一株通过还原TCA途径生产己二酸的工程菌株及其构建方法与流程

一株通过还原tca途径生产己二酸的工程菌株及其构建方法
技术领域
1.本发明涉及一株通过还原tca途径生产己二酸的工程菌株及其构建方法，属于代谢工程领域。


背景技术：

2.三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,tcacycle)是生物体内最活跃的代谢途径，是脂肪，糖类，氨基酸三大类营养素的代谢枢纽。有氧条件下，生物体主要通过正向的氧化tca循环完成一系列的酶促反应，在厌氧条件下，逆向的还原tca途径会被激活来合成细胞所需要的重要原料。相比于氧化tca循环存在的两步会造成碳原子流失的脱羧步骤，还原tca循环由于其关联的固碳步骤，碳原子的利用率得到了显著提高。还原tca途径凭借其较高的理论产率已被大量应用于生产苹果酸，富马酸，琥珀酸等有机酸。
3.己二酸是一种重要的六碳二元羧酸，已被广泛地用于生产尼龙6,6等工业用品。通过化学法生产己二酸面临严峻的能源匮乏及环境污染等问题，因此寻求绿色的可持续发展的生物合成方法迫在眉睫。半生物法合成己二酸主要包括生物法合成己二酸前体物质以及前体物质通过化学催化转换为己二酸这两个步骤，然而化学催化过程贵金属铂的使用大大增加了生产成本，所以此方法很难适用于大规模的工业化。随着合成生物学及代谢工程的发展，全生物法合成己二酸的策略被大量地报道与应用，例如逆β氧化途径，脂肪酸的ω
‑
氧化，α
‑
酮酸途径等，然而，这些途径大都由于产率低很难得到进一步的放大生产。值得关注的是，目前，通过来源于thermobifidafusca的逆己二酸降解途径全生物合成己二酸实现了大肠杆菌中己二酸的最高报道产量。
4.逆己二酸降解途径合成己二酸的两个主要前体物质为琥珀酰辅酶a和乙酰辅酶a，其中，琥珀酰辅酶a作为tca循环的代谢中间产物既可以由氧化tca途径产生，也可以由还原tca途径产生。当琥珀酰辅酶a通过氧化tca途径产生时，由于异柠檬酸转化为α
‑
酮戊二酸和α
‑
酮戊二酸转化为琥珀酰辅酶a均为脱羧步骤，碳原子以二氧化碳形式的排放导致当以葡萄糖为底物进行生物合成己二酸时，己二酸的理论产率仅为54.07％。所以，虽然已有的报道己二酸的实际产率已经达到了理论产率的93％，但较低的理论产率限制了己二酸产量的进一步提高。因此，依赖于生物代谢网络，开发一种致力于提高碳源利用率的工程代谢途径，对于获得己二酸高产菌株具有重要的现实意义。


技术实现要素：

5.技术问题：
6.目前通过氧化tca途径偶联逆己二酸降解途径生产己二酸的理论产率最高仅为54.07％，限制了己二酸产量的进一步提高；合成代谢途径碳源不能被完全利用。
7.技术方案：
8.本发明第一个目的是提供一种通过还原tca途径偶联逆己二酸降解途径生产己二酸的工程菌株。
9.在一种实施方式中，以大肠杆菌为出发菌株，过表达编码琥珀酰辅酶a合成酶α亚基的基因sucd，富马酸还原酶的基因frdabcd。
10.在一种实施方式中，所述工程菌株还过表达了编码丙酮酸羧化酶的基因pyc。
11.在一种实施方式中，所述基因sucd的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述基因frdabcd的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述基因pyc的核苷酸序列如seq id no.3所示。
12.在一种实施方式中，所述大肠杆菌为e.coli mad1415。
13.在一种实施方式中，所述工程菌株是以pacm4g质粒为载体。
14.在一种实施方式中，所述pacm4g质粒是以pacm4为模板，进行全质粒pcr，将cmr基因替换为gmr基因。
15.在一种实施方式中，所述pacm4g质粒上还含有编码如seq id no.6所示启动子p
ffs
的核苷酸序列、编码核苷酸序列如seq id no.8所示所的启动子p
fnrf8
、编码如seq id no.7所示启动子p
c
的核苷酸序列、编码如seq id no.5所示fnr基因的核苷酸序列和编码如seq id no.9所示抗性基因gmr的核苷酸序列；所述p
ffs
调控fnr的表达；所述p
fnrf8
上整合fnr基因结合位点的序列，并调控下游目的基因的表达；所述启动子p
ffs
和启动子p
fnrf8
转录方向相反。
16.在一种实施方式中，所述过表达的基因sucd和frdabcd在pacm4g质粒的nde i/xho i位点以单顺反子结构进行组合串联表达。
17.在一种实施方式中，所述过表达的基因pyc、sucd和frdabcd在pacm4g质粒的nde i/xho i位点以单顺反子结构进行组合串联表达。
18.本发明的第二目的是提供一种生产己二酸的方法，是将所述工程菌株进行发酵。
19.在一种实施方式中，所述具体步骤如下：将所述工程菌过夜活化得到种子液，以2％接种量接种于含sob培养基的橡胶塞瓶中，添加葡萄糖，前期以透气封口膜封口发酵，待葡萄糖耗尽，以橡胶塞封口进行厌氧发酵，并补充葡萄糖。
20.在一种实施方式中，所述葡萄糖的添加量为3～5g/l。
21.在一种实施方式中，所述发酵的培养条件为35～39℃，230～270rpm。
22.本发明还保护所述工程菌株在己二酸合成中的应用。
23.有益效果：本发明获得了一种通过还原tca途径偶联逆己二酸降解途径生产己二酸的工程菌株mad1415
‑
f8naspf，其关键在于重新布线了一条合成己二酸前体物质琥珀酰辅酶a的还原tca途径，在基因组合过表达强化及操纵子结构优化策略下，己二酸的生物合成有效可行且效果显著。此菌株是以首次建立的还原tca途径偶联逆己二酸降解途径进行代谢，从而完成己二酸的生物合成。与现有技术相比，本菌株代谢的最大的优势是避开了脱羧步骤，引入了固碳步骤，实现了无碳流失，使碳源得到了最大化有效利用。因此本发明使得以葡萄糖为底物生物合成己二酸的理论产率相比提高了50％，此外，此菌株代谢途径的重新布线也为其他高附加值有机酸的生物合成提供了一定的借鉴。
附图说明
24.图1还原tca途径偶联逆己二酸降解途径合成己二酸的理论分析及布线设计。
25.图2不同过表达基因组合对于己二酸生物合成的影响。
26.图3不同操纵子结构对于己二酸生物合成的影响。
27.图4单顺反子结构不同基因组合质粒构建示意图。
28.图5不同操纵子结构组合质粒构建示意图。a：假操纵子结构sucd
‑
pyc
‑
frdabcd基因组合质粒构建示意图；b:经典操纵子结构sucd
‑
pyc
‑
frdabcd基因组合质粒构建示意图。
具体实施方式
29.限制性内切酶和dna聚合酶分别购自赛默飞和takara公司。紫外分光光度计(uv
‑
1800,321aoe instruments,shanghai)用于检测细胞密度，高效液相色谱(hplc；agilent，usa)用于检测发酵液中代谢产物含量。
30.大肠杆菌k12 mg1655重组菌株mad1415用于蛋白质表达和己二酸合成：见文章：doi:10.1016/j.jbiotec.2020.03.011。
31.corynebacterium crenatum用于基因pyc扩增：见文章：doi:10.3969/j.issn.1673
‑
1689.2019.03.012。
32.质粒pacm4：见文章：doi:10.1021/sb300016b。
33.质粒pacm4g的构建：以质粒pacm4为模板，进行全质粒pcr，将cmr基因替换为gmr基因。
34.己二酸双相发酵：lb培养基中35
‑
39℃，220
‑
270rpm过夜活化的实验菌株种子液，2％(v/v)接种量接种至含有200ml sob培养基的250ml丁基橡胶塞血清瓶中，初始葡萄糖添加量为4g/l，前期使用透气封口膜进行好氧条件培养，此阶段用于富集细胞收集能量，待葡萄糖耗尽后(约12h)血清瓶加塞转为厌氧进行发酵，同时补加4g/l葡萄糖。37℃，250rpm培养。按要求分别加入氨苄青霉素(100μg/ml)、庆大霉素(50μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)。在培养基中加入等摩尔有机酸盐进行特定目的发酵。
35.下述实施例中所涉及的所有菌体活化都利用lb培养基，培养条件为37℃、250rpm。己二酸发酵利用sob培养基，发酵条件为37℃、250rpm。
36.实施例1菌株构建
37.(1)氧气响应型生物传感器的构建
38.传感器质粒主要由3个部分组成：1)富马酸硝酸盐还原蛋白fnr基因及其上游的的启动子p
ffs
；2)厌氧诱导型启动子p
fnrf8
及其下游诱导表达的目的基因；3)gmr抗性基因及其上游启动子p
c
。
39.厌氧诱导型启动子p
fnrf8
位于质粒pacm4g酶切位点avr ii和xba i之间；启动子p
fnrf8
诱导下游目的基因的表达；启动子p
ffs
位于质粒pacm4g酶切位点avr ii上游，诱导下游fnr基因的表达；gmr抗性基因位于fnr基因的下游，由上游p
c
启动子诱导表达。
40.以大肠杆菌k12 mg1655基因组为模板，使用引物fnr
‑
f/fnr
‑
r进行pcr扩增出fnr片段；以质粒pgrt
‑
ffs为模板，使用引物p
ffs
‑
f/p
ffs
‑
r进行pcr扩增出启动子p
ffs
用于启动fnr蛋白的转录；通过合成互补单链退火得到厌氧诱导型启动子p
fnrf8
；以pacm4g质粒为骨架，通过多片段融合pcr，无缝克隆组装得到氧气响应型生物传感器质粒pacm4g
‑
f8。
41.(2)过表达质粒的构建
42.从大肠杆菌k12 mg1655的基因组dna中分别扩增出sucd、frdabcd和mdh基因，所用引物见表1；从corynebacterium crenatum的基因组dna中扩增出pyc基因，分别将其克隆至
步骤(1)中构建获得的重组质粒pacm4g
‑
f8的nde i/xho i位点。以含有sucd基因的重组质粒pacm4g
‑
f8s质粒为基础，根据质粒骨架的epathbrick载体的原理迭代基因的表达，当nhe i和avr ii两个同尾酶分别与hindiii酶切作用，得到的两个酶切产物进行交互连接，构建具有单顺反子结构的不同基因组合的重组质粒，分别是pacm4g
‑
f8nasp、pacm4g
‑
f8nasm、pacm4g
‑
f8nasf、pacm4g
‑
f8naspf、pacm4g
‑
f8nasmf和pacm4g
‑
f8nasmfp，质粒构建方法及示意图可见图4所示。当spe i和avr ii两个同尾酶分别与hindiii酶切作用，得到的两个酶切产物进行交互连接，构建具有假操纵子结构的不同基因组合的重组质粒pacm4g
‑
f8saspf，质粒构建方法及示意图如图5a所示。当spe i和xba i两个同尾酶分别与hindiii酶切作用，得到的两个酶切产物进行交互连接，构建具有经典操纵子结构的不同基因组合的重组质粒pacm4g
‑
f8sxspf，质粒构建方法及示意图如图5b所示。
43.表1引物序列表
44.名称序列(5
’‑3’
)fnr
‑
ftcaggcaacgttacgcgtatgfnr
‑
ratgatcccggaaaagcgaattatacgp
ffs
‑
fattgagagcgttgagaaccaacgp
ffs
‑
ratagccttcgggaatagcggcsucd
‑
fgggaattccatatgatgtccattttaatcgataaaaacaccaaggsucd
‑
rccgctcgagttatttcagaacagttttcagtgcttcaccgfrdabcd
‑
fgggaattccatatggtgcaaacctttcaagccgatctfrdabcd
‑
rccgctcgagttagattgtaacgacaccaatcagcgtmdh
‑
fgggaattccatatgatgaaagtcgcagtcctcggmdh
‑
rccgctcgagttacttattaacgaactcttcgcccaggpyc
‑
fgggaattccatatggtgtcgactcacacatcttcaacgpyc
‑
rccgctcgagttaggaaacgacgacgatcaagtcgc
45.实施例2以葡萄糖全生物合成己二酸的理论分析及设计
46.以葡萄糖为底物，经糖酵解及还原tca途径，进而通过逆己二酸降解途径全生物合成己二酸，其中涉及到丙酮酸至草酰乙酸的固碳步骤，整个代谢反应计量式分析如下表2，可见，此途径没有任何碳流失，1mol葡萄糖经代谢可转化为1mol己二酸，即己二酸理论产率为0.81g/g葡萄糖。与之前通过氧化tca途径获得己二酸合成前体进而合成己二酸的研究相比，己二酸的理论产率提高了50％(81.11％vs 54.07％)。整个代谢途径的布线设计见图1。
47.表2以葡萄糖为底物合成己二酸的代谢途径化学计量分析
[0048][0049]
实施例3不同过表达基因组合对己二酸生物合成的影响
[0050]
将实施例1构建得到的质粒pacm4g
‑
f8s、pacm4g
‑
f8nasp、pacm4g
‑
f8nasm、pacm4g
‑
f8nasf、pacm4g
‑
f8naspf、pacm4g
‑
f8nasmf和pacm4g
‑
f8nasmfp分别导入大肠杆菌k12 mg1655重组菌株mad1415，获得重组菌株mad1415
‑
f8s、mad1415
‑
f8nasp、mad1415
‑
f8nasm、mad1415
‑
f8nasf、mad1415
‑
f8naspf、mad1415
‑
f8nasmf和mad1415
‑
f8nasmfp。以过表达了sucd的mad1415
‑
f8s为对照，以分别过表达编码丙酮酸羧化酶的基因pyc，编码苹果酸脱氢酶的基因mdh，编码富马酸还原酶的基因frdabcd的对应菌株mad1415
‑
f8nasp，mad1415
‑
f8nasm，mad1415
‑
f8nasf进行双相摇瓶发酵，以己二酸滴度作为评价指标。其中，基因sucd和基因frdabcd的过表达菌株mad1415
‑
f8nasf己二酸产量显著提高，滴度为0.27g/l，是mad1415
‑
f8s的17.50倍(图2)。在mad1415
‑
f8nasf的基础上进一步以单顺反子结构叠加基因的表达，pyc的过表达使得菌株mad1415
‑
f8naspf的己二酸产量进一步提高，滴度为0.30g/l，是sucd和frdabcd基因过表达菌株mad1415
‑
f8nasf的1.13倍(图2)。然而，mdh在mad1415
‑
f8nasf中的进一步过表达促进了细胞的生长，但不利于己二酸的进一步提高(图2)。
[0051]
对比例1
[0052]
基于实施例3的基础上，得到基因sucd
‑
pyc
‑
frdabcd组合为有利于己二酸生产的最佳基因组合。当多个基因进行串联表达时，不同操纵子结构对于基因的共表达效果有不同的影响，已知的操纵子结构有以下三种，第一种为经典的操纵子结构，即所有的基因共同由一个启动子和一个终止子进行调控，但每个基因独有一个核糖体结合位点；第二种结构为假操纵子结构，即每个基因分别由独有的启动子进行调控，但所有基因共用一个终止子；第三种结构为单顺反子结构，即每个基因分别由独有的启动子和独有的终止子进行调控(图5)。将实施例1获得的具有这三种操纵子结构的sucd
‑
pyc
‑
frdabcd组合重组质粒分别导入肠杆菌k12mg1655重组菌株mad1415，并通过双相摇瓶发酵，以己二酸的积累量作为评价标准。结果显示，单顺反子结构最有利于己二酸的生物合成，经典操纵子结构及假操纵子结构下菌株的生长具有一定的优势，但己二酸的积累没有得到有效的提高，仅是菌株mad1415
‑
f8naspf产己二酸产量的68.2％、82.4％(图3)。
[0053]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技
术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：
1.一株产己二酸的工程菌株，其特征在于，以大肠杆菌为出发菌株，过表达编码琥珀酰辅酶a合成酶α亚基的基因sucd，编码富马酸还原酶的基因frdabcd。2.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，还过表达了编码丙酮酸羧化酶的基因pyc。3.根据权利要求2所述的菌株，其特征在于，所述基因sucd的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述基因frdabcd的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述基因pyc的核苷酸序列如seq id no.3所示。4.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述大肠杆菌为e.coli mad1415。5.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述工程菌株是以pacm4g质粒为载体；所述pacm4g载体是以质粒pacm4为模板，将氯霉素抗性基因cmr替换为庆大霉素抗性基因gmr。6.根据权利要求5所述的菌株，其特征在于，所述pacm4g质粒上还含有编码如seq id no.6所示启动子p
ffs
的核苷酸序列、编码核苷酸序列如seq id no.8所示所的启动子p
fnrf8
、编码如seq id no.7所示启动子p
c
的核苷酸序列、编码如seq id no.5所示fnr基因的核苷酸序列。7.根据权利要求1～6任一所述的菌株，其特征在于，所述过表达的基因sucd、frdabcd在pacm4g质粒的nde i/xho i位点以单顺反子结构进行组合串联表达；或所述过表达的基因sucd、frdabcd和pyc在pacm4g质粒的nde i/xho i位点以单顺反子结构进行组合串联表达。8.一种生产己二酸的方法，其特征在于，应用权利要求1
‑
7任一所述的工程菌株进行发酵。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，是将权利要求1
‑
7任一所述的工程菌进行发酵，初始添加葡萄糖，前期好氧发酵，待葡萄糖耗尽，进行厌氧发酵，并补充葡萄糖。10.权利要求1～7任一所述工程菌株或权利要求8或9所述方法在己二酸合成中的应用。
技术总结
本发明公开了一株通过还原TCA途径生产己二酸的工程菌株及其构建方法，属于代谢工程领域。本发明以还原TCA途径和逆己二酸降解途径为基础，通过过表达相关基因进行途径强化以及基因表达水平层面的优化，从而获得了一株具有较大潜力的己二酸生产菌株。本发明对于提高己二酸的产率具有强有力的理论依据，提高了碳源的利用率，减少了二氧化碳的排放，己二酸产量达到0.3g/L，所述方法为其他高附加值有机酸生产菌株的代谢重组提供了方法借鉴。产菌株的代谢重组提供了方法借鉴。产菌株的代谢重组提供了方法借鉴。


技术研发人员：邓禹 周胜虎 郝婷婷 毛银 李国辉 赵运英
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2021.03.01
技术公布日：2021/6/29