放。健康对照为来自在来自对照供者的pbmc上进行的平行实验的数据。
35.b：elispot数据，其显示了来自于在腹膜内免疫接种后和在用包含肿瘤表位的疫苗的5种肽进行刺激后获得的pbmc的ifn
‑
γ释放。健康对照组为来自在来自对照供者的pbmc上进行的平行实验的数据。
36.c：来自于在免疫接种前获得的pbmc的tnf
‑
α和ifn
‑
γ释放的流式细胞术数据。左侧图版显示了来自于未刺激的pbmc的释放，中间图版显示了来自于用不相关肽进行刺激的pbmc的释放，和右侧图版显示了来自于用该疫苗的5种肽进行刺激的pbmc的释放。
37.d：来自于在腹膜内免疫接种后获得的pbmc的tnf
‑
α和ifn
‑
γ释放的流式细胞术数据。左侧图版显示了来自于未刺激的pbmc的释放，中间图版显示了来自于用不相关肽进行刺激的pbmc的释放，和右侧图版显示了来自于用该疫苗的5种肽进行刺激的pbmc的释放。
38.发明详述
39.定义
[0040]“癌症特异性”抗原为这样的抗原，其不作为在个体的非恶性体细胞中的表达产物而出现，而是作为在个体的癌细胞中的表达产物而出现。这与“癌症相关”抗原形成对比，癌症相关抗原在正常体细胞中也出现(虽然以低丰度)，但是在至少一些肿瘤细胞中以较高水平被发现。
[0041]
术语“佐剂”具有其在疫苗技术领域中的通常含义，即这样的物质或物质组合物，其1)本身不能够发动针对疫苗的免疫原的特异性免疫应答，但是2)然而能够增强针对免疫原的免疫应答。或者，换言之，用单独的佐剂进行的疫苗接种不提供针对免疫原的免疫应答，用免疫原进行的疫苗接种可能引起或可能不引起针对免疫原的免疫应答，但是用免疫原和佐剂进行的联合疫苗接种诱导比通过单独的免疫原所诱导的免疫应答更强的针对免疫原的免疫应答。
[0042]“caf09”(阳离子佐剂制剂09)是一种免疫佐剂脂质体制剂，其包含季铵表面活性剂n,n
‑
二甲基
‑
n,n
‑
二(十八烷基)铵(dda)；合成的3
‑
羟基
‑2‑
十四烷基
‑
十八烷酸
‑
2,3
‑
二羟丙酯(单分枝酰甘油，“mmg”)，其作为c
‑
型凝集素受体(clr)的配体起作用；和聚肌胞苷酸(钠盐)(“聚
‑
ic”或“聚(i:c)”)，其作为toll
‑
样受体(“tlr”)的配体起作用。许多caf家族佐
剂，包括caf09，详细公开在us 2014/0112979和us 2016/0228528中。dda:mmg:聚(i:c)的相对量(w:w:w)为5:1:1。
[0043]“caf09b”是具有减少至在us 2014/0112979中所公开的量的大约1/4的聚(i:c)相对量的caf09版本：因此，在caf09中，dda:mmg:聚(i:c)的相对量(w:w:w)为20:4:1，其中典型的人剂量分别包含625μg dda、125μg mmg和31.25μg聚(i:c)。
[0044]“肿瘤表位(neo
‑
epitope)”为这样的抗原决定簇(典型地，mhc i或ii类限制性表位)，其不作为来自个体中的正常体细胞的表达产物而存在(由于缺乏编码该肿瘤表位的基因)，而是作为在相同个体中的突变细胞(例如癌细胞)中的表达产物而存在。因此，从免疫学观点看，肿瘤表位是真正地非自身的，尽管它具有自体起源，并且因此它在其中它构成了表达产物的个体之中可以被表征为肿瘤特异性抗原。由于是非自身的，肿瘤表位具有能够在个体中引发特异性适应性免疫应答的潜力，其中所引发的免疫应答特异于带有所述肿瘤表位的抗原和细胞。另一方面，肿瘤表位是特异于个体的，因为相同的肿瘤表位将会是其他个体中的表达产物这样的机会是极少的。因此，数个特征使得肿瘤表位与例如肿瘤特异性抗原的表位形成对比：后者将会典型地被发现于多种相同类型的癌症中(因为它们可以是来自经激活的癌基因的表达产物)和/或它们将会由于在癌细胞中相关基因的过表达而存在于(虽然以较小的量)非恶性细胞中。
[0045]“肿瘤肽(neo
‑
peptide)”为这样的肽(即，直至大约50个氨基酸残基的聚氨基酸)，其在其序列内包括在本文中所定义的肿瘤表位。肿瘤肽典型地是“天然的”，即肿瘤肽的整个氨基酸序列构成了可以从个体中分离出的表达产物的片段，但是肿瘤肽也可以是“人工的”，这意味着它由肿瘤表位的序列和1或2个附加氨基酸序列(其中至少一个不是与所述肿瘤表位天然地相关联的)构成。在后一种情况下，所述附加氨基酸序列可以仅仅作为所述肿瘤表位的载体起作用，或者可以甚至改善所述肿瘤表位的免疫原性(例如，通过促进抗原呈递细胞对于肿瘤肽的加工，改善肿瘤肽的生物学半寿期，或者改变可溶性)。
[0046]
术语“氨基酸序列”为氨基酸残基(通过肽键相连接)位于肽或蛋白质的链中所采取的次序。序列常规地以n至c末端方向列出。
[0047]“免疫原性载体”是这样的分子或部分，向其上可以偶联免疫原或半抗原以便增强针对所述免疫原/半抗原的免疫应答的引发或者使得针对所述免疫原/半抗原的免疫应答的引发成为可能。在经典情况下，免疫原性载体是相对大的分子(例如破伤风类毒素、klh、白喉类毒素等)，其可以被融合或缀合至本身免疫原性不足的免疫原/半抗原
–
典型地，免疫原性载体能够引发强烈的针对由免疫原和免疫原性载体构成的组合物质的t
‑
辅助淋巴细胞应答，而这反过来提供经改善的通过b
‑
淋巴细胞和细胞毒性淋巴细胞的针对所述免疫原的应答。最近，在某种程度上不得不用所谓的非种系选择性t
‑
辅助表位(即被群体中大部分的hla单倍型所识别并且引发t
‑
辅助淋巴细胞应答的较短的肽)来替代大的载体分子。
[0048]“t
‑
辅助淋巴细胞应答”为基于这样的肽所引发的免疫应答，所述肽能够与抗原呈递细胞中的mhc ii类分子(例如，hla ii类分子)相结合，并且作为在所述肽与呈递所述肽的mhc ii类分子之间的复合物的t
‑
细胞受体识别的结果，刺激动物物种中的t
‑
辅助淋巴细胞。
[0049]“免疫原”为能够在其免疫系统面对该免疫原的宿主中诱导适应性免疫应答的物质。如此，免疫原是“抗原”这一较大属类的亚组，抗原是可以被免疫系统特异性地识别(例
如，当被抗体所结合时，或者备选地，当与mhc分子相结合的抗原的片段被t
‑
细胞受体所识别时)但不一定能够诱导免疫性的物质
–
但是抗原总是能够引发免疫性，这意味着具有经建立的针对该抗原的记忆免疫性的宿主将会发动针对该抗原的特异性免疫应答。
[0050]“半抗原”为这样的小分子，其既不能诱导也不能引发免疫应答，但是如果被缀合至免疫原性载体、抗体或tcr(其识别该半抗原)，则可以在免疫系统面对所述半抗原载体缀合物后诱导免疫应答。
[0051]“适应性免疫应答”为对于面对抗原或免疫原作出响应的免疫应答，其中所述免疫应答特异于所述抗原/免疫原的抗原决定簇
–
适应性免疫应答的例子为抗原特异性抗体产生的诱导或者t
‑
辅助淋巴细胞或细胞毒性淋巴细胞的抗原特异性诱导/激活。
[0052]“保护性、适应性免疫应答”为作为对于用抗原进行免疫接种(人工的或天然的)的反应而在受试者中所诱导出的抗原特异性免疫应答，其中所述免疫应答能够保护所述受试者免于所述抗原或者包括所述抗原的病理学相关试剂的随后攻击。典型地，预防性疫苗接种旨在建立针对一种或几种病原体的保护性适应性免疫应答。
[0053]“免疫系统的刺激”意味着，物质或物质组合物展现出一般性的、非特异性的免疫刺激效应。许多佐剂和推定的佐剂(例如某些细胞因子)共享刺激免疫系统的能力。使用免疫刺激试剂的结果是增加的免疫系统的“警觉度”，这意味着用免疫原同时或顺次地进行免疫接种诱导了相比于分隔地使用该免疫原而言显著地更有效的免疫应答。
[0054]
术语“多肽”在本文本中旨在意指2至50个氨基酸残基的短肽、50至100个氨基酸残基的寡肽和多于100个氨基酸残基的多肽。此外，该术语还旨在包括蛋白质，即包含至少一个多肽的功能性生物分子；当包含至少两个多肽时，这些多肽可以形成复合物，共价连接，或者非共价连接。蛋白质中的多肽可以是糖基化的和/或是脂质化的和/或包含辅基。
[0055]
本发明的具体实施方案
[0056]
本发明的治疗方法
–
第一个方面
[0057]
一般而言，本发明的第一个方面的方法涉及免疫性的诱导并且如此还牵涉涉及疾病的治疗、预防和改善的方法；特别地，所述方法涉及癌症的治疗和改善。也就是说，一般而言，本发明的第一个方面涉及用于在哺乳动物患者中治疗瘤形成疾病例如恶性瘤形成疾病的方法，其中所述肿瘤的细胞展现出不被所述患者中的非瘤形成细胞所展现的t
‑
细胞表位(肿瘤表位)，所述方法包括施用致免疫有效量的脂质体组合物，所述脂质体组合物包含：
[0058]
1)至少一种肽(肿瘤肽)，其包含所述患者的瘤形成细胞的肿瘤表位的氨基酸序列，
[0059]
2)溶剂，和
[0060]
3)阳离子脂质体佐剂。
[0061]
已知许多阳离子脂质体佐剂。在这些之中，根据本发明优选的那些为在丹麦的statens serum institute开发并且被称为caf(阳离子佐剂制剂)的一系列免疫佐剂的一部分；一篇近期综述描述了caf系列佐剂的一般性特征：pedersen gk等人,(2018),semin immunol 39:4
‑
13.doi:10.1016/j.smim.2018.10.003。所有caf都以包含表面活性剂二甲基二(十八烷基)铵(dda)为特征，并且大多数以脂质体制剂存在(caf01、caf04、caf05、caf06、caf09、caf10和caf11)，而一些最近开发出的caf以包含油(角鲨烯)的乳状液的形式(caf19和caf24)。
[0062]
根据本发明，特别令人感兴趣的阳离子脂质体佐剂为包含下列物质或由下列物质组成的那些：dda、聚(i:c)和mmg(包括mmg的合成类似物，例如3
‑
羟基
‑2‑
十四烷基
‑
十八烷酸
‑
2,3
‑
二羟丙酯)。换言之，这些是caf09佐剂。
[0063]
在优选的阳离子脂质体佐剂中，dda:mmg之比为5:1(w/w)，并且dda:聚(i:c)之比为5:1至20:1(w/w)。例如，根据本发明，dda:mmg:聚(i:c)相对重量可以为5:1:1，如关于“传统”caf09的情况那样；并且dda:mmg:聚(i:c)相对重量可以为20:4:1，这是关于caf09b佐剂的情况。
[0064]
优选的是，所述肿瘤肽在水中是可溶的，以便有助于将其配制在疫苗中。为此目的，在将其包括入疫苗制剂中之前，仔细选择所述肿瘤肽以满足一定的可溶性标准。例如，优选的是，所述至少一种肿瘤肽在下述意义上是水溶性的：当按照欧洲药典第2.2.1节测量ntu时，在包含5％(v/v)dmso的25mm tris ph 7.4中的1.0mg/ml肿瘤肽提供至多50的ntu(比浊测量法浊度单位)；并且在25mm tris ph 7.4和0.5％(v/v)dmso中的0.1mg/ml肿瘤肽提供至多25的ntu。
[0065]
更具体地，所述肿瘤肽在牵涉在620nm处的分光光度测定法测量的测定法中进行测试，以便测定以各种浓度的在tris
‑
缓冲液中的肽溶液的乳光程度(即，浊度)，并且由此计算相应的ntu
‑
值(使用来自使用primary opalescent suspension,fisher scientific(eppos01)的参考悬浮液测量值的校准曲线)。这可以用于将给定的肿瘤肽定性为“可溶的”(ntu<25，在0.1mg/ml时；ntu<50，在1.0mg/ml时)或“不可溶的”(ntu>25，在0.1mg/ml时；ntu>50，在1.0mg/ml时)。该方法用于测定在tris
‑
缓冲液(包含0.5％dmso)中以0.1mg/ml的每种所测试的肽进行配制的经hplc纯化的(>95％纯度)由天然l
‑
氨基酸(典型地，不包括半胱氨酸残基)组成的线性肽的溶解度。也可以在0.1至4.0mg/ml的浓度范围内测量受试样品。例如，在那种情况下，将肿瘤肽以20mg/ml溶解在dmso中，并随后用tris
‑
缓冲液稀释5、10、20和200倍以达到4.0、2.0、1.0和0.1mg/ml。
[0066]
因此，所述比浊法测定法基于用于测定样品的澄清度的ph eur2.2.1。如果所述肿瘤肽是不可溶的，那么形成聚集体或颗粒，这些通过在620nm下研究当光穿过样品移动时增加的散射来进行测量。然后，将所测量出的值与标准曲线进行比较，并且测定最终的ntu得分，其报告了单一肽的溶解度。一种用于测定单一肽溶解度的程序如下：
[0067]
‑
称量单一肽并且以20mg/ml溶解在dmso中，
[0068]
1.0mg/ml样品：将25μl 20mg/ml样品在475μl 25mm tris ph＝7.4中稀释至1.0mg/ml(5％最终dmso)，
[0069]
0.1mg/ml样品：将2.5μl 20mg/ml样品在497.5μl 25mm tris ph＝7.4中稀释至0.1mg/ml(0.5％最终dmso)，
[0070]
‑
在elisa平板中的100μl经稀释的样品，在620nm下读取光密度以报告聚集，
[0071]
‑
通过使用标准曲线的线性回归来计算ntu值。
[0072]
在多种肿瘤肽的混合物上进行进一步的溶解度测定法，以提供在脂质体组合物中的优选的肿瘤肽：优选的是，当存在于多种肿瘤肽和包含5％(v/v)dmso的25mm tris ph 7.4的混合物中时，当经历无菌过滤时，所述至少一种肿瘤肽展现出至多50％的其浓度的下降，其中所述多种肽中的每一种在无菌过滤前在所述混合物中具有0.1mg/ml的浓度。该方法使得能够从脂质体组合物中排除将会证明在疫苗中不太合适的肿瘤肽，因为它们将会与
其他肿瘤肽一起聚集，这是无法容易地使用上述对于单一肿瘤肽的比浊法测试去建立的事情。
[0073]
一般而言，本方法依赖于多种肿瘤肽的使用以便使得疫苗尽可能地有效。典型地，在所述脂质体组合物中肿瘤肽的数目选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30种肿瘤肽，但是所述数目在原则上可以与所述脂质体组合物的物理化学特性所允许的一样高。
[0074]
所述多种肿瘤肽以技术人员已知的几种方式之一来进行鉴定。最简单的方法是对来自患者恶性细胞的样品的基因组进行测序(典型地，通过“深度测序”)，并且用计算机与得自患者正常细胞或得自标准的“健康”基因组的全基因组测序(典型地，也通过“深度测序”)结果进行比较。随后，就突变候选物来分析在这两个序列数据集中的差异，所述突变候选物：1)被表达(即，开放阅读框的一部分)，和2)提供包括通常在患者中未发现的t
‑
细胞表位(肿瘤表位)的表达产物。为此目的，典型地包括涉及患者的mhc分型的数据以确保t
‑
细胞表位的预测仅正确地提供mhc限制性序列。t
‑
细胞表位预测方法(包括mhc结合预测)的综述可以例如见于desay dv和kulkami
‑
kale u(2014),methods mol biol 1184:333
‑
364(doi:10.1007/978
‑1‑
4939
‑
1115
‑
8_19)和soria
‑
guerra re等人,(2015),journal of biomedical informatics 53:405
‑
414(doi:10.1016/j.jbi.2014.11.003)。
[0075]
为了优化肿瘤表位的鉴定和选择，任何为此目的可用的预测方法实际上都是有用的。现有技术预测算法的一个例子是netmhcpan
‑
4.0(www.cbs.dtu.dk/services/netmhcpan
‑
4.0/；jurtz v等人,jimmunol(2017),ji1700893；doi:10.4049/jimmunol.1700893)。将该方法在经典的源自ms的配体和pmhc亲和力数据的组合上进行训练。另一个例子是netmhcstabpan
‑
1.0(www.cbs.dtu.dk/services/netmhcstabpan
‑
1.0/；rasmussen m等人,被j of immunol接受,2016年6月)。将该方法在体外pmhc稳定性测量的数据集上进行训练，通过使用其中将每种肽在体外合成并且与mhc分子相复合的测定法。在该测定法中不涉及细胞处理，并且测量pmhc稳定性所处的环境多少有点是人工的。一般而言，该方法不如netmhcpan
‑
4.0准确。美国专利10,055,540描述了用于通过使用经典的ms检测的配体来鉴定肿瘤表位的方法。使用相似技术的其他专利申请出版物为wo2019/104203、wo 2019/075112、wo 2018/195357(mhc ii类特异性的)和wo 2017/106638。最后，如netmhcpan一样，将mhcflurry:(doi:doi.org/10.1016/j.cels.2018.05.014；https://github.com/openvax/mhcflurry)在ms检测的配体数据和pmhc亲和力上进行训练。在最近的出版物garde c等人,immunogenetics,doi:doi.org/10.1007/s00251
‑
019
‑
01122
‑
z中还公开了肽
‑
mhc ii类相互作用预测方法。在该出版物中，使用从mhc ii类上洗脱的经天然加工的肽作为训练组的一部分，并且如果被验证为配体，则分派1的结合靶标值，和如果是否定的，则分派0的结合靶标值。
[0076]
通常，这些预测系统采用人工神经网络(ann)：ann可以鉴定非线性相关性：非线性相关性的定量不是一项容易的任务，因为难以通过简单计算来进行计算。这主要是由于非线性相关性要用比线性相关性更多的参数来描述，并且很可能在所有特征被共同考虑时首次出现。因此，需要考虑所有特征以便捕捉特征之间的依赖关系。
[0077]
为了进一步改善所选择的肿瘤表位提供有效免疫应答的可能性，优选地可以使用在均提交于2019年9月13日的欧洲专利申请号19197295.9和19197306.4中所公开的技术。
这些申请公开了使得下列情况成为可能的技术：可以测定肽和mhc分子之间的结合的稳定性，和作为肿瘤表位检测和选择的一部分来测定肿瘤表位的mhc结合的稳定性。简而言之，将从稳定性测定获得的数据例如用作用于ann的训练集的一部分，并且随后ann可以根据所预测的其对于相关mhc分子的结合稳定性将所鉴定出的肽进行分级。
[0078]
因此，根据本发明优选的是，在本文中所讨论的所述至少一种肿瘤肽包括展现出这样的mhc结合稳定性的肿瘤肽，所述mhc结合稳定性在所述瘤形成细胞中所鉴定出的肿瘤表位之中高于平均值，例如处于前四分之一。待包括在肿瘤肽中的肿瘤表位的这种特别选择通过在欧洲专利申请号19197295.9和19197306.4中所公开的技术来促进。根据本发明，当方便时，可以将所鉴定出的(长的)肿瘤肽以经截短的形式进行制备，以便优化最终向患者施用的终产物的表征/或产生和/或稳定性。因此，在该优选的实施方案中，对于任何所鉴定出的肿瘤肽通常应用下面的截短规则：
[0079]
如果肿瘤肽在序列中任何地方包含c，那么将它截短以去除c并且优选地保持原始肿瘤肽的最长片段。例如如下：
[0080]
qietqcrkfkasrasilsemkmlkekr(seq id no：17)
[0081]
→
[0082]
rkfkasrasilsemkmlkekr(seq id no：18)
[0083]
如果在n
‑
末端处存在q或n，那么去除q/n，例如如下：
[0084]
qietqqrkfkasrasilsemkmlkekr(seq id no：19)
[0085]
→
[0086]
ietqqrkfkasrasilsemkmlkekr(seq id no：20)
[0087]
和
[0088]
nietqqrkfkasrasilsemkmlkekr(seq id no：21)
[0089]
→
[0090]
ietqqrkfkasrasilsemkmlkekr(seq id no：20)
[0091]
如果肿瘤肽在n
‑
末端处包含dg基元，那么去除d，留下g，例如如下：
[0092]
dgetqqrkfkasrasilsemkmlkekr(seq id no：22)
[0093]
→
[0094]
getqqrkfkasrasilsemkmlkekr(seq id no：23)。
[0095]
因此，在本文中作为在本文中所公开的组合物中的有用的免疫原进行讨论的肿瘤肽将会没有半胱氨酸残基，和/或它将会没有q和n作为n
‑
末端氨基酸残基，和/或它将会在n
‑
末端处没有氨基酸序列dg。在一个特别优选的实施方案中，在所述组合物中没有肿瘤肽将会包含半胱氨酸残基，并且在所述组合物中没有肿瘤肽将会包括q或n作为n
‑
末端氨基酸残基，并且在所述组合物中没有肿瘤肽将会在其n
‑
末端处包括氨基酸序列dg。
[0096]
在鉴定之后，合成所述(多种)肿瘤肽，并且优选地在掺入到所述脂质体制剂之前使其经历上面所讨论的用于测定溶解度的方法。
[0097]
在一些实施方案中，优选地，所述至少一种肿瘤肽优先与所述脂质体组合物中的不连续相缔合，即所述至少一种肿瘤肽以比其在连续相(溶剂)中的存在显著更高的程度被包载入所述脂质体中或偶联至所述脂质体。在其他实施方案中，优选地，所述至少一种肿瘤肽优先溶解在所述脂质体组合物的连续相中，而不是与所述脂质体组合物中的脂质体相缔
合或结合。
[0098]
典型地，向所述患者多次施用所述致免疫有效量；典型地，这需要以一系列的相隔至少一天的分开的施用来施用所述致免疫有效量。在该方面的优选实施方案中，免疫接种计划包括哺乳动物(例如，人)接受一个初激施用和一个或多个后来的加强施用，但是一个同等具有吸引力的备选方案是使用“簇集免疫接种”，即这样的免疫接种计划，其中在建立记忆免疫应答之前在免疫接种方案开始时，以短时间间隔施用所述免疫原的重复剂量；然后，这之后是类似于在初激
‑
加强免疫接种方案中所使用的传统加强免疫接种的延迟免疫接种。
[0099]
在所述致免疫有效量构成了相对大体积的在本文中所讨论的组合物的情况下，有利的是以几个“分施用”来施用所述致免疫有效量，即通过把所述致免疫有效量分为2个或更多个部分，每个部分典型地在患者中在其自身的分开位置处进行施用。例如，如果借助于注射来施用体积为2000μl的所述免疫原性组合物，那么这将会方便地以在不同注射位点处的2个实质上同时的(即，在相同的12小时之内)的注射来进行。
[0100]
所述脂质体组合物可以包含在药学上可接受的载体。术语“在药学上可接受的载体”是指用于施用治疗性试剂(例如多肽)的载体。该术语是指本身不诱导对于接受所述组合物的个体有害的抗体的产生并且可以无过度毒性地进行施用的任何药学载体。合适的载体可以是大的、缓慢代谢的大分子例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚体氨基酸、氨基酸共聚物和无活性的病毒颗粒。此类载体是本领域技术人员所熟知的。
[0101]
也可以使用在药学上可接受的盐作为赋形剂，例如，无机酸盐例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸的盐例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。在药学上可接受的赋形剂的详尽讨论在remington's pharmaceutical sciences(mack pub.co.，n.j.1991)中可得。
[0102]
在所述脂质体组合物中的在药学上可接受的载体可以包含液体例如水、盐水、甘油和乙醇。另外，辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质等，可以存在于此类载料中。典型地，将所述脂质体组合物制备为可注射物，要么作为液体溶液，要么作为悬浮液；也可以制备适合于在注射之前溶解或悬浮在液体载料中的固体形式。脂质体被包括在“在药学上可接受的载体”的定义之内。
[0103]
根据本发明的第一个方面，在所述脂质体组合物中的溶剂典型地是水性的，并且优选地为保持在人生理学范围内的ph的经缓冲的溶剂。由于所述肿瘤肽方便地储存并且最初溶解在dmso(二甲亚砜)中，因此该溶剂组分存在于所述脂质体组合物的溶剂中，虽然优选地以相对小的浓度。进一步地，在水性溶剂中所使用的缓冲液典型地为经tris(三(羟甲基)氨基甲烷)缓冲的水性溶剂。最后，所述溶剂可以方便地包含较小量的甘油。因此，优选的脂质体组合物包含小于15％dmso，例如≤10％dmso，优选地<5％dmso(v/v)，和大约2％(v/v)甘油。进一步地，所述脂质体组合物方便地包含以15至18mm，优选地16.1至16.4mm的浓度的tris，但是应当强调的是，tris浓度是非必需的并且可以在例如5和50mm之间变化。
[0104]
典型地，所述脂质体组合物具有在7.0至7.6的范围内，优选地大约7.4的ph。
[0105]
在本发明的第一个方面的方法中所使用的一个特别优选的脂质体组合物包含下列组分或由下列组分组成：
[0106]
1)以每种肿瘤肽大约100μg/ml的浓度的多种肿瘤肽，
[0107]
2)以<5％(v/v)的浓度的dmso，
[0108]
3)大约1250μg/ml dda，
[0109]
4)大约250μg/ml mmg，
[0110]
5)大约62.5μg/ml聚(i:c)，
[0111]
6)大约2％(v/v)甘油，和
[0112]
7)以大约16.25mm的处于大约ph 7.4的tris。
[0113]
当实施第一个方面的方法时，所施用的肿瘤肽中的每一种的致免疫有效量优选地为至少10μg，例如至少或至多15，至少或至多20，至少或至多25，至少或至多30，至少或至多35，至少或至多40，至少或至多45，至少或至多50，至少或至多55，至少或至多60，至少或至多65，至少或至多70，至少或至多75，至少或至多80，至少或至多85，至少或至多90，至少或至多95，至少或至多100，至少或至多105，至少或至多110，至少或至多115，至少或至多120，至少或至多125，至少或至多130，至少或至多135，至少或至多140，至少或至多145，至少或至多150，至少或至多155，至少或至多160，至少或至多165，至少或至多170，至少或至多175，至少或至多180，至少或至多185，至少或至多190，至少或至多195，至少或至多200，至少或至多205，至少或至多210，至少或至多215，至少或至多220，至少或至多225，至少或至多230，至少或至多235，至少或至多240，至少或至多245，至少或至多250，至少或至多255，至少或至多260，至少或至多265，至少或至多270，至少或至多275，至少或至多280，至少或至多285，至少或至多290，至少或至多295，至少或至多300，至少或至多305，至少或至多310，至少或至多315，至少或至多320，至少或至多325，至少或至多330，至少或至多335，至少或至多340，至少或至多345，至少或至多350，至少或至多355，至少或至多360，至少或至多365，至少或至多370，至少或至多375，至少或至多380，至少或至多385，至少或至多390，至少或至多395，和至少或至多400μg。因此，优选地，所施用的肽中的每一种的致免疫有效量选自由下列各项组成的组：11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、
349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399和400μg。
[0114]
与此相关，每次免疫接种施用给人的所述脂质体组合物的体积典型地为400至2000μl，其中典型的体积为大约400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、1200、1210、1220、1230、1240、1250、1260、1270、1280、1290、1300、1310、1320、1330、1340、1350、1360、1370、1380、1390、1400、1410、1420、1430、1440、1450、1460、1470、1480、1490、1500、1510、1520、1530、1540、1550、1560、1570、1580、1590、1600、1610、1620、1630、1640、1650、1660、1670、1680、1690、1700、1710、1720、1730、1740、1750、1760、1770、1780、1790、1800、1810、1820、1830、1840、1850、1860、1870、1880、1890、1900、1910、1920、1930、1940、1950、1960、1970、1980、1990和2000μl。如上面所指出的，所述脂质体组合物的致免疫有效量的每个施用可以以至少2个分施用，特别是每次免疫接种的2个分施用来进行；在这种情况下，将所述致免疫有效量分为相关数目的级分，然后将每个级分典型地在分开的位置处进行施用。例如，当施用2000μl时，这优选地以2个1000ml的所述组合物的分施用来进行，优选地在患者中的分开的位置处。
[0115]
如在本文中所提及的，本发明的优选的疫苗诱导细胞免疫，特别是cd8

t
‑
细胞应答，特别地ctl应答的诱导，但是cd4

t
‑
细胞应答的诱导也是有价值的。
[0116]
关于施用途径，可以使用任何用于施用基于肽的疫苗的方便且有效的途径。优选的途径为真皮内、皮下、腹膜内和肌内途径，但是肺内、眼内、鞘内和大脑内途径也是可能的。
[0117]
组合物的单位剂量
–
第二个方面
[0118]
本发明的第二个方面涉及(脂质体)组合物的单位剂量，所述单位剂量包含致免疫有效量的至少一种肽(肿瘤肽)，其包含患者的瘤形成细胞的肿瘤表位的氨基酸序列；阳离子脂质体佐剂；和经缓冲的溶剂。通常，所述单位剂量的组合物的特性和组分相应于在本发明的第一个方面中所使用的组合物的那些，并且通常关于上面所公开的脂质体组合物的所有考虑和细节比照适用于形成所述单位剂量的组合物。
[0119]
因此，与所述方法需要施用某些优选量的上面所讨论的肿瘤肽这一事实相一致，所述单位剂量优选地包含至少10μg，例如至少或至多15，至少或至多20，至少或至多25，至少或至多30，至少或至多35，至少或至多40，至少或至多45，至少或至多50，至少或至多55，至少或至多60，至少或至多65，至少或至多70，至少或至多75，至少或至多80，至少或至多85，至少或至多90，至少或至多95，至少或至多100，至少或至多105，至少或至多110，至少或至多115，至少或至多120，至少或至多125，至少或至多130，至少或至多135，至少或至多140，至少或至多145，至少或至多150，至少或至多155，至少或至多160，至少或至多165，至少或至多170，至少或至多175，至少或至多180，至少或至多185，至少或至多190，至少或至多195，至少或至多200，至少或至多205，至少或至多210，至少或至多215，至少或至多220，
至少或至多225，至少或至多230，至少或至多235，至少或至多240，至少或至多245，至少或至多250，至少或至多255，至少或至多260，至少或至多265，至少或至多270，至少或至多275，至少或至多280，至少或至多285，至少或至多290，至少或至多295，至少或至多300，至少或至多305，至少或至多310，至少或至多315，至少或至多320，至少或至多325，至少或至多330，至少或至多335，至少或至多340，至少或至多345，至少或至多350，至少或至多355，至少或至多360，至少或至多365，至少或至多370，至少或至多375，至少或至多380，至少或至多385，至少或至多390，至少或至多395，和至少或至多400μg的每种肿瘤肽，和优选地选自11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399和400μg的每种肿瘤肽的量
–
再次，条件为所包括的肿瘤肽的总质量的上限依照所述组合物的物理化学特性来设定。
[0120]
此外，与所施用的脂质体组合物的优选体积相一致，所述单位剂量的构成优选地为400至2000μl，例如400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、1200、1210、1220、1230、1240、1250、1260、1270、1280、1290、1300、1310、1320、1330、1340、1350、1360、1370、1380、1390、1400、1410、1420、1430、1440、1450、1460、1470、1480、1490、1500、1510、1520、1530、1540、1550、1560、1570、1580、1590、1600、1610、1620、1630、1640、1650、1660、1670、1680、1690、1700、1710、1720、1730、1740、1750、1760、1770、1780、1790、1800、1810、1820、1830、1840、1850、1860、1870、1880、1890、1900、1910、1920、1930、1940、1950、1960、1970、1980、
1990和2000μl。
[0121]
此外，所述单位剂量包括许多肿瘤肽，所述数目优选地选自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30，尽管所述数目可以更高，如果所述脂质体组合物的物理化学特性允许如此。
[0122]
本发明的组合物
–
第三个方面
[0123]
认为在本发明的第一个方面中所使用的脂质体组合物本身是具备创造性的。因此，本发明的第三个方面涉及脂质体组合物，其已在本发明的第一个方面的情景下进行了公开，并且就其涉及脂质体组合物的特性和组分而言在第一个方面下所进行的所有公开内容比照适用于本发明的第三个方面。
[0124]
其他方面
[0125]
如从权利要求书中将会显然的，本发明还涉及第二个方面的单位剂量或者第三个方面的组合物，其用于在疗法中使用，特别是用于在第一个方面的方法中使用。类似地，本发明还包括第二个方面的单位剂量或者第三个方面的脂质体组合物在制备用于在本发明的第一个方面的任何方法中使用的药用组合物中的用途。
[0126]
实施例1
[0127]
通过在caf09b佐剂中的肽来诱导肿瘤表位特异性t
‑
细胞
[0128]
在两个最近的未发表的临床前肿瘤研究(数据未在此呈现)中，发现用由与2.0μg的许多所预测的肿瘤肽中的每一种相混合的佐剂caf09b组成的疫苗进行的免疫接种不抑制所述肿瘤肽所源自的肿瘤的生长。
[0129]
在本研究中，测试了一种肿瘤肽(在本文中称为c22)的较高剂量。已经定义了在c22中的最小表位，因此允许通过mhc i多聚体染色来检测肿瘤肽特异性cd8 t
‑
细胞。c22具有氨基酸序列qietqqrkfkasrasilsemkmlkekr(seq id no:1)，其中最小mhc i类限制性表位由加有下划线的9个氨基酸kfkasrasi(seq id no:2)构成。
[0130]
因此，本研究的目标是：
[0131]
i)测试与caf09b相混合的高肿瘤肽剂量是否诱导肿瘤肽特异性脾t细胞，
[0132]
ii)测试是否可以在未富集的全血样品中检测肿瘤肽特异性cd8 细胞，因为这使得随时间跟踪应答成为可能，
[0133]
iii)测试“簇集初激”是否优于标准的初激
‑
加强免疫接种。
[0134]
为了有利于基于肽的疫苗的cd8 t细胞免疫应答，statens serum institute(ssi)开发了一种阳离子脂质体佐剂，caf09b，其已显示出诱导cd4 和cd8 t细胞两者。所述脂质体由下列物质组成：有助于排斥/稳定性和细胞进入的带正电荷的二甲基二(十八烷基)铵(dda)，作为用于cd4 细胞产生的pamp信号的单分枝酰甘油(mmg)，和具有诱导反应性细胞毒性t细胞的潜力的toll
‑
样受体3激动剂聚肌胞苷酸(“聚(i:c)”)。
[0135]
通过小鼠结肠癌细胞系ct26和来自balb/c小鼠的正常组织样品的全外显子组测序和通过选择仅在癌细胞中发现的肽来鉴定肿瘤肽。
[0136]
本实验的目标是测试佐以caf09b的所预测的肿瘤肽是否能够在小鼠中诱导反应性t细胞。
[0137]
在wick da等人,(2011),vaccine 29(5):984
‑
993的出版物中，已报道了用与聚(i:c)相混合的3.7μg的源自hpv16 e7的具有19个氨基酸残基的肽进行簇集初激优于常规
的初激
‑
加强免疫接种。另外，在ott pa等人,(2017),nature 547(7662):217
‑
221的一篇近期的文章中，在用处于hiltonol佐剂中的肿瘤肽进行簇集初激的黑素瘤患者之中报道了临床应答。
[0138]
因此假设，用肿瘤肽进行簇集初激将会引发相比于标准的初激
‑
加强免疫接种而言更强的应答。
[0139]
材料和方法
[0140]
balb/c小鼠
[0141]
从janvier labs获取6
‑
8周龄balb/c jrj雌性小鼠。在该实验开始前，让小鼠适应新环境一周。小鼠可随意获取水和标准的食物丸粒。根据更严格的并因此完全符合欧洲指令(2010/63/eu)的丹麦动物实验法令，在来自丹麦动物实验监察局(danish animal experimentation inspectorate)的许可证2017
‑
15
‑
0201
‑
01338下进行该实验。给小鼠加了耳朵标签以允许个体的鉴定。
[0142]
实验设计
‑
小鼠的分配和处理
[0143]
为了避免“笼效应”，所有处理组在每个笼子中都有代表。组1、2、3和4(簇集免疫接种组)中的小鼠在第0、1、2、3、7、14和21天时分别用与caf09b相混合的0.4、2.0、10.0和50.0μg的c22以腹膜内方式(i.p.)进行免疫接种。相应的组(5、6、7和8)按照传统的初激
‑
加强策略在第0、14和21天时用与组1、2、3和4所接受的相同的溶液进行疫苗接种。对于所有疫苗，用于小鼠的用药体积为200μl。关于细节，参见图1。
[0144]
疫苗制剂
[0145]
由genscript合成c22肽，并且将其作为冻干产品等分成0.8mg部分。通过向每个等份试样添加80μl dmso来将所述肽溶解在dmso中至10mg/ml的浓度。然后，将该肽储备物在无菌水中稀释10倍(80μl肽储备物 720μl无菌水)。对于每个用药日，制备肽并且储存于
‑
20℃直至使用。在免疫接种那一天，将所述肽解冻并且以所示体积添加tris缓冲液和caf09b。用于小鼠的最终疫苗包含200μg dda、40μg mmg和10μg聚(i:c)/剂。关于所述疫苗制剂的进一步细节，参见下面的表格：
[0146] c22剂量c22体积无菌水triscaf09b组10.4288500400组221090500400组3105050500400组450250
‑
500400组50.4288500400组621090500400组7105050500400组850250
‑
350400
[0147]
从脾产生单细胞悬浮液
[0148]
在终点，从在该研究中的所有小鼠中收集脾脏。按照下面的实验方案来产生单细胞悬浮液：
[0149]
材料
[0150]
rpmi(gibco rpmi 1640)
[0151]
fcs(gibco)
[0152]
rbc裂解缓冲液10x(biolegend，#420301)
[0153]
70μm细胞滤网(corning，#43175)
[0154]
gentlemacs c管(miltenyi，#130
‑
093
‑
237)
[0155]
50ml管
[0156]
冷冻小瓶
[0157]
仪器
[0158]
gentlemacs解离器(miltenyi)
[0159]
laf工作台
[0160]
mr.frosty或另一种冷冻盒
[0161]
程序
[0162]
1.将组织收集入包含r10(包含10％fcs的rpmi)的预先加有标签的c管中。
[0163]
推荐：3ml介质/脾脏。在冰上储存直至处理。保持无菌。
[0164]
2.紧紧关闭c管，并且倒置附着至gentlemacs解离器的套筒上。运行程序m_spleen_01(对于1
‑
2个脾脏/管)。
[0165]
3.任选项：在解离后进行c管的短暂离心以在管底部收集样品材料。
[0166]
4.在预先加有标签的50ml管的顶部放置70μm细胞滤网并且用r10进行预湿润。
[0167]
5.重悬浮包含样品的c管并且将细胞悬浮液施加至70μm细胞滤网。
[0168]
6.任选项：用2ml r10洗涤c管并且施加至细胞滤网以得到残留细胞。
[0169]
7.用5ml r10冲洗细胞滤网。记得从过滤器底部吸移残留液体。
[0170]
8.离心细胞：1500rpm，5分钟@4℃。倒掉上清液。使粒状沉淀破碎。
[0171]
9.任选项：使用1ml的1x rbcl缓冲液(10x储备液，在pbs中进行稀释)进行红细胞裂解2分钟。用5ml r10进行洗涤以从rbcl缓冲液中得到细胞。
[0172]
10.重悬浮在1ml r10中并且对细胞进行计数。
[0173]
11.用5ml r10再次进行洗涤。
[0174]
任选项：通过额外的70μm细胞滤网进行过滤以去除碎片，如果有的话。
[0175]
12.以合适的浓度(例如，20
×
106个细胞/ml)将细胞重悬浮在fcs 10％dmso中。
[0176]
13.将1ml细胞悬浮液等分至预先加有标签的冷冻小瓶。
[0177]
14.将细胞转移至mr.frosty并且在转移至氮储存之前置于
‑
80℃下24小时。
[0178]
为了检测c22特异性cd8 t细胞，将全edta血液样品和脾细胞用加载有衍生自c22的最小肽kfkasrasi(seq id no:2)(其被鉴定为嵌入在具有27个氨基酸的c22序列中的最强mhc i结合物)的经荧光标记的mhc i多聚体进行染色。图2中描绘了mhc i多聚体测定法。详细的染色实验方案如下：
[0179]
材料
[0180]
eppendorf管
[0181]
96深孔平板(2ml，sigma，#575653)
[0182]
裂解溶液10x(bd#349202)
[0183]
mhc多聚体，经c22 apc和pe标记的以及经不相关的(c30)apc和pe标记的facs缓冲液(pbs 2％fcs)
[0184]
程序
[0185]
1.从小鼠中抽血：静脉穿刺(尾部或隐静脉)到经edta包被的管(bd vacutainer edta血液采集管)中。
[0186]
2.按照平板设置，在96深孔平板中对50μl的血液进行染色。
[0187]
3.在解冻后旋转多聚体(快速旋转)。
[0188]
4.在eppendorf管中在29μl facs缓冲液(每个样品)中稀释1μl的每种多聚体。
[0189]
5.旋转多聚体eppendorf管(3300g，5分钟)。
[0190]
6.按照平板设置，添加30μl经稀释的多聚体。按照平板设置，向“无多聚体样品”添加30μl facs缓冲液。
[0191]
6.1.避免在多聚体管中的粒状沉淀，因为这可能包含mhc多聚体的聚集体。
[0192]
7.按照平板设置，向设置样品添加50μl facs缓冲液。
[0193]
8.在黑暗中在37℃下温育15分钟。
[0194]
9.通过添加1μl抗
‑
cd16/cd32来封闭fc结合，在黑暗中在室温下温育10分钟。
[0195]
10.按照计算来制备抗体主混合物
–
参见附录2。
[0196]
11.按照平板设置，向孔添加20μl抗体主混合物以进行染色。
[0197]
12.在4℃下温育30分钟。
[0198]
13.每孔添加1ml裂解/固定溶液(在h2o中稀释的)以裂解红细胞。在黑暗中在室温下温育5
‑
10分钟。
[0199]
14.在facs缓冲液中洗涤2次(以1500rpm旋转5分钟)。
[0200]
15.转移至facs管，在200μl facs缓冲液中。
[0201]
16.在流式细胞仪上进行分析。
[0202]
结果
[0203]
循环性的肿瘤肽特异性cd8 t细胞的检测
[0204]
在第21天，收集edta血液并且用mhc i多聚体进行染色，按照在上面和在图2中所概括的测定法。仅分析在每个组中来自两只小鼠的样品，因为这是检测在全血样品中的肿瘤肽特异性cd8 t细胞的首次尝试；因此该分析被认为是先导实验。在终点(第28天)，对来自该实验中的所有小鼠的血液进行取样。
[0205]
在第21天，用簇集初激和标准的初激
‑
加强规程两者都观察到剂量依赖性应答；在以与caf09b相混合的10.0和50.0μg c22进行用药的小鼠中检测到肿瘤肽特异性cd8 t细胞，而更低剂量未引发任何肿瘤肽特异性cd8 t细胞(参见图3)。在终点，所述应答与第21天的相似，尽管已经额外一次对小鼠进行了加强(参见图4)。值得注意的是，在终点，在来自用2.0μg c22进行簇集初激的小鼠的血液中检测到低频次mhc:c22阳性cd8 t细胞，这与其中几乎未看到任何肿瘤肽特异性cd8 细胞的标准的初激
‑
加强规程相反。
[0206]
为了测试测定法的特异性，用mhc:c22多聚体对来自接受caf09b的小鼠的血液进行染色。在这些样品中，未检测到信号。类似地，用加载有衍生自肿瘤肽的不相关肽(称为“c25”)的mhc i四聚体进行染色的血液样品是阴性的，这表明该测定法是高度特异性的。
[0207]
肿瘤肽特异性脾cd8 t细胞的检测
[0208]
在终止时(首次免疫接种后28天)，从小鼠中收集脾脏，并且制备单细胞悬浮液并储存于
‑
80℃。另外，包括了来自两只幼稚小鼠和两只以腹膜内方式给予caf09b的小鼠的脾
脏。
[0209]
在终止那天，仅分析来自经簇集初激的小鼠的脾细胞。
[0210]
在来自用10.0和50.0μg c22 caf09b进行免疫接种的小鼠的脾脏中检测到肿瘤肽特异性cd8 t细胞，而更低剂量未诱导可检测的应答。与在全血样品中所观察到的相似，在给予caf09b的小鼠中未检测到肿瘤肽特异性cd8 t细胞。另外，当用加载有不相关肽(称为“c25”)的mhc四聚体对脾细胞进行染色时，未观察到信号。参见图5。
[0211]
动物健康状况
[0212]
为了监测所述疫苗对于小鼠的总体健康状况的影响，在接受所述疫苗后仔细地检查动物，并且在整个实验期间至少一周三次进行称重。小鼠在免疫接种后立即显示出腹部疼痛迹象，其在1
‑
2小时之内消退，之后它们返回正常行为。相比于标准的初激
‑
加强而言，连续的每日免疫接种没有显著地影响小鼠的健康状况。在这两组实验中，小鼠在第1次免疫接种后都丧失其初始体重的大约5％，但是随后的免疫接种未影响体重(数据未显示)。
[0213]
讨论
[0214]
用与caf09b相混合的10.0和50.0μg c22进行的免疫接种强力地诱导肿瘤肽特异性cd8 细胞，其通过mhc i四聚体染色来鉴定，而更低剂量令人惊讶地不诱导。另一方面，相比于常规的初激
‑
加强规程而言，未观察到簇集初激的显著优势。但是，相比于常规的初激
‑
加强而言，用簇集初激观察到对于2.0μg c22的应答的小的增加。
[0215]
用包含caf09b的疫苗进行免疫接种的小鼠丧失其初始体重的大约5％，这表明在所述疫苗中具有在生理学上有活性的组分。所述疫苗对于小鼠的总体健康状况的影响被认为是可接受的，因为体重丧失是短暂的并且所有小鼠都在3
‑
4天之内返回基线(对于簇集初激和初激
‑
加强方法两者)。
[0216]
实施例2
[0217]
初步临床试验数据
[0218]
在2019年3月以患者的首次用药来起始1/2a期临床试验以在靶向肿瘤表位方面测试本发明方法。所述试验包括罹患恶性黑素瘤、非小细胞肺癌(nsclc)和膀胱癌的患者。
[0219]
简而言之，所述治疗需要，在每一名所纳入的患者中鉴定一组源自恶性细胞的肿瘤表位，在这之后根据本发明将所述肿瘤表位合成、配制并且施用给患者；首先，以2周时间间隔以腹膜内方式进行3次免疫接种，并且随后在自最后一次腹膜内用药起的2周暂停后，以2周时间间隔进行3次肌内免疫接种。因此，所有疫苗接种优选地都以2周时间间隔给予。
[0220]
在腹膜内免疫接种结束后但在肌内免疫接种之前从2名患者中获得下面的数据。
[0221][0222]
患者1和2各自接受其用从肽库制备的疫苗进行的3次腹膜内免疫接种，所述肽已被鉴定为在所述患者的恶性组织中的包含肿瘤表位的氨基酸序列：
[0223]
对于患者1，所述肽库包括溶解在dmso中的下列9种肽(seq id no:3
‑
11)：
[0224][0225]
对于患者2，所述肽库包括溶解在dmso中的下列5种肽(seq id no:12
‑
16)：
[0226][0227]
标记有星号的肽以相比于其余肽而言大约两倍的浓度被包括在各自的库中。低浓度肽的所测量出的浓度在1.6和1.8mg/ml之间变动，而高浓度肽具有在3.1和3.5mg/ml之间变动的浓度。
[0228]
通过用1.08ml 25mm tris缓冲液稀释0.12ml的患者的肽库组合物来制备疫苗。从该溶液开始，将1ml经tris缓冲的库稀释物与1ml caf09b相混合以产生疫苗组合物。对于以1
×
剂量的ip注射，每次免疫接种以腹膜内方式注射0.50ml的所述疫苗组合物。
[0229]
紧在首次腹膜内免疫接种之前，从每名患者中收集血液，并且在3次腹膜内免疫接种之后且紧在首次肌内免疫接种之前，情况也是一样。因此，使来自这些血液样品的pbmc细胞经历预免疫接种以及腹膜免疫接种后的elispot测定法和ics/再刺激测定法。
[0230]
elispot测定法是用于间接检测反应性t
‑
细胞的标准技术，其中在用所述疫苗的肽中的每一种刺激从患者中分离出的外周血单核细胞(pbmc)后在elisa样设置中测量分泌出的细胞因子(在本情况下，ifnγ)。
[0231]
在ics/再刺激测定法中，用整个疫苗肽库刺激来自患者的pbmc，并且随后使其经历流式细胞术细胞计数，其中就细胞表面标志物(cd3、cd4、cd8)和细胞因子(ifnγ和tnfα)的存在来对它们进行测试以检测释放所述细胞因子的t细胞亚群的存在。
[0232]
来自这些实验的结果可以总结如下：
[0233]
患者1：在预免疫接种实验中，无论是ifnγelispot还是ics/再刺激测定法均未证明显著数目的针对任何疫苗肽的反应性t
‑
细胞的存在，当与阳性对照相比较时(数据未显示)。相反地，腹膜内免疫接种后实验在elispot测定法中证明了针对9种疫苗肽中的4种的反应性t
‑
细胞的存在(参见图6a)，和在ics/再刺激测定法中证明了ifn
‑
γ和tnf
‑
αcd4 细胞(图6g)而不是cd8 细胞(数据未显示)的存在。对于双剂量肽，在elispot中发现了最强的ifn
‑
γ应答。
[0234]
患者2：在预免疫接种实验中，无论是ifnγelispot还是ics/再刺激测定法均未证明显著数目的针对任何疫苗肽的反应性t
‑
细胞的存在，当与阳性对照相比较时(参见图7a和7c，后者仅显示了关于cd4 细胞的数据)。相反地，腹膜内免疫接种后实验在elispot测定
法中证明了针对5种疫苗肽中的3种的反应性t
‑
细胞的存在(参见图7b)，和在ics/再刺激测定法中证明了ifn
‑
γ和tnf
‑
αcd4 细胞(图7d)而不是cd8 细胞(数据未显示)的存在。对于双剂量肽，在elispot中发现了最强的ifn
‑
γ应答。
[0235]
可以得出结论，在这两名患者中，包含肿瘤表位的混合疫苗均诱导适应性免疫应答。