本发明属于植物化学技术领域，具体涉及一种从川滇唐松草全株中提取的喹啉生物碱类新化合物及其制备方法与应用。
背景技术：
滇川唐松草(学名：thalictrumfinetii)，为双子叶植物纲、毛茛目、毛茛科、唐松草属的一个种。分布于中国西藏东南部、四川西部，生长于山地草坡、林边或林中。滇川唐松草为云南民间常用的中药材，具有热利湿、化湿祛毒、主热症闹心等功效，常用于治疗寒湿泻痢、风热咳嗽、目赤肿痛、痈肿疮疖等疾病。
目前，从天然植物中寻找高效低毒的抗病毒活性分子也是当前天然产物化学的研究热点，临床上，多种药用植物资源广泛用于治疗各种病毒性感染疾病，如板蓝根、忍冬、甘草、苦参、大黄、菊花等。云南天然药物资源极为丰富，且与民族多样性相互交融，多种特色药物在长期民间用药中被证实具有抗病毒功效，因此，从特色药用植物资源中发现病毒抑制剂前景非常广阔。
喹啉生物碱类化合物在很多天然植物中存在，并且具有多种生物活性。由于喹啉生物碱类化合物具有如此广谱的药理活性，国内外研究者对该类化合物进行了深入的研究，除从天然产物中寻找该类化合物外，还经过结构修饰而得到具有更优药理活性的化合物。通过研究这类化合物的构效关系，可进一步研究和开发更多的喹啉生物碱类化合物，从中寻找有效的先导化合物和活性基团。本发明从云南川滇唐松草中分离得到了一种新的喹啉生物碱类化合物，该化合物至今尚未见到相关报道，值得一提的是该化合物具有显著的抗烟草花叶病病毒活性，可作为烟草花叶病防治生物农药的先导化合物。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种喹啉生物碱类化合物，本发明的第二目的是提供所述喹啉生物碱类化合物的制备方法，本发明的第三目的在于提供所述喹啉生物碱类化合物的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，一种喹啉生物碱类化合物，其分子式为c17h17no3，结构式如式（i）所示：
该化合物的命名为：4-乙酰基-6-甲基-7-(3-甲基-2-氧代丁基-3-烯基)-喹啉-2(1h)-酮；英文名为：4-acetyl-6-methyl-7-(3-methyl-2-oxobut-3-enyl)quinolin-2(1h)-one。
本发明的第二目的是这样实现的，所述喹啉生物碱类化合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）以川滇唐松草全株为原料，用第一溶剂进行提取，浓缩成浸膏；
（2）将浸膏用第二溶剂溶解后进行硅胶柱层析，用氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集氯仿-丙酮溶液体积比为9:1的洗脱液；
（3）将洗脱液用高压液相色谱分离纯化得式（i）所示化合物。
本发明的第三目的是这样实现的，所述喹啉生物碱类化合物的应用为在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。
本发明的有益效果为：
1、本发明喹啉生物碱类化合物结构新颖，为研究和开发更多的喹啉生物碱类化合物，从中寻找有效的先导化合物和活性基团提供了新的途径。
2、本发明喹啉生物碱类化合物结构简单，具有显著的抗烟草花叶病毒活性，在制备抗烟草花叶病毒生物农药中有良好的应用前景，还可作为抗花叶病毒药物研发的先导性化合物用于抗花叶病毒药物制剂研发。
3、本发明化合物的制备方法简单，原料充足易得，易实现产业化生产。
附图说明
图1为本实施例1喹啉生物碱类化合物的核磁共振碳谱；
图2为本实施例1喹啉生物碱类化合物的核磁共振氢谱；
图3为本实施例1喹啉生物碱类化合物的主要hmbc相关图示。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。
本发明一种喹啉生物碱类化合物，其结构式如式（i）所示：
本发明还提供所述化合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）以川滇唐松草全株为原料，用第一溶剂进行提取，浓缩成浸膏；
（2）将浸膏用第二溶剂溶解后进行硅胶柱层析，用氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集氯仿-丙酮溶液体积比为9:1的洗脱液；
（3）将洗脱液用高压液相色谱分离纯化得式（i）所示化合物。
所述步骤1中，将原料浸泡于第一溶剂中24h～72h后进行提取，第一溶剂与原料的重量比为2～4:1，提取次数为3～5次。
所述步骤1中，第一溶剂为80～100%的甲醇或80～100%的乙醇或60～90%的丙酮水溶液。
浸膏用重量比2～4倍量的160～300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析。
所述步骤2中，梯度洗脱的氯仿-丙酮溶液体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2。
所述步骤2中，所述第二溶剂为甲醇或乙醇或丙酮。
所述步骤3中，高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5µm的c18色谱柱，流速为20ml/min，流动相为68%的甲醇，紫外检测器检测波长为342nm，每次进样0.5～1.0ml，收集31.8min的色谱峰，多次累加后蒸干。
步骤3得到的化合物可用纯甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化，获得纯度更高的纯品。
本发明还提供了所述化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。
本发明所用烟叶原料不受地区和品种限制，均可以实现本发明，下面以来源于不同产地的川滇唐松草，对本发明做进一步说明：
实施例1
本实施例川滇唐松草来源于四川凉山，将2.0kg川滇唐松草粉碎至50目，以95%的甲醇水溶液提取5次，每次提取24h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏112g。浸膏用重量比2.0倍量的甲醇溶解后用150g的100目粗硅胶拌样，0.65kg的160目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，tlc监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为9:1的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以68％的甲醇水溶液为流动相，zorbaxsb-c18(21.2mm×250mm,5µm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为342nm，每次进样0.5ml，收集31.8min的色谱峰，多次累加后蒸干可得化合物粗品；所得产物再次用甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用sephadexlh-20凝胶柱层析分离，得该化合物纯品。
取实施例1制备的化合物，经ms、hrms、1hnmr、1h和13cnmr、hmbc及dept进行结构鉴定，得到本化合物的图谱，波谱数据如下：uv(meoh)λmax(logε)：210(4.25)、235(3.64)和342nm；ir(kbr)νmax3276、2928、1682、1665、1650、1615、1536、1434、1146、895、764；1h和13cnmrdata(c5d5n,500和125mhz),见表1。正离子模式esimsm/z306[m na] ；正离子模式hresimsm/z306.1112[m na] (计算值306.1106，c17h17nnao3).1h-nmr，13c-nmr波谱数据图分别如图2，3所示，1hnmr和13cnmr数据如表1所示：
表1实施例1制备的化合物的1hnmr和13cnmr数据(cdcl3)
结构解析过程如下：红外光谱(溴化钾压片)显示该化合物中有胺基(3276cm-1)、羰基(1682、1665和1650cm-1)、芳香环(1615、1536和1434cm-1)特征官能团；高分辨质谱(hresims)给出准分子离子峰306.1112[m na] ，可确定化合物的分子式为c17h17no3，不饱和度为10。结合1h和13c与hsqcnmr数据，显示该化合物包括一个1,2,4,5-四取代的苯环(c-5~c-8,c-4a和c-8a，h-5和h-8)，一个3-甲基-2-氧代丁基-3-烯基结构片段(c-4'~8'、h2-4'、h2-7'和h3-8')，一个乙酰基(c-1',c-2',和h3-2')，一个-nh-co-ch-c-基团(c-2~4,h-1,h-3和nh)。为了满足化合物的10个不饱和度，除三个羰基、一个双键、苯环外，化合物中还应该有一个苯环和-nh-co-ch-c-基团形成的六元环喹啉-2(1h)-酮结构。该推断可进一步由h-3与c-2、c-4、c-4a，nh与c-2、c-3、c-8、c-4a、c-8a，h-8与c-4a、c-8a,h-5与c-4、c-4a、c-8a的hmbc相关得到证实。
化合物的母体骨架确定后，剩余的取代基位置可通过进一步分析其hmbc相关确定。根据h-2'与c-4，h-3与c-1'的hmbc相关，可确定乙酰基取代在c-4位；根据h-4'与c-6、c-7、c-8，h-8与c-4'的hmbc相关，可确定3-甲基-2-氧代丁基-3-烯基取代在c-7位。最后，根据h3-3'与c-5、c-6、c-7的hmbc相关，可确定甲基(c-3')取代在c-6位。至此，本发明化合物的结构得到确认，其结构鉴定为：4-乙酰基-6-甲基-7-(3-甲基-2-氧代丁基-3-烯基)-喹啉-2(1h)-酮。
实施例2
本实施例川滇唐松草采集于云南丽江，将4kg川滇唐松草粉碎至样品粉碎到30目，以95%的乙醇水溶液提取4次，每次提取48h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏235g。浸膏用重量比2.0倍量的甲醇溶解后用250g的80目粗硅胶拌样，1.2kg的200目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-水溶液梯度洗脱，tlc监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为9:1的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以68％的甲醇为流动相，zorbaxsb-c18(21.2mm×250mm,5µm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为342nm，每次进样0.8ml，收集31.8min的色谱峰，多次累加后蒸干可得化合物粗品；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用sephadexlh-20凝胶柱层析分离，得该化合物纯品。
本实施例得到的化合物结构鉴定同实施例1，确认本实施例制备的化合物为所述的喹啉生物碱类化合物——4-乙酰基-6-甲基-7-(3-甲基-2-氧代丁基-3-烯基)-喹啉-2(1h)-酮。
实施例3
川滇唐松草采集于云南丽江，将5kg川滇唐松草粉碎至40目，以75%的丙酮水溶液用超声提取3次，每次提取72h，提取液合并，过滤，减压浓缩成浸膏，得浸膏385g。浸膏用重量比1.6倍量的甲醇溶解后用450g的90目粗硅胶拌样，2.4kg的180目硅胶装柱进行硅胶柱层析，用体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，tlc监测合并相同的部分，得到8个部分，其中体积配比为9:1的氯仿-丙酮洗脱部分用安捷仑1100半制备高效液相色谱分离，以68％的甲醇水溶液为流动相，zorbaxsb-c18(21.2mm×250mm,5µm)制备柱为固定相，流速为20ml/min，紫外检测器检测波长为342nm，每次进样0.6ml，收集31.8min的色谱峰，多次累加后蒸干；所得产物再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用sephadexlh-20凝胶柱层析分离，得到棕色胶状物，即得该化合物纯品。
本实施例得到的化合物结构鉴定同实施例1，确认本实施例制备的化合物为所述的喹啉生物碱类化合物——4-乙酰基-6-甲基-7-(3-甲基-2-氧代丁基-3-烯基)-喹啉-2(1h)-酮。
实施例4抗烟草花叶病活性试验
取实施例1制备的任喹啉生物碱类化合物进行抗烟草花叶病毒活性试验。
试验方法：采用半叶法，在药剂的质量浓度均为50mg/l时对本发明化合物进行抗烟草花叶病毒活性测定。在5～6龄烤烟的植株上，选取适用于测试的叶片(叶行正常，无病无虫)，先将叶片均匀撒上细金刚砂，用毛笔将备用的烟草花叶病毒源(3.0×10-3)均匀抹在撒有金刚砂的叶片上，待所有中选的叶片接毒结束后，立即放在盛有药液的培养皿中处理20min，取出，擦去叶片上水珠和药液，将两个半叶复原排放在铺有卫生纸保湿的玻璃缸中，并盖上玻璃盖，控温(23±2)℃，放在温室自然光照射，2～3d即可见枯斑．每个处理都设另一半叶为对照，另外设有1组为商品宁南霉素的处理作为对比，按下式计算相对抑制率：
xi％=(ck-t)／ck×100％
其中，x：相对抑制率(％)，ck：浸泡于清水中半片接毒叶的枯斑数(个)，t浸泡于药液中半片接毒叶的枯斑数(个)。
结果：经计算，本化合物的相对抑制率为52.5%，超过对照宁南霉素的相对抑制率33.8%，说明化合物有很好的抗烟草花叶病毒活性。
1.一种喹啉生物碱类化合物，其结构式如式（i）所示：
2.制备权利要求1所述化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）以川滇唐松草全株为原料，用第一溶剂进行提取，浓缩成浸膏；
（2）将浸膏用第二溶剂溶解后进行硅胶柱层析，用氯仿-丙酮溶液进行梯度洗脱，收集氯仿-丙酮溶液体积比为9:1的洗脱液；
（3）将洗脱液用高压液相色谱分离纯化得式（i）所示化合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，将原料浸泡于第一溶剂中24h～72h后进行提取，第一溶剂与原料的重量比为2～4:1，提取次数为3～5次。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，第一溶剂为80～100%的甲醇水溶液或80～100%的乙醇水溶液或60～90%的丙酮水溶液。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，浸膏用重量比2～4倍量的160～300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，梯度洗脱的氯仿-丙酮溶液体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，所述第二溶剂为甲醇或乙醇或丙酮。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，高压液相色谱分离纯化是采用21.2mm×250mm，5µm的c18色谱柱，流速为20ml/min，流动相为68%的甲醇，紫外检测器检测波长为342nm，每次进样0.5～1.0ml，收集31.8min的色谱峰，多次累加后蒸干。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤3得到的化合物可用纯甲醇溶解，再以甲醇为流动相，用凝胶柱层析分离，以进一步分离纯化，获得纯度更高的纯品。
10.权利要求1所述的化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中的应用。
技术总结