人源化抗N截短淀粉样β单克隆抗体的制作方法

人源化抗n截短淀粉样
β
单克隆抗体
技术领域
1.本发明涉及结合淀粉样肽的人源化抗体。


背景技术：

2.鼠抗淀粉样β(aβ)抗体nt4x
‑
167最初是针对aβ4
‑
40淀粉样肽产生的，据报道与n截短的淀粉样肽aβpe3
‑
42和aβ4
‑
42特异性结合，但不与淀粉样肽aβ1
‑
42结合(antonios et al acta neuropathol.commun.(2013)6 1 56)。使用nt4x
‑
167的被动免疫在阿尔茨海默病小鼠模型中显示出治疗上的益处(antonios et al scientific reports 5 17338；2015)。
3.nt4x
‑
167的人源化版本可用于临床应用，例如用于治疗阿尔茨海默病(ad)。


技术实现要素：

4.本发明人意外地发现，通过使重链和/或轻链可变结构域内的某些残基突变，可以改善人源化版本的nt4x
‑
167抗体的结合活性。例如，这可能在开发用于临床应用的候选分子中很有用。
5.本发明的第一方面提供了一种抗aβ抗体，所述抗aβ抗体包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中
6.a)重链可变结构域(vh结构域)包含在框架区具有四个或更少的额外改变如替换的seq id no:2，和
7.b)轻链可变结构域(vk结构域)包含任选地在框架区中具有多达四个或更少的额外改变如替换的seq id no:6。
8.抗aβ抗体可以特异性结合n末端截短的淀粉样肽(aβpe3
‑
x或aβ4
‑
x)。例如，抗aβ抗体可以特异性结合aβpe3
‑
38、aβpe3
‑
40、aβpe3
‑
14、aβpe3
‑
42、aβ4
‑
38、aβ4
‑
40、aβ4
‑
14和aβ4
‑
42中的一种或更多种，优选地全部。
9.抗
‑
aβ抗体可以不显示与全长淀粉样肽或没有n末端截短的淀粉样肽(aβ1
‑
x)如aβ1
‑
42、aβ1
‑
38、aβ1
‑
40或aβ1
‑
14的特异性结合。
10.优选地，抗aβ抗体的重链可变结构域(vh结构域)包含seq id no:3、seq id no:4、或seq id no:5。
11.优选地，抗aβ抗体的轻链可变结构域(vl结构域)包含seq id no:7、或seq id no:8。
12.本文所述的第二方面提供了一种药物组合物，其包含第一方面的抗体和药学上可接受的载体(carrier)。
13.本文所述的第三方面提供了一种核酸，其编码第一方面的抗体或其重链可变结构域和/或轻链可变结构域。
14.本文所述的第四方面提供了一种载体，其包含第三方面的核酸。
15.本文所述的第五方面提供了一种宿主细胞，其包含第三方面的核酸或第四方面的载体。
16.本文所述的第六方面提供了一种用于制备根据第一方面的抗体的方法，该方法包括在宿主细胞培养物中表达根据第四方面的载体以产生所述抗体；和从细胞培养物中回收抗体。
17.本文所述的第七方面提供了通过向需要治疗的个体施用有效量的根据第一方面的抗体或根据第二方面的药物组合物来治疗阿尔茨海默病的方法。
18.本文所述的第八方面提供了用于治疗人或动物体的方法中的根据第一方面的抗体或根据第二方面的药物组合物。
19.本文所述的第九方面提供了用于在个体中治疗阿尔茨海默病的方法中的根据第一方面的抗体或根据第二方面的药物组合物。
20.下面更详细描述了本文所述的这些和其他方面和实施方案。
附图说明
21.图1显示了鼠nt4x
‑
167抗体与淀粉样肽的结合。
22.图2显示了鼠和嵌合nt4x
‑
167抗体与psl淀粉样肽的结合。
23.图3显示了鼠、人源化和嵌合nt4x
‑
167与aβpe3
‑
42淀粉样肽的结合：初始版本。
24.图4显示了人源化变体与aβ1
‑
42的结合。
25.图5显示了人源化变体与aβpe3
‑
42的结合。
26.图6显示了第二轮人源化nt4x
‑
167抗体与aβpe3
‑
42肽的结合：hc至hr版本结合rka。
27.图7显示了通过elisa的第二轮人源化nt4x
‑
167抗体与aβpe3
‑
42肽的结合。
28.图8显示了第三轮人源化nt4x
‑
167抗体与aβpe3
‑
42肽的结合：hs至hy版本结合rka。
29.图9显示了第五轮人源化nt4x
‑
167抗体与aβpe3
‑
42肽的结合：rcnt4xs6a、rcnt4xs7a、rcnt4xs8a版本结合rka。
30.图10显示了与淀粉样肽aβpe3
‑
42结合的人源化rcnt4x_sa、ba、ta、ua、va、wa、ya抗体的热稳定性。
31.图11显示了人源化的rcnt4x_sa和rcnt4x_s7a抗体的热位移分析。
32.图12显示了非特异性蛋白质
‑
蛋白质相互作用(交叉相互作用色谱法)。
33.图13显示了人源化先导候选rcnt4xs7a的非特异性蛋白质
‑
蛋白质相互作用(交叉相互作用色谱法)。
34.图14显示了用于溶解度评估的纯化的抗体候选物。
35.图15显示了结合pslaβpe3
‑
42淀粉样肽的人源化rcnt4x_sa和rcnt4x_s7a抗体血清稳定性评估。
36.图16显示了结合anaspec aβ4
‑
42淀粉样肽的人源化rcnt4x_sa和rcnt4x_s7a抗体血清稳定性评估。
37.图17显示了通过人源化rcnt4x_sa和rcnt4x_s7a(来自4
‑
42淀粉样肽诱导的细胞死亡的抗体)体外提供给原代胚胎大鼠神经元的保护量。
38.图18显示了通过人源化rcnt4x_sa和rcnt4x_s7a(来自(aβglp3)3
‑
42淀粉样肽诱导的细胞死亡的抗体)体外提供给原代胚胎大鼠神经元的保护量。
39.图19显示了通过人源化rcnt4x_sa和rcnt4x_s7a(来自aβ1
‑
42淀粉样肽诱导的细胞死亡的抗体)体外提供给原代胚胎大鼠神经元的保护量。
40.图20显示了通过人源化rcnt4x_sa和rcnt4x_s7a(来自aβ4
‑
42淀粉样肽诱导的细胞死亡的抗体)体外提供给人cns.4u神经元的保护量。
41.图21显示了通过人源化rcnt4x_sa和rcnt4x_s7a(来自aβpe3
‑
42淀粉样肽诱导的细胞死亡的抗体)体外提供给人cns.4u神经元的保护量。
42.图22显示了通过人源化rcnt4x_sa和rcnt4x_s7a(来自aβ1
‑
42淀粉样肽诱导的细胞死亡的抗体)体外提供给人cns.4u神经元的保护量。
43.图23显示了两个rcnt4x抗体均可挽救6月龄tg4
‑
42小鼠的海马神经元的丢失。使用无偏性体视学量化ca1中的神经元。使用rcnt4x_sa和rcnt4x_s7a被动免疫后，六月龄tg4
‑
42小鼠海马中的神经元数量。用rcnt4x抗体免疫的tg4
‑
42小鼠比同龄igg1注射的小鼠显示出显著更多的神经元。单因素方差分析(anova)，然后进行bonferroni多重比较；n＝5
‑
6。*p<0.05；***p<0.001；数据表示为平均值
±
s.e.m。
44.图24显示了rcnt4x_s7a在挽救tg4
‑
42中神经元丢失方面具有最高的效力。来自原始nt4x与rcnt4x_sa和rcnt4x_s7a的数据比较。nt4x和rcnt4x_s7a之间的t检验。n＝5
‑
7。*p<0.05；数据表示为平均值
±
s.e.m。
45.图25显示了与igg2b和pbs对照组相比，mrct对照igg1抗体之间没有显著差异。igg2ba和pbs组的数据来自antonios et al.[6]。t检验和anova均未显示出显著差异。数据表示为平均值
±
s.e.m。n＝5
‑
7。
[0046]
图26显示了用rcnt4x_s7a被动免疫挽救tg4
‑
42小鼠的学习缺陷。每周接受抗体和igg1对照抗体(mrct对照)注射的tg4
‑
42小鼠，持续12周的时间。在morris水迷宫中测试6月龄小鼠。在mrct对照抗体处理的tg4
‑
42小鼠中，空间参考记忆受到损害，因为它们在探索试验中未显示对靶标象限的偏爱。相反，用rcnt4x_s7a抗体免疫的tg4
‑
42小鼠显示没有学习缺陷。***p<0.001；**p<0.01；*p<0.05。每组n＝8。单因素方差分析(anova)，然后进行bonferroni多重比较。t靶标象限，l左象限，r右象限，o相反象限。数据表示为平均值
±
s.e.m；m＝月数。
[0047]
图27显示了在经免疫的5xfad小鼠中降低的皮层斑块负荷。与igg1注射的5xfad小鼠相比，rcnt4x_sa和rcnt4x_s7a免疫的5xfad小鼠的斑块负荷分析。(a)用抗pan
‑
aβ抗体的免疫染色显示在rcnt4x_s7a免疫后斑块负荷的降低，但在rcnt4x_sa免疫组中没有。(b)通过硫黄素s染色证实，两个rcnt4x处理组均显示出显著减少的原纤维aβ沉积。(c)用抗aβ1
‑
x抗体的免疫染色显示在rcnt4x_s7a免疫后斑块负荷的降低，但在rcnt4x_sa免疫组中没有。(d)用抗焦谷氨酸aβ3
‑
x抗体的免疫染色显示两种rcnt4x抗体的降低的斑块负荷，然而这仅对rcnt4x_s7a抗体有意义，而对rcnt4x_sa抗体则具有趋势(e)用抗aβ4
‑
x抗体的免疫染色显示两种rcnt4x抗体的降低的斑块负荷。单因素方差分析(anova)，然后相对于对照组进行dunnett多重比较检验；n＝7
‑
11；***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05数据表示为平均值
±
s.e.m。
具体实施方式
[0048]
本发明涉及以下发现：通过可变结构域内某些残基的突变，鼠抗淀粉样蛋白(aβ)
抗体nt4x
‑
167的人源化版本的结合活性显著改善。
[0049]
本文所述的抗aβ抗体可包含重链可变(vh)结构域和轻链可变(vl)结构域。重链可变结构域可包含在框架区中具有四个或更少的额外氨基酸突变如替换、缺失或插入的seq id no:2。
[0050]
抗体可以特异性结合n末端截短的淀粉样肽，例如焦谷氨酸(pe)修饰的淀粉样肽(也称为aβpe3
‑
x、aβpglu3
‑
x、aβ(glp3)3
‑
x和p3
‑
x)，例如aβpe3
‑
38、aβpe3
‑
40、aβpe3
‑
14和aβpe3
‑
42，以及非焦谷氨酸修饰的淀粉样肽，例如aβ4
‑
38、aβ4
‑
40，aβ4
‑
14和aβ4
‑
40。结合可以例如使用以下所述的标准技术，例如elisa或表面等离体共振，使用igg1形式的本文所述的抗aβ抗体来确定。
[0051]
vh可包含seq id no:2；或相对于seq id no:2在框架区中独立地具有1个或更多个，例如2个、3个或4个或更多其他氨基酸改变或突变(例如单个氨基酸替换、缺失或插入)，优选为替换的seq id no:2的氨基酸序列。框架区中的其他氨基酸改变或突变可以在seq id no:2的27f、29l、63r和70v以外的残基处，优选在seq id no:2的27f、29l、63r、70v、52bx1、52cx6、53x2、54x3、55x4和56x5以外的残基处。
[0052]
vl结构域可以具有seq id no:6；或相对于seq id no:6在框架区中独立地具有1个或更多个，例如2个、3个或4个或更多氨基酸改变或突变(例如单个氨基酸替换、缺失或插入)，优选为替换的seq id no:6的氨基酸序列。框架区中的其他氨基酸改变或突变可以在seq id no:6的92x7以外的残基处。
[0053]
替换可以是保守替换。例如，本文所述的抗aβ抗体可包含任选地在框架区中具有1、2、3或4个氨基酸替换的seq id no:3、4或5的vh结构域。本文所述的抗aβ抗体可包含任选地在框架区中具有1、2、3或4个氨基酸替换的seq id no:7或8的vl结构域。
[0054]
合适的抗aβ抗体可包含(i)seq id no:3的vh结构域和seq id no:7的vl结构域，(ii)seq id no:4的vh结构域和seq id no:7的vl结构域，(iii)seq id no:5的vh结构域和seq id no:7的vl结构域，(iv)seq id no:3的vh结构域和seq id no:8的vl结构域，(v)seq id no:4的vh结构域和seq id no:8的vl结构域，和/或(vi)seq id no:5的vh结构域和seq id no:8的vl结构域。一些优选的抗aβ抗体可以包含seq id no:5的vh结构域和seq id no:8的vl结构域。
[0055]
术语“免疫球蛋白”和“抗体”可以互换使用，是指包含具有特异性结合一种或更多种抗原的能力的抗体抗原结合位点的任何蛋白质。
[0056]“抗原”是免疫球蛋白或抗体(或其抗原结合片段)特异性结合的实体(例如，蛋白质实体或肽)。本文所述的抗aβ抗体的抗原可包括n
‑
截短的淀粉样肽aβpe3
‑
42和aβ4
‑
42。
[0057]
天然抗体通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(l)链和两条相同的重(h)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，在不同抗体同种型的重链之间具有不同数目的二硫键。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫化物桥。
[0058]
抗体包含重链或轻链多肽的球形区域，称为“结构域”。结构域可包含肽环，通常为3至4个环，这些环可例如通过β折叠片和/或链内二硫键来稳定。基于在“恒定”结构域的情况下各个类别成员的结构域内相对缺乏的序列变异，或在“可变”结构域的情况下在各个类别成员的结构域内的显著变异，结构域通常称为“恒定的”或“可变的”。抗体或多肽“结构域”在本领域中通常可互换地称为抗体或多肽“区域”。
[0059]
抗体轻链的“恒定”结构域可以称为“轻链恒定区”、“轻链恒定结构域”、“cl”区域或“cl”结构域。抗体重链的“恒定”结构域可以称为“重链恒定区”、“重链恒定结构域”、“ch”区域或“ch”结构域。轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐。
[0060]
包含抗体的尾部区域的重链的恒定结构域在本文中称为fc(可结晶片段)结构域或fc区域。fc区可与细胞表面fc受体和补体系统的一些蛋白质相互作用，通过该方法，抗体可激活免疫系统。fc区在每个多肽链中包含三个重链恒定结构域。
[0061]
抗体轻链的“可变”结构域可以称为“轻链可变区”、“轻链可变结构域”、“vl”区域或“vl”结构域(此处的“l”是指“轻”而不是轻链同种型“λ”)。抗体重链的“可变”结构域可以称为“重链可变区”、“重链可变结构域”、“vh”区域或“vh”结构域。完整的轻链具有例如，两个结构域(vl和cl)，且完整的重链具有例如，四个或五个结构域(vh、ch1、ch2和ch3)。
[0062]
轻链和重链可变结构域包括“高变区”(hvr或hv)，也称为“互补决定区”(cdr)，它们在序列上是高变的，并可能形成结构确定的环。通常，抗体包含六个高变区；重链中的三个(h1、h2、h3)和轻链中的三个(l1、l2、l3)散布在相对保守的框架区(fr)之间。在本文所述的抗体中，可变结构域的氨基酸序列如下所示。可以使用标准技术轻松鉴定这些序列中的cdr(参见例如kabat,e.a.,wu,t.t.,perry,h.m.,gottesmann,k.s&foeller,c.(1991).sequences of proteins of immunological interest,5th edit.,nih publication no.91
‑
3242.u.s.department of health and human services)。在kabat命名法中，vhcdr1位于位置31
‑
35，vhcdr2位于位置50
‑
65，vhcdr3位于位置95
‑
102，vlcdr1位于位置24
‑
34，vlcdr2位于位置50
‑
56，且vlcdr3位于位置89
‑
97。
[0063]
每个轻/重链对的可变区形成抗原结合位点。术语“抗原结合位点”是指与抗原特异性结合(免疫反应)的位点。本文所述的抗体包含至少一个抗原结合位点，优选包含两个抗原结合位点。抗原结合位点由重链和轻链cdr形成，并由框架区对齐，从而能够与特定表位结合。“抗原结合区”或“抗原结合结构域”是包括抗体结合位点的抗体区域或结构域。本文所述的抗体具有至少一个识别淀粉样肽aβpe3
‑
42和aβ4
‑
42的抗原结合位点。
[0064]
天然存在的抗体链或重组产生的抗体链可以用前导序列表达，该前导序列在细胞加工过程中被去除以产生成熟链。成熟链也可以重组产生，其包含非天然存在的前导序列，例如以增强分泌或改变特定目的链的加工。
[0065]
抗体的重链和轻链的恒定区可能显示表型变异。基于轻链恒定区的氨基酸序列，抗体轻链分类为kappa(κ)或lambda(λ)，长度为约230个残基。本文所述的抗体包含κ轻链(κ轻链的可变结构域在本文中称为vk)。
[0066]
来自人类和高等哺乳动物的重链分类为gamma(γ)、mu(μ)、alpha(α)、delta(δ)或epsilon(ε)，长度为约450
‑
600个残基，并定义了抗体的同种型分别为igg、igm、iga、igd和ige。有两个亚类的igm(h和l)，三个亚类的iga(iga1、iga2和分泌型iga)和四个亚类的igg(igg1、igg2、igg3和igg4)。本文所述的抗体优选是免疫球蛋白g(igg)抗体。本文所述的抗体更优选为具有最小效应子功能的igg4抗体或igg1抗体。
[0067]
本文所述的抗体可以包含属于本文所述的任何免疫球蛋白同种型的重链。本文所述的抗体可包含来自多于一种类型或同种型的序列。
[0068]
本文所述的抗aβ抗体可表现出细胞毒活性。在这种抗体中，恒定结构域通常是补体固定恒定结构域，类别通常是igg1。人同种型igg1和igg4是示例性的。
[0069]
本文所述的抗体可包含完整抗体的片段。术语“片段”是指抗体或抗体链的一部分或部分，其包含比完整或完全抗体或抗体链少的氨基酸残基，其中该部分优选地保留至少一种，优选地大部分或全部的当存在于完整抗体中时通常与该部分相关的功能。片段可以通过完整或完全抗体或抗体链的化学或酶处理获得。片段也可以通过重组手段获得。
[0070]
本文所述抗体的片段可以结合抗原或与完整抗体(即，与它们从其衍生的完整抗体)竞争用于抗原结合(即，特异性结合)。本文所述的抗体结合淀粉样肽aβpe3
‑
42和aβ4
‑
42。结合片段通过重组dna技术或完整免疫球蛋白的酶促或化学切割产生。
[0071]
本文所述的抗体可以结合片段的形式存在，包括但不限于fab、fab'、f(ab')2、化学连接的f(ab')2、单特异性fab2、双特异性fab2、三特异性fab2、单价igg、scfv(单链可变片段)、di
‑
scfv(二价scfv)、双特异性双链抗体、三特异性三链抗体、scfv
‑
fc、微抗体或sdab(单域抗体)，并保留结合淀粉样肽aβpe3
‑
42和aβ4
‑
42的能力。
[0072]
本文所述的抗体可以是双特异性或三特异性抗体的一部分。双特异性抗体是具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的抗原结合位点的人工杂交抗体；三特异性抗体是具有三个不同的重链/轻链对和三个不同的抗原结合位点的人工杂交抗体。双特异性抗体和三特异性抗体可以通过多种方法产生，包括杂交瘤的融合或fab’片段的连接。参见例如，songsivilai&lachmann,clin.exp.immunol.79:315
‑
321(1990)；kostelny et al.,j.immunol.148,1547
‑
1553(1992)。本文所述的示例性抗体可以是包含至少两个不同抗原结合位点的双特异性抗体。
[0073]
特异性结合是指其中抗体未显示与抗原上的其特异性表位以外的分子的任何显著结合的情况。该术语也适用于例如抗原结合结构域对由许多抗原携带的特定表位具有特异性的情况，在这种情况下，携带抗原结合结构域的抗体将能够与携带表位的各种抗原结合。
[0074]
本文所述的抗aβ抗体或编码此类抗体的核酸将处于分离状态。抗体和核酸将不含或基本上不含与它们天然结合的物质，例如在其天然环境中或其中在制备(当这种制备通过体外或体内实践的重组dna技术进行时)它们的环境(例如细胞培养物)中发现的其他多肽或核酸。抗体和核酸可以与稀释剂或佐剂一起配制，但仍出于实用目的进行分离，例如，如果用于包被用于免疫测定的微量滴定板，则通常将抗体与明胶或其他运载体混合，或当用于诊断或治疗时与药学上可接受的载体或稀释剂混合。
[0075]
本发明的另一方面提供了如本文所公开的编码抗体或其轻链、重链、vh结构域或vl结构域的核酸。如上所述，核酸可以例如，编码包含seq id no:2，例如seq id no:3、seq id no:4、或seq id no:5的重链可变结构域(vh结构域)和/或包含seq id no:6，例如seq id no:7、或seq id no:8的轻链可变结构域(vk结构域)。任选地，编码的vh结构域和/或vl结构域在框架区中可以具有多达四个额外的氨基酸突变。
[0076]
核酸可以包括dna和rna序列，其中胸腺嘧啶核碱基被尿嘧啶替换。
[0077]
本文所述的抗体可以通过重组表达产生。如上所述的编码任选与恒定区连接的轻链和重链可变区的核酸可以插入到表达载体中。包含编码本文所述的抗体的核酸的载体本身是本发明的一个方面。轻链和重链可以克隆在相同或不同的表达载体中。编码本文所述的抗体链的核酸可以可操作地连接至确保抗体链表达的一个或多个表达载体中的一个或更多个控制序列。表达控制序列包括但不限于启动子(例如，天然相关或异源启动子)、信号
序列、增强子元件和转录终止序列。优选地，表达控制序列是能够转化或转染真核宿主细胞(例如cos、cho或expi293细胞)的载体中的真核启动子系统。可以将这类载体掺入合适的宿主中，从而将该宿主维持在适合于核苷酸序列的高水平表达以及抗体的收集和纯化的条件下。
[0078]
本发明的方面提供了编码本文所述的抗体的核酸；载体，优选为表达载体，其包含编码本文所述的抗体的一种或更多种核酸；和载体，其包含与启动子可操作地连接的一种或更多种编码本文所述的抗体的核酸。示例性表达载体是phuk和phug1，其与本文公开的核酸组合，包含编码本文所述的抗体的核苷酸序列。也可以使用提供编码抗体轻链和重链恒定区的核苷酸序列的其他载体。
[0079]
如本文所述使用的表达载体通常可作为附加体或作为宿主染色体dna的组成部分在宿主生物体中复制。通常，表达载体包含选择标记(例如，氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性、卡那霉素抗性或新霉素抗性)，以允许检测用期望的dna序列转化的那些细胞(参见例如，itakura et al.us4704362)。
[0080]
可以用表达载体转化宿主细胞，并在适合用于诱导启动子、选择转化子和/或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中培养。作为本发明的一个方面，提供了包含上述核酸或载体的宿主细胞。
[0081]
本发明的另一方面提供了制备本文所述的抗体的方法，该方法包括在宿主细胞培养物中表达本文所述的载体以产生所述抗体，并从细胞培养物中回收抗体。该方法可以包括将包含如上所述的一种或更多种编码抗体或抗体链的核酸的载体转移到本文所述的宿主细胞中，在允许一种或更多种核酸表达的条件下生长宿主细胞培养物，和回收表达的抗体。可以采用本领域已知的任何合适的方法。
[0082]
适用于克隆和表达本文所述的核酸和载体的微生物宿主生物体包括原核宿主；大肠杆菌(escherichia coli)、杆菌如枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)和其他肠杆菌科如沙门氏菌(salmonella)、沙雷氏菌(serratia)和各种假单胞菌属(pseudomonas species)。在这些原核宿主中，也可以制备表达载体，其通常包含与宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制起点)。另外，将存在许多各种众所周知的启动子，例如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β
‑
内酰胺酶启动子系统或噬菌体λ的启动子系统。启动子通常将任选地用操纵子序列控制表达，并具有核糖体结合位点序列等，以启动并完成转录和翻译。用于原核细胞的载体也可能需要复制起点组分。
[0083]
其他微生物，例如酵母，也可以用于表达本文所述的核酸或载体。酵母菌(saccharomyces)是优选的酵母宿主，具有合适的载体，所述载体具有表达控制序列(例如启动子)、复制起点、终止序列和所需的类似序列。典型的启动子包括3
‑
磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。可诱导的酵母启动子尤其包括乙醇脱氢酶、异细胞色素c和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。
[0084]
除微生物外，哺乳动物组织细胞培养物也可用于表达本文所述的核酸或载体并产生抗体多肽(例如，编码抗体或其片段的多核苷酸(参见例如，winnacker,from genes to clones,vch publishers,n.y.1987)。包含本文所述的核酸或载体的真核或哺乳动物细胞宿主本身是本发明的一方面。真核细胞实际上是优选的，因为本领域已经开发了许多能够分泌异源蛋白(例如完整抗体)的合适宿主细胞系，包括cho细胞系、各种cos细胞系、hela细
胞、expi293细胞、expicho细胞、骨髓瘤细胞系或转化的b细胞或杂交瘤。细胞可以是人细胞或非人细胞，例如，非人哺乳动物细胞。在一些优选的实施方案中，细胞是expi293人细胞。本文所述的抗体可以在工程化以产生岩藻糖基化蛋白的细胞系中产生，例如chok1sv细胞系(biowa/lonza)、工程化细胞(probiogen)或鸭胚胎干细胞系eb66(valneva)。哺乳动物细胞的表达载体通常包括但不限于以下一种或更多种：信号序列、一种或更多种标记基因、增强子元件、启动子和必要的加工信息位点，例如核糖体结合位点、rna剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。优选的表达控制序列是衍生自免疫球蛋白基因、sv40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等的启动子(参见例如co et al.,j.immunol.148:1149 1992)。
[0085]
用于真核宿主细胞的本文所述的载体还可以编码在成熟抗体链或多肽的n末端具有特定切割位点的信号序列或其他多肽。合适的信号序列可以是异源的，并且可以被宿主细胞识别和加工(即，被信号肽酶切割)。在哺乳动物细胞表达中，可获得哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gd信号。
[0086]
或者，可以将本文所述的抗体编码序列掺入转基因中，以引入转基因动物的基因组中，并随后在转基因动物的乳汁中表达(参见，例如，deboer et al.,us5741957,rosen,us5304489,和meade et al.,us5849992)。合适的转基因包括与来自乳腺特异性基因例如酪蛋白或β乳球蛋白的启动子和增强子可操作连接的轻链和/或重链的编码序列。
[0087]
包含目的多核苷酸序列(例如，重链和轻链编码序列和表达控制序列)的本文所述的载体可以通过众所周知的方法转移到宿主细胞中，所述方法根据细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理、电穿孔、脂质转染、基因枪或基于病毒的转染可用于其他细胞宿主。(通常参见green and sambrook,molecular cloning:a laboratory manual(cold spring harbor press,4th ed.,2012)。用于转化哺乳动物细胞的其他方法包括使用聚丙烯、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射(通常参见sambrook et al.,同上)。为了生产转基因动物，可以将转基因显微注射到受精卵母细胞中，或者可以将其掺入胚胎干细胞的基因组中，并将这种细胞的核转移到去核卵母细胞中。
[0088]
当重链和轻链克隆在单独的表达载体上时，将载体共转染以获得本文所述的完整抗体的表达和装配。一旦表达，即可根据本领域标准程序纯化本文所述的完整抗体、其二聚体、单个轻链和重链或其他免疫球蛋白形式，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、hplc纯化、凝胶电泳等(通常参见，scopes,protein purification(springer
‑
verlag,n.y.,(1982))。对于本文所述的药物用途，优选的是至少约90至95％同质性的基本上纯的抗体，且最优选的是98至99％或更高同质性的基本上纯的抗体。可以采用本领域已知的标准蛋白质纯化方法。以下程序是合适的蛋白质纯化程序的示例：在免疫亲和柱或离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反相hplc、在硅胶上或在阳离子交换树脂(例如deae)上层析、层析聚焦，sds
‑
page、硫酸铵沉淀和凝胶过滤。
[0089]
可以通过包括本文所述的技术以及本领域已知的其他技术的任何合适的技术来进行本文所述的抗体的产生。本文所述的抗体可以使用本领域中公认的用于大规模生产抗体的方法以商业规模生产。例如，可以采用重组表达系统，例如本文所述的那些。
[0090]
本文所述的抗体可以特异性结合淀粉样肽aβpe3
‑
42和aβ4
‑
42。抗体可能没有显示出与淀粉样肽aβ1
‑
42的特异性结合或基本上没有特异性结合。本文所述的抗体还可以显示
出以下所述并参考实施例描述的期望的结构、物理、生物物理和化学性质。
[0091]
本文所述的抗体的亲和力是抗体与表位或抗原结合的程度或强度。解离常数k
d
和亲和常数k
a
是亲和力的定量度量。k
d
是抗体解离速率(k
off
)(其从抗原解离的速度)与抗体的抗体缔合速率(k
on
)(其与抗原结合的速度)之比。抗体与其抗原的结合是可逆的过程，结合反应的速率与反应物的浓度成正比。在平衡时，[抗体][抗原]复合物形成的速率等于解离成其组分[抗体] [抗原]的速率。反应速率常数的测量可用于定义平衡或亲和常数k
a
(k
a
＝1/k
d
)。k
d
值越小，抗体对其靶标的亲和力越大。大多数抗体的k
d
值都在低微摩尔(10
‑6)至纳摩尔(10
‑7至10
‑9)的范围内。通常认为高亲和力抗体在低纳摩尔范围(10
‑9)内，而非常高亲和力抗体在皮摩尔(10
‑
12
)范围内。
[0092]
本文所述的抗体可具有至少2
×
102m
‑1s
‑1、至少5
×
102m
‑1s
‑1、至少103m
‑1s
‑1或至少5
×
103m
‑1s
‑1的缔合速率常数(k
on
)。
[0093]
本文所述的抗体可具有小于5
×
10
‑1s
‑1、小于10
‑1s
‑1、小于5
×
10
‑2s
‑1、小于10
‑2s
‑1、或小于5
×
10
‑3s
‑1的抗体解离(k
off
)速率。
[0094]
在一些实施方案中，本文所述的抗体以至少102m
‑1、至少5
×
102m
‑1、至少103m
‑1、至少5
×
103m
‑1、至少104m
‑1、至少5
×
104m
‑1、至少105m
‑1、至少5
×
105m
‑1、至少106m
‑1、至少5
×
106m
‑1、或至少107m
‑
11
的亲和常数或k
a
结合(例如，特异性结合)至淀粉样肽aβpe3
‑
42和aβ4
‑
42。
[0095]
本文所述的抗体与淀粉样肽aβpe3
‑
42和aβ4
‑
42的解离常数或k
d
可以小于5
×
10
‑2m、小于10
‑2m、小于5
×
10
‑3m、小于10
‑3m、小于5
×
10
‑4m、小于10
‑4m、小于5
×
10
‑5m、小于10
‑5m、小于5
×
10
‑6m、小于10
‑6m或小于5
×
10
‑7m，
[0096]
抗体的特异性结合是指抗体对特定抗原或表位表现出明显的亲和力，并且通常不表现出明显的交叉反应性。“不表现出明显的交叉反应性”的抗体是不会明显结合不期望的实体(例如，不期望的蛋白质实体)的抗体。对特定表位具有特异性的抗体，例如，不会与同一蛋白质或肽上的远端表位发生明显的交叉反应。本文所述抗体的特异性结合，即k
off
、k
on
、k
a
和k
d
，可以根据用于确定这种结合的任何本领域公认的手段来确定。
[0097]
抗体可以鼠nt4x
‑
167抗体对淀粉样肽aβ4
‑
42或aβpe3
‑
42的结合亲和力的至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％，至少90％或至少95％的结合亲和力结合淀粉样肽aβ4
‑
42或aβpe3
‑
42，如通过elisa测量的。合适的elisa技术是本领域众所周知的。例如，可以使固定化的淀粉样肽以igg1形式与抗体接触，并在0.1％非离子型洗涤剂(如聚山梨醇酯20(吐温20))中洗涤一次或更多次，以去除未结合的抗体。然后可以使用任何方便的技术来检测与固定的肽结合的抗体，例如，使用与可检测的标记物如hrp结合的二抗。
[0098]
本文所述的抗体可以是热稳定的，即本文所述的抗体可以在30℃至85℃，特别是高达75℃的温度下结合淀粉样肽aβpe3
‑
42和aβ4
‑
42)。本文所述的抗体的解链温度可为50℃至100℃，具体地60℃至80℃，更具体地在66
‑
67℃附近。
[0099]
本文所述的抗体可能具有低的聚集倾向。可以使用诸如多角度光散射或动态光散射的标准技术来分析聚集倾向。本文所述的抗体可具有对于非特异性蛋白质
‑
蛋白质相互作用的较低倾向，和良好溶解度。
[0100]
当浓缩时，本文所述的抗体可能具有低的聚集倾向。本文所述的制剂可包含浓缩至50
‑
200mg/ml，例如75
‑
150mg/ml，优选80
‑
120mg/ml且更优选90
‑
110mg/ml的抗体，优选浓
度为约100mg/ml，而不会在维持在生理ph的水溶液中形成可溶性聚集体，例如通过dulbecco’s pbs。
[0101]
当本文所述的抗体经受反复冻融或高于正常体温的延长的温度时，可能具有低的聚集倾向。例如，延长的温度为在dulbecco’s pbs中在50℃下持续30天。
[0102]
本文所述的抗体的等电点(pi)可为ph 8.6至ph 9，优选ph 8.1至ph 8.7。
[0103]
在37℃下在小鼠、人和/或食蟹灵长类动物的血清中孵育后，本文所述的抗体可以保留与淀粉样肽aβpe3
‑
42和aβ4
‑
42的结合能力。例如，在小鼠、人和/或食蟹猴血清中孵育10至50天，优选20
‑
40天，更优选30天后，本文所述的抗体可以保留与aβpe3
‑
42或aβ4
‑
42的结合能力。保留结合能力的抗体在37℃下可以显示与未在血清中孵育或在对照溶液中孵育的抗体观察到的相同或基本相同的结合能力。
[0104]
本文公开的抗aβ抗体可以是无糖基化的。igg抗体的fc区具有高度保守的n
‑
糖基化位点，fc片段的糖基化对于fc受体介导的活性至关重要。附着于该位点的n
‑
糖基碳水化合物部分主要是复杂类型的岩藻糖基化双触角结构。另外，少量的这些n
‑
聚糖还带有二等分的glcnac和α
‑
2,6连接的唾液酸残基。由于例如化学或酶促过程、一个或更多个糖基化位点的缺失或突变或在细菌中的表达，无糖基化抗体可缺少一个或更多个碳水化合物部分。
[0105]
可以修饰本文所述的抗aβ抗体以增强其抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)。adcc是细胞介导的反应，其中非特异性细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(nk)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞裂解。这样的细胞可以是人细胞。通常认为抗体的adcc活性需要抗体的fc区与存在于效应细胞，例如杀伤细胞、天然杀伤细胞和活化的巨噬细胞表面上的抗体受体的结合。通过改变人源化抗体的碳水化合物结构的岩藻糖基化(例如，减少或消除)(即，在fc区中)，相对于未修饰的人源化抗体，可以在体外将抗体的adcc活性提高例如，10倍或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或100倍、或500倍、或600倍、或700倍或1000倍。由于增加的adcc活性，此类修饰的抗体可以比其未修饰的对应物更低的剂量使用，并且通常在患者中具有较少或降低的副作用。
[0106]
如本文所述的抗aβ抗体可以用于补体依赖性细胞毒性(cdc)。cdc涉及中枢先天补体系统，其充当适应性免疫的效应器。经典的cdc途径由结合至靶细胞上的抗原的抗体分子触发，并由c1q蛋白与结合抗体的fc结构域结合而引发。所得的补体级联激活膜攻击途径，导致形成诱导靶细胞裂解的膜攻击复合物。可以通过本领域已知的任何方法，对本文所述的抗体进行修饰，以增强其触发cdc的能力，例如但不限于，工程化蛋白质骨架以在抗体重链的恒定结构域中包含氨基酸残基替换。有关用于增强cdc活性的igg1氨基酸替换的组合的示例，参见moore et al.,mabs,2(2),181
‑
189(2010)。相对于未修饰的人源化抗体，如本文所述的经修饰的抗体的cdc活性可以提高例如，10倍、或20倍、或30倍、或40倍、或50倍、或100倍、或500倍、或600倍、或700倍或1000倍。
[0107]
抗aβ抗体可以通过化学修饰，例如通过peg化或通过掺入脂质体而进一步修饰，以例如通过增加体内半衰期来改善其药物特性。
[0108]
本文所述的抗aβ抗体可以配制成和/或作为药物组合物施用，所述药物组合物包含活性治疗性抗体试剂和多种其他药学上可接受的组分，请参见remington:the science and practice of pharmacy(22nd ed.,pharmaceutical press,london,pa.(2013))。优选的形式取决于预期的施用方式和治疗应用。取决于期望的制剂，组合物还可包含药学上可
接受的无毒载体或稀释剂，其被定义为通常用于配制用于动物或人施用的药物组合物的媒介物。选择稀释剂以不影响组合物的生物活性。这样的稀释剂的实例是蒸馏水、生理磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和汉克溶液。另外，药物组合物或制剂还可包含其他载体、佐剂或无毒、非治疗性、非免疫原性稳定剂等。
[0109]
包含本文所述的抗aβ抗体的药物组合物还可以包含大的缓慢代谢的大分子，例如蛋白质、多糖如壳聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物(例如乳胶官能化的sepharose
tm
、琼脂糖、纤维素等)、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚集体(例如油滴或脂质体)。另外，这些运载体可以用作免疫刺激剂(即佐剂)。
[0110]
对于肠胃外给药，本文所述的抗体或组合物可以该物质在生理可接受的稀释剂中的溶液或悬浮液的可注射剂量与药物载体一起施用，所述药物载体可以是无菌液体，例如水油、盐水、甘油或乙醇。另外，组合物中可以存在辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、表面活性剂、ph缓冲物质等。药物组合物的其他组分是石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油和矿物油。通常，二醇，例如丙二醇或聚乙二醇是优选的液体运载体，特别是对于可注射溶液。抗体可以贮库注射剂或植入物制剂的形式施用，其可以允许活性成分缓释的方式配制。
[0111]
本文所用的术语肠胃外包括本文所述的抗体或组合物的皮下、静脉内、皮内、肌内、腹膜内和鞘内施用。本文所述的抗aβ抗体或组合物也可以通过鼻或胃方法施用。
[0112]
通常，将组合物制备成可注射剂，可以是液体溶液或悬浮液；还可以制备适合于在注射之前溶解或悬浮在液体媒介物中的固体形式。如上所述，也可以将制剂乳化或包封在脂质体或微粒中，例如聚丙交酯、聚乙交酯或共聚物，以增强佐剂作用(参见langer,science 249:1527(1990)and hanes,advanced drug delivery reviews 28:97(1997))。本发明的试剂可以贮库注射剂或植入物制剂的形式施用，其可以允许活性成分缓释或脉冲释放的方式配制。
[0113]
适用于其他施用方式的另外制剂包括口服、鼻内和肺部制剂、栓剂和经皮施用。口服制剂包括赋形剂，例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素和碳酸镁。这些组合物采取溶液剂、悬浮剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或粉末剂的形式，并含有10％
‑
95％的活性成分，优选25％
‑
70％。
[0114]
局部应用可能导致透皮或皮内递送。可通过将试剂与霍乱毒素或其解毒衍生物或亚基或其他类似细菌毒素共同施用来促进局部施用(参见glenn et al.,nature 391,851(1998))。可以通过将这些组分作为混合物或作为通过化学交联或表达为融合蛋白而获得的连接分子来实现共同施用。或者，可以使用皮肤贴剂或使用转移体来实现透皮递送(paul et al.,eur.j.immunol.25:3521(1995)；cevc et al.,biochem.biophys.acta 1368:201
‑
15(1998))。
[0115]
优选地，本文所述的抗aβ抗体或包含本文所述的抗aβ抗体的组合物可以静脉内(iv)或肌内(im)施用。
[0116]
组合物可包含本文所述的抗aβ抗体，本文所述的药学上可接受的载体和其他治疗剂，特别是可用于预防、控制或治疗阿尔茨海默病(ad)的预防剂或治疗剂。此类治疗剂可包括镇痛药、抗炎药、抗病毒药、改善发烧或升高的体温的药物，设计使疼痛麻木的治疗化合物，例如可使口腔疼痛麻木和认知增强疗法的漱口水或喷雾剂，例如美金刚、多奈哌齐、加
兰他敏和卡巴拉汀。本文所述的组合物可另外包含用于例如通过静脉内疗法使受试者补水的组合物。
[0117]
本文所述的组合物可以包含编码本文所述的抗aβ抗体的核酸，即dna或rna，以及递送含有或不含有上文讨论的任何其他组合物化合物的此类核酸的任何方法。组合物还可包含载体，例如但不限于本文所述的表达载体，其本身包含本文所述的核酸。
[0118]
本文所述的组合物可包含病毒载体，用作进入细胞的核酸递送系统。合适的病毒载体核酸递送系统包括逆转录病毒系统、腺病毒载体、来自痘病毒家族的病毒载体，包括牛痘病毒和禽痘病毒，以及来自α病毒属的病毒载体。可以将编码本文所述的抗体的核酸、或包含其的载体包装到脂质体中，以递送给个体或细胞，可以将其掺入到所述的组合物中。编码抗体的载体和核酸也可以吸附到颗粒载体上或与颗粒载体结合。
[0119]
本文所述的组合物可包含基因治疗载体，其包含编码本文所述抗体或根据本发明的裸抗体多肽链的核苷酸序列。组合物可包含与本文所述的抗体和上述任何其他组合物组分组合的此类载体或多肽。
[0120]
本文所述的抗体可以用于试剂盒中。术语“试剂盒”是指关于试剂和有助于样品分析的其他材料的组合使用。在一些实施方案中，本文所述的免疫测定试剂盒包括合适的抗原、包含可检测部分的结合剂和检测试剂。试剂盒中可以包括或可以不包括用于放大由可检测部分产生的信号的系统。此外，在其他实施方案中，试剂盒包括但不限于，组分，例如用于样品收集的装置、样品管、支架、托盘、货架、培养皿、平板、向试剂盒使用者提供的说明、溶液或其他化学试剂、以及用于标准化、归一化的样品和/或对照样品。
[0121]
试剂盒可包含至少一种本文所述的抗体。试剂盒可以在一个或更多个容器中包含本文所述的组合物，任选地与一种或更多种用于预防、控制或治疗阿尔茨海默病(ad)的其他预防剂或治疗剂一起。如果未将包含用于施用的组分的组合物配制成经消化道递送，例如口服递送，则可以包括能够通过某种其他途径递送试剂盒组分的装置，例如注射器。试剂盒可进一步包括用于预防、治疗、控制或改善ad以及用于施用方法的副作用和剂量信息的说明书。
[0122]
本发明还提供了诊断试剂盒。本文所述的抗体可用于监测、诊断或提供用于ad的发展或进展的预后，并且可在适合于此类目的的试剂盒中使用。本文所述的抗体可以用于诊断试剂盒中以检测在取自个体的体液样品中n截短的淀粉样肽(例如aβpe3
‑
42或aβ4
‑
42)的存在，其中所述个体可以是人，或哺乳动物，例如非人灵长类动物或实验动物，包括小鼠、大鼠和兔子。从个体获取体液样品，例如但不限于血液、血清或脑脊髓液(csf)，并使用本文所述的抗体测试n截短的淀粉样肽的存在。使用本文所述的抗体测量个体血液中淀粉样肽的水平可提供有关个体中ad的易感性、发病风险、诊断或预后的信息，或用于治疗个体的本文所述的抗体或组合物的合适施用方案或剂量。诊断方法通常在体外进行。检测来自个体的样品中的n截短的淀粉样肽的存在的方法可包括使样品与本文所述的抗aβ抗体接触，和确定抗体与样品中的一种或更多种肽的结合。
[0123]
可用于上述诊断的试剂盒可包含与可检测物质偶联的本文所述的抗体，所述可检测物质包括但不限于：用于包括eia和elisa的测定的各种酶，例如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β
‑
半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，例如但不限于链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；用于凝集试验的颗粒，例如乳胶珠或细菌；荧光物质，例如但不限于伞形
酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，例如但不限于鲁米诺；生物发光材料，例如但不限于荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白；放射性物质，例如但不限于碘(
131
i、
125
i、
123
i、
121
i)、碳(
14
c)、硫(
35
s)、氚(3h)、铟(
115
in、
113
in、
112
in、
111
in)和锝(
99
tc)、铊(
201
ti)、镓(
68
ga、
67
ga)、钯(
103
pd)、钼(
99
mo)、氙(
133
xe)、氟(
18
f)、
153
sm、
177
lu、
159
gd、
149
pm、
140
la、
175
yb、
166
ho、
90
y、
47
sc、
186
re、
188
re、
142
pr、
105
rh、
97
ru、
68
ge、
57
co、
65
zn、
85
sr、
32
p、
153
gd、
169
yb、
51
cr、
54
mn、
75
se、
113
sn和
117
sn；使用各种正电子发射断层扫描、非放射性顺磁性金属离子以及被放射性标记或与特定放射性同位素缀合的分子的正电子发射金属。可以容易地测量的任何可检测标记可以与本文所述的抗体缀合，并用于诊断本文所述的疾病。可以使用本领域已知的技术，通过中间体(诸如例如，本领域已知的接头)将可检测物质直接偶联或缀合至抗体或间接偶联或缀合。可以与抗体缀合以用作诊断的金属离子是本领域已知的(参见例如，us474900)。
[0124]
使用本文所述的试剂盒中的本文所述的抗体，通过使用上述任何方法或上述可检测物质的抗原检测可得出存在淀粉样肽aβpe3
‑
42或aβ4
‑
42的阳性结果，并可诊断个体患有ad或提供有关患有ad或有ad风险的个体的预后信息。如本文所述，这样的个体随后可能需要和/或接受ad的治疗。
[0125]
本发明的方面尤其涉及阿尔茨海默病(ad)和其他ad相关疾病和病症以及以可溶性淀粉样蛋白为特征的其他神经系统疾病的治疗。本发明的方面还涉及通过向需要治疗的个体施用有效量的本文所述的抗体或组合物来治疗(包括预防)ad的方法。本文所述的抗体或组合物，优选药物组合物(例如，包含本文所述的抗体、药学上可接受的赋形剂和任选地另外的治疗剂的组合物)可用于治疗人或动物体的方法中。本文所述的抗体或组合物，优选药物组合物可以用于治疗人体或动物体的方法中，其中所述治疗是个体中ad的治疗或预防性治疗。
[0126]
上述提及的治疗方法可以包括在个体中产生有益治疗反应的条件下，向个体施用本文所述的抗体或组合物(例如，包含本文所述的抗体、药学上可接受的赋形剂和任选的另外的治疗剂的组合物)，例如，用于预防或治疗ad。
[0127]
这样的个体可能患有ad。本文所述的治疗方法可用于无症状的患者和当前表现出ad症状的患者。本文所述的抗体可以预防性地施用于未患有ad的个体。本文所述的抗体可以施用于未患有或没有表现出ad症状的个体。本文所述的抗体可以施用于患有或看起来患有ad的个体。易于治疗的个体包括具有ad风险或易患ad但不表现出症状的个体和疑似患有ad的个体，以及目前表现出症状的个体。本文所述的抗体可预防性地施用于普通人群，而无需对受试者个体的风险进行任何评估。在一些实施方案中，本文所述的适合于治疗的个体可以包括患有ad早期发作或其一种或更多种症状的个体，以及在诸如csf的体液样品中检测到淀粉样肽的个体。
[0128]
术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”(或语法上等效的术语)是指个体病情的严重程度降低或至少部分改善或缓解和/或实现至少一种临床症状的一些减轻、减缓或降低和/或病情进展受到抑制或延迟，和/或疾病或疾患发作时预防或延迟。
[0129]
可以在ad的治疗方法中使用的本文所述的抗体可以是与n截短的淀粉样肽aβpe3
‑
42和/或aβ4
‑
42特异性结合的本文所述的任何序列和格式的抗体。用于本文所述的治疗方
法的抗体可以是本文所述的抗体的片段，例如抗原结合片段。本文所述的抗体可以施用于患有ad的个体。
[0130]
本文所述的抗体可以施用给需要接受药物载体或药物组合物或本文所述的任何组合物治疗的个体。或者，可以通过施用编码至少一条抗体链的多核苷酸来将抗体施用给个体。表达多核苷酸以在患者体内产生抗体链。任选地，多核苷酸编码抗体的重链和轻链。表达多核苷酸以在个体中产生重链和轻链。
[0131]
本文所述的抗体可以用于预防或治疗ad的方法中，所述方法包括向患者施用有效剂量的本文所述的抗体。如本文所用，本文所述的治疗性抗体的“有效量”或“有效剂量”或“足够量”(或语法上等效的术语)是指有效产生期望效果的本文所述的抗体或组合物的量，其任选地是治疗作用(即，通过施用治疗有效量)。例如，“有效量”或“有效剂量”或“足够量”可以是这样的量，使得个体病情例如ad的严重程度降低或至少部分改善或缓解和/或实现至少一种临床症状的一些减轻、减缓或降低和/或ad进展受到抑制或延迟，和/或ad发作时预防或延迟。
[0132]
术语“患者”、“个体”或“受试者”包括接受本文所述的一种或更多种试剂(例如，免疫治疗剂或抗体)的预防性或治疗性治疗的人和其他哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括灵长类，例如非人灵长类。哺乳动物受试者还包括研究中常用的实验动物，例如但不限于兔子和啮齿动物，例如大鼠和小鼠。
[0133]
足以完成治疗性或预防性治疗的本文所述的抗体或组合物的量定义为有效剂量，例如治疗或预防有效剂量。在预防性和治疗性治疗方案中，可以几种剂量施用试剂，直到获得足够的免疫应答。术语“免疫应答”或“免疫学应答”包括针对受体受试者中的抗原的体液(抗体介导的)和/或细胞(抗原特异性t细胞或其分泌产物介导的)应答的发展。通常，如果免疫应答开始衰减，则监测免疫应答并给予重复剂量。
[0134]
用于治疗上述病情的本文所述的组合物的有效剂量取决于许多不同因素，包括施用方式、靶部位、患者的生理状态、患者是人还是动物、所施用的其他药物，以及治疗是预防性还是治疗性的而变化。通常，患者是人，但非人哺乳动物，例如非人灵长类、兔、大鼠和小鼠，包括转基因哺乳动物，也可以被治疗。需要滴定治疗剂量以优化安全性和功效。
[0135]
对于本文所述的抗体的被动免疫，剂量范围为宿主体重的约0.01至100mg/kg，更通常为0.1至50mg/kg。例如，剂量可为至少1mg/kg体重或至少10mg/kg体重或在1
‑
100mg/kg的范围内。在另一个实例中，剂量可以是至少0.5mg/kg体重或至少50mg/kg体重或在0.5
‑
50mg/kg的范围内，优选至少5mg/kg。在一个优选的实例中，剂量可为约50mg/kg。
[0136]
本文所述的方法可以包括以单剂量、两剂量或多剂量向受试者施用抗体。抗体的剂量可为约100μg/kg至100mg/kg患者体重，约300μg/kg至60mg/kg患者体重，或约10mg/kg至50mg/kg患者体重。可以每日、隔日、每周或根据通过经验分析确定的任何其他时间表向受试者施用这样的剂量。治疗可以包括在延长的时间段内，例如至少六个月内多次给药的施用。其他治疗方案可包括每两周一次、每月一次或每3至6个月一次施用。示例性的剂量方案包括连续几天1
‑
20mg/kg或15mg/kg，隔日30mg/kg或每周60mg/kg。
[0137]
本文所述的抗体可以在多种情况下施用。单剂量之间的时间间隔可以是每周、每月或每年。如通过测量患者中抗aβ抗体的血液水平所表明的，时间间隔也可能是无规律的。在某些方法中，调整剂量以达到1
‑
1000μg/ml的血浆抗体浓度，在某些方法中为25
‑
300μg/
ml。或者，本文所述的抗体可以作为缓释制剂施用，在这种情况下，需要较少的频繁施用。剂量和频率取决于患者体内抗体的半衰期而变化。通常，人源化抗体显示出比嵌合和非人抗体更长的半衰期。
[0138]
施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性还是治疗性而变化。在预防性应用中，将包含本文所述的抗体的组合物或其混合物施用于尚未处于疾病状态的患者，以增强患者的抵抗力。将该量定义为“预防有效剂量”。在这种用途中，精确的剂量再次取决于患者的健康状况和全身免疫，但是通常在每剂量0.1至25mg，特别是每剂0.5至2.5mg的范围内。在很长一段时间内，以相对不频繁的时间间隔施用相对较低的剂量。
[0139]
编码本文所述的抗体的核酸的剂量范围为每名患者约10ng至1g，100ng至100mg，1μg至10mg或30
‑
300μg dna。传染性病毒载体的剂量为每剂10
‑
100个或甚至更多个病毒粒子。
[0140]
如本文所述，本文所述的抗体和组合物可通过肠胃外、局部、静脉内、口服、胃、皮下、动脉内、颅内、腹膜内、鼻内或肌内方法施用以进行治疗性和/或预防性治疗。肌内注射或静脉内输注对于抗体的施用是优选的。
[0141]
本文所描述的其他方面和实施方案向上述方面和实施方案提供了用术语“由
……
组成”代替的术语“包含”，以及向上述方面和实施方案提供了由术语“基本上由
……
组成”代替的术语“包含”。
[0142]
应当理解，除非上下文另外要求，否则本申请公开了上述方面和实施方案彼此的任何一个的所有组合。类似地，除非上下文另外要求，否则本申请公开了单独地或与任何其他方面一起的优选的和/或任选特征的所有组合。
[0143]
在阅读本公开之后，以上实施方案、其他实施方案及其变型的修改对于本领域技术人员将是显而易见的，并且因此，这些均在本文所述的范围内。
[0144]
本说明书中提及的所有文件和序列数据库条目出于所有目的以其整体内容通过引用并入本文。
[0145]
本文所述的抗体残基位置根据kabat,e.a.,wu,t.t.,perry,h.m.,gottesmann,k.s&foeller,c.(1991).sequences of proteins of immunological interest,5th edit.,nih publication no.91
‑
3242.u.s.department of health and human services中列出的方案编号。在适当的情况下，可以相对于免疫球蛋白序列中不变的kabat编号残基描述替换的位置。替代的抗体编号方案描述于honegger,a and pl
ü
ckthun a.(2001)j.mol.biol 309,657
‑
67中。
[0146]
在本文中使用的“和/或”应被理解为具有或不具有另一个的两个指定的特征或组件中的每个的具体公开。例如，“a和/或b”将被视为(i)a、(ii)b和(iii)a和b中的每一个的具体公开，就像每个在本文中分别列出一样。
[0147]
实验
[0148]
材料和方法
[0149]
1.从杂交瘤细胞制备rna。
[0150]
thomas bayer提供了储存在
‑
80℃下的小鼠杂交瘤细胞nt4x
‑
167的冷冻沉淀物，并按照制造商的规程使用qiagen rneasy试剂盒处理以分离rna。
[0151]
2.第一链cdna合成
[0152]
使用ge life sciences第一链cdna合成试剂盒，按照制造商的规程逆转录nt4x
‑
167rna(约26μg)以产生cdna。重复两次该操作以生成3个独立的nt4x
‑
167cdna产物(第1、2和3轮)，以检测和避免由逆转录酶诱导的cdna突变。
[0153]
3.cdna序列测定
[0154]
通过pcr在3个单独的反应中扩增nt4x
‑
167cdna。免疫球蛋白cdna使用phusion flash high
‑
fidelity pcr master mix用κ轻链引物加mkc或重链引物加mhc混合物进行pcr扩增。每个pcr反应的结果是单一的扩增产物，其使用qiaquick pcr纯化试剂盒纯化，并使用m13
‑
正向和m13
‑
反向引物在两个方向上进行测序(通过gatc biotech)以获得三组独立的序列信息用于每个免疫球蛋白链。
[0155]
4.vk和vh nt4x
‑
167dna序列
[0156]
将nt4x
‑
167vk pcr产物的共有dna序列命名为nt4x
‑
167vk，并将nt4x
‑
167vh pcr产物的共有dna序列命名为nt4x
‑
167vh，分别在seq id no:9
‑
12中示出。nt4x
‑
167序列的胚系分析表明，κ轻链是鼠mkv4，且重链是鼠mhv7。
[0157]
5.嵌合nt4x
‑
167表达载体的构建
[0158]
嵌合表达载体的构建需要使用不依赖连接酶的克隆(lic)将扩增的可变区克隆到igg/κ载体(phuk和phug1)中。用bfua1(bspm1)消化载体(pcmv修饰的)，然后用t4 dna聚合酶3'
‑
5'核酸外切酶活性( datp)产生相容的突出端。首先通过nt4x
‑
167cdna的pcr扩增可变区，并使用含有前导序列的3'末端(大多数序列存在于载体中)的引物
–
正向引物
–
或恒定区(igg1或κ)的开始
–
反向引物
–
，然后是可变区的开始(在每个方向)来生成抗体序列。通过t4 dna聚合酶 dttp处理，在pcr产物中产生互补的突出端。将载体和插入物在室温下孵育，转化为化学感受态top10细菌，并铺在卡那霉素板上。分离几个克隆，并使用vh的引物hcmvi和hug1 lic rev或vk的huk lic rev通过pcr筛选菌落。选择产生正确大小的pcr产物的克隆，使用qiagen试剂盒进行小量制备，并使用相同的引物进行测序。
[0159]
6.嵌合抗体的生成
[0160]
使用expifectamine 293试剂将在expi293转染培养基和抗生素中生长的expi293悬浮细胞与cnt4x
‑
167vh.phug1和cnt4x
‑
167vk.phuk(各自1μgdna)共转染。将细胞在1ml生长培养基中生长5天。通过elisa在条件培养基中测量高达81μg/ml的嵌合nt4x
‑
167抗体。
[0161]
7.淀粉样肽
[0162]
淀粉样肽、aβ1
‑
42、aβpe3
‑
42和4
‑
42购自peptide speciality laboratories(psl)或california peptides。
[0163]
8.转基因小鼠
[0164]
先前已经描述了本研究中使用的转基因纯合小鼠系tg4
‑
42hom(以下称为tg4
‑
42)和5xfad[1,2]。
[0165]
10.被动免疫
[0166]
使用被动免疫在tg4
‑
42和5xfad小鼠中研究反向克隆的(rc)人源化nt4x(rcnt4x_sa和rcnt4x_s7a)抗体的潜在治疗效果。通过腹膜内注射进行被动免疫，并使用与两种rcnt4x抗体相同的免疫球蛋白类别的抗体(igg1、mrct对照抗体)与对照组比较。
[0167]
通过注射在无菌pbs(ph 7.4)中稀释的10mg/kg体重的抗体，免疫雄性和雌性tg4
‑
42小鼠。从三月龄开始小鼠每周接受注射。每只小鼠接受总共12次注射。在第10次和第11次
注射之间进行行为测试。最后一次注射后处死动物。对照组接受腹膜内注射igg1 mrct对照抗体(10mg/kg体重)。在最后一次注射后于6月龄时处死动物。
[0168]
六周龄雌性5xfad小鼠每周接受rcnt4x_sa和rcnt4x_s7a注射(10mg/kg体重，在无菌pbs中稀释的)或mrct对照(igg1；10mg/kg体重，在无菌pbs中稀释的)。每只小鼠接受总共12次腹膜内注射。在最后一次注射后于18周龄时处死动物。
[0169]
与治疗组相同地处理对照组。
[0170]
11.morris水迷宫的空间参考记忆
[0171]
如前所述，使用morris水迷宫[3]评估tg4
‑
42小鼠的空间参考记忆[2]。
[0172]
12.使用无偏性体视学量化神经元数量
[0173]
如先前所述进行体视学分析[2,4]。在甲酚紫染色的切片上划定海马细胞层ca1(前囟
‑
1.22至
‑
3.52mm)，并用体视学工作站(olympus bx51，带有自动取样的机动化样本台)，stereoinvestigator 7(microbrightfield,williston,usa)和100倍油镜(na＝1.35)进行分析。
[0174]
13.免疫组织化学和组织学
[0175]
如前所述处理小鼠组织样品[5]。为了斑块负荷染色，使用以下抗体：抗体1
‑
57(焦谷氨酸aβ3
‑
x，1:5000，小鼠单克隆[5])、抗体80c2(抗aβ1
‑
x，synaptic1:500，小鼠单克隆)、多克隆抗体24311(抗pan
‑
aβ，1:500，兔[2])和多克隆抗体029(抗aβ4
‑
x；1:500；豚鼠)。生物素化的抗兔和抗小鼠二抗(1:200)购自dako。使用vectastain试剂盒(vector laboratories)，使用二氨基联苯胺作为发色团，使用abc方法可视化染色。用苏木素进行复染。对于dapi染色，将切片去石蜡并在pbs中洗涤，然后在4’,6
‑
二脒
‑2‑
苯基吲哚(dapi，1μg/ml)中孵育1min。对于硫黄素s，将荧光染色的组织切片去石蜡和再水化，在用1％(w/v)硫黄素s的水溶液处理的去离子水中洗涤两次，并在1％(w/v)的4’,6
‑
二脒
‑2‑
苯基吲哚水溶液中复染。包埋在水性荧光封固剂(dako)中进行。
[0176]
14.aβ负荷的定量
[0177]
定量免疫的5xfad小鼠中的斑块负荷。对于每只动物，三个石蜡包埋的切片彼此相距至少40μm。使用配备有olympus dp
‑
50照相机和imagej软件(nih,usa)的olympus bx
‑
51显微镜评估皮层中的相对斑块负荷。系统地拍摄了20倍放大率的代表性图片。使用imagej将图片二值化为8位黑白图片，并应用固定的强度阈值定义dab染色。对dab染色覆盖的面积百分比以及每mm2的晶粒数和晶粒的平均尺寸进行测量。
[0178]
15.统计分析
[0179]
使用单因素方差分析(anova)然后bonferroni多重比较，anova然后dunnett多重比较或指示的student’s t检验，检验各组之间的差异。所有数据均以指示的平均值
±
标准误(standard error of the mean，sem)的形式给出。所有统计均使用适用于windows的graphpad prism版本5.04(graphpad software,san diego,ca,usa)计算。
[0180]
16.研究批准
[0181]
动物实验已获当地动物保护当局(landesamt f
ü
r verbraucherschutz und lebensmittelsicherheit)批准，批准号为17/2447。根据批准的方案进行实验。
[0182]
17.elisa
[0183]
将94孔maxisorp板(nunc)的每个孔中包被50μl等分的在pbs中200ng/ml的1
‑
42、pe3
‑
42或4
‑
42淀粉样肽，并在4℃下孵育过夜。将孔用pbs
‑
t(0.1％吐温20)洗涤3次，并每孔用150μl的5％牛奶的pbs/0.05％吐温20溶液封闭。然后将这些孔在室温下振荡孵育1小时，并用pbs
‑
t(0.1％吐温20)洗涤3次。使用从约100μg/ml开始的3倍稀释系列，将在1％牛奶pbs/0.05％吐温20中连续稀释的50μl一抗添加到测定板的孔中。然后重复孵育和洗涤步骤。将抗人κ链hrp(sigma a7164
‑
1 ml)在pbs/1％牛奶/0.05％吐温20中稀释4,000倍，并向每个孔中加入50μl。重复孵育和洗涤步骤，然后每孔加入75μl的k
‑
blue底物(neogen)，并在室温下孵育5
‑
10分钟。通过向每个孔中加入50μl的red stop溶液(neogen)终止反应，并在650nm处读取光密度。
[0184]
结果
[0185]
nt4x
‑
167抗体的嵌合版本的生成
[0186]
通过elisa测量淀粉样肽、aβ1
‑
42、aβpe3
‑
42和4
‑
42与嵌合nt4x
‑
167抗体的结合，并与原始的小鼠nt4x
‑
167抗体比较。在elisa测定中嵌合nt4x
‑
167抗体与aβpe3
‑
42肽结合，并且与具有与鼠nt4x
‑
167抗体(图1)可比较的ec
50
值的aβ1
‑
42或4
‑
42肽(图2)不结合。
[0187]
为了进一步表征小鼠和嵌合nt4x
‑
167抗体与淀粉样肽的结合，使用biacore t200(ge healthcare)进行spr分析。嵌合nt4x
‑
167抗体结合aβpe3
‑
42和4
‑
42肽，但与具有与原始小鼠nt4x
‑
167抗体可比较的表观k
d
值的aβ1
‑
42不结合。使用nt4x
‑
167序列设计抗nt4x
‑
167抗体的人源化版本。
[0188]
nt4x
‑
167人源化抗体变体的设计
[0189]
人vh和vk cdna数据库
[0190]
来自国际免疫遗传学数据库20099的人和小鼠免疫球蛋白的蛋白质序列和免疫学意义的蛋白质序列的kabat数据库第5版(最新更新17
‑
nov
‑
1999)8用于编译人免疫球蛋白序列在kabat比对中的数据库。我们的数据库包含10,406vh和2,894vk序列。
[0191]
nt4x
‑
167的分子模型
[0192]
计算小鼠nt4x
‑
167抗体可变区的同源模型。如通过accelrys抗体pdb结构数据库的blast分析确定的，2dqu_l.pdb和1wej_h.pdb的原子坐标分别是vl和vh的最高得分序列模板，1ynl_lh.pdb的原子坐标是最高得分整体(接口)序列模板。这些模板用于生成20个初始模型；通过使用其5个最佳环模板对每个cdr环进行建模，可以细化最高得分的模型。使用二十种最终模型确定在cdr环内的残基的共有性。
[0193]
人框架选择
[0194]
使用各种选择标准查询具有nt4x
‑
167vh和vk蛋白序列的人vh和vk数据库。识别小鼠nt4x
‑
167抗体结构中cdr残基(kabat定义)的内的fw残基，并将其命名为“邻近残基”。
[0195]
从分析中去除人源化序列和不完整序列。选择序列af062228作为人重链供体候选。该序列在序列同一性和相似性上得分很高，并且没有来自其种系的体细胞突变。af062228具有8个邻近残基变化(表1和2)。
[0196]
同样，序列ay942002被选为人κ轻链供体候选(表4)。由于框架中的体细胞突变数量，ay942004、af054661和af113887被拒绝。由于框架4中的g
‑
>q变化，aj698329被拒绝。查看的所有其他序列非常相似，但是ay942002显示出与nt4x_vk更好的框架同一性和相似性。
ay942002在其种系中没有体细胞突变，并且具有三个潜在的邻近残基变化(表4)。
[0197]
nt4x
‑
167rha和rhb的设计
[0198]
由于已经确定了合适的人框架，因此可以设计合成蛋白质和dna序列。nt4x
‑
167人源化版本的初始设计是将来自nt4x
‑
167vh的cdr 1、2和3移植到af062228的受体fw中，因此创建变体nt4x
‑
167rha。然后，将8个邻近残基反向突变为小鼠等效残基，从而创建变体nt4x
‑
167rhb，并在以下变体中一次突变一个：序列在电脑上组装并指定为nt4x
‑
167rha至nt4x
‑
167rhj。表1
‑
3比较了nt4x
‑
167vh蛋白序列的鼠和人源化版本。将所有人源化变体克隆到pmog1和pmok载体中，使得可以从这些构建体中纯化抗体用于在许多小鼠模型(5xfad和tg4
‑
42)中进行体内研究。最终的先导人源化候选将被克隆到phug4和phuk载体中。
[0199]
nt4x
‑
167rka和nt4x
‑
167rkb的设计
[0200]
ay942002的框架用于设计人源化构建体的dna和蛋白质。显示来自nt4x
‑
167vk的cdr 1、2和3接合到ay942002的受体fw中，以生成人源化nt4x
‑
167rka的初始版本。nt4x
‑
167rka中有3个未匹配的邻近残基，这些残基被反向突变为变体nt4x
‑
167rkb中的等效小鼠残基。这些残基在以下变体中一次反向突变一个：序列在电脑上组装，并指定为nt4x
‑
167rka至nt4x
‑
167rke(表4)。
[0201]
nt4x
‑
167人源化抗体的产生
[0202]
通过genscript合成了nt4x
‑
167ha、hb、ka和kb的基因。天然人框架序列af062228和ay942002分别为重链和轻链，并且天然小鼠cdr序列在电脑上组装，并分别指定为nt4x
‑
167rha至nt4x
‑
167rhj和nt4x
‑
167rka至nt4x
‑
167rke。使用genscript专有的软件算法，通过沉默诱变优化rha/rhb和rka/rkb的序列，以使用人细胞优先使用并合成的密码子。用特异性引物将rka/rkb和rha/rhb构建体pcr扩增至表达载体 插入片段(如先前针对嵌合版本所述的)，并分别在不依赖连接酶的克隆反应中插入到pmok和pmog1中，并用于转化top10细菌。随后通过pcr诱变对版本ha进行修饰，以获得表4中注释的其他人源化变体。
[0203]
对克隆进行测序，并使用qiagen质粒miniprep试剂盒或qiagen质粒maxiprep试剂盒制备质粒dna。表达构建体序列(ha、hb、ka和kb)显示为seq id no:13
‑
20。编码(人源化或嵌合的)vh和vk的表达质粒制剂用于转染expi293细胞，在无血清培养基中培养5
‑
7天，然后收获含有分泌抗体的条件培养基。
[0204]
抗体表达
[0205]
通过elisa测量expi293细胞条件培养基中igg1κ抗体的浓度。大多数抗体以良好的表达水平产生。
[0206]
通过人源化nt4x
‑
167抗体的初始版本(第1轮和第2轮)的抗原结合
[0207]
图3中显示的数据显示了rha/rhb重链与人源化nt4x
‑
167抗体的rka/rkb轻链版本的组合与淀粉样肽aβ1
‑
42和aβpe3
‑
42的结合。在包含κ轻链的rka或rkb版本的版本之间的结合中没有观察到差异，这意味着在kb中引入的反向突变对于结合不是必需的。版本rha没有显示出与淀粉样肽结合的证据，在包含与aβpe3
‑
42结合的rhb版本的人源化版本上也没有。考虑该数据，仅使用ka轻链正向，并使用stratagene诱变试剂盒quikchange lightning定点诱变试剂盒(stratagene)合成其他版本的人源化重链，生成版本nt4x rhc
‑
rhj(表1)。使用针对aβpe3
‑
42肽的人源化版本rhc
‑
rhj的结合elisa的结果如图5所示。人源化版本rhb/rka和rhb/rkb与aβpe3
‑
42肽结合，同时其他人源化版本未显示结合迹象，并合成了第
三轮人源化变体。
[0208]
第三和第四轮人源化nt4x
‑
167抗体的抗原结合
[0209]
生成了第三轮人源化nt4x
‑
167重链变体，rhk至rhr(表2)。使用stratagene诱变试剂盒(quikchange lightning定点诱变试剂盒)获得rhk
‑
rhr变体。
[0210]
将rhc
‑
rhr重链与rka版本的轻链组合，并使用aβpe3
‑
42肽进行结合elisa(图6)。人源化版本rhb、rhm、rhn、rho和rhr与rka组合结合aβpe3
‑
42肽，其中rhb/rka、rhm/rka、rhn/rka、rho/rka和rhr/rka是最佳结合剂。rhp(精氨酸通过sdm反向突变为缬氨酸)、rhq(缬氨酸反向突变为苯丙氨酸)、rhk(苯丙氨酸反向突变为甘氨酸和rhl(亮氨酸反向突变为异亮氨酸)中的八个关键重链cdr框架残基中的四个显示出减少的结合，表明这四个残基应保留为小鼠残基用于完全结合。生成其他人源化变体，其中掺入了由rhp、rhq、rhk和rhl代表的所有四个小鼠残基，并且由rhm、rhn、rho和rhr代表的四个关键框架残基被保持为人框架残基以生成版本rhs、rht、rhu、rhv、rhw rhx和rhy(表2)。使用aβpe3
‑
42的肽结合elisa显示，变体rhs至rhy与rka组合具有与rhb/rka类似的psl aβpe3
‑
42结合特征(图8)。就其所包含的“人”关键cdr框架残基的数目而言，rhs/rka变体是优选的(较低的免疫原性)。
[0211]
人源化sa、s6a、s7a和s8a nt4x
‑
167抗体的抗原结合
[0212]
生成rhs/ka(sa)的其他变体，以与人种系实现>85％的同一性。在sa版本上进行imgt结构域缺口分析，以识别可突变以增加与人种系同一性百分比的残基。rka轻链与人种系igkv1
‑
39*01和igkj4*01序列具有89.6％同一性。然而，rhs重链与人种系ighv4
‑
4*08序列具有79.4％同一性。rhs序列的种系分析识别了六个残基，这些残基可以反向突变为人种系，并与rka组合生成版本rhs6、rhs7和rhs8。使用aβpe3
‑
42的肽结合elisa显示，变体rhs7rka(s7a)是最佳人源化候选，并且与人种系具有84.5％同一性。
[0213]
通过基于nt4x
‑
167抗体的晶体结构生成的另外变体的抗原结合
[0214]
基于与小鼠nt4x fab结合的pe3
‑
14肽的晶体结构，生成rhs7的其他变体，以提高与人种系的同一性百分比。晶体结构突出显示f67、y68和i39为潜在的氨基酸，其可被改变而不影响肽结合。因此，生成f67y、y68n、i39w和结合的f67y和y68n的另外的变体(表2)，并研究与aβ1
‑
42、aβpe3
‑
42和4
‑
42的结合。具有f67y突变的rhs71保留了与亲本s7a重链变体等效的结合特性，因此被选择作为与rka轻链组合的潜在重链人源化变体。由于这些抗体的亲和力在nm范围内，我们想研究是否有可能基于晶体结构和schrodinger建模预测软件来预测我们可以突变的氨基酸以增加rhs71/rka抗体的亲和力。重链的另外五个变体产生了以下突变：s53m、s53h、r100h、l103r和l103h(表4b)。另外，还产生了轻链的五个变体：rkf(n92w)、rkg(n92y)、rkh(n92h)、rki(l94r)和rkj(l94h)。轻链变体的序列示于表4中。通过elisa(图9)和biacore研究了这些另外的人源化变体与aβ1
‑
42、aβpe3
‑
42和4
‑
42的结合。在所有测试的变体中，rhs71(其在重链中包含f67y突变)与rkh(其包含n92h突变)组合，在biacore上显示出两倍改进。
[0215]
人源化ba、sa、ta、ua、va、wa、ya候选抗体对高温的热稳定性
[0216]
本实验的目的是测试人源化抗体在经受更高温度下的热稳定性，温度从30℃到85℃持续10分钟，冷却到4℃，并在每种候选的ec
80
浓度下用于elisa测定。所有人源化版本均表现稳定，保留了其与aβpe3
‑
42肽的结合能力，直至75℃与该肽的结合降低。
[0217]
人源化nt4x
‑
167
‑
sa和nt4x
‑
167
‑
s7a候选抗体的tm(解链温度)的测定
[0218]
为了确定先导候选抗体nt4x
‑
167
‑
sa和nt4x
‑
167
‑
s7a的解链温度，在热移位测定中测试这些抗体。在qpcr热循环仪中，将样品与荧光染料(sypro orange)孵育71个循环，每个循环增加1℃。人源化抗体的tm经计算为66
‑
67℃。
[0219]
人源化nt4x
‑
167
‑
sa和nt4x
‑
167
‑
s7a候选抗体的聚集
[0220]
将样品以0.4ml/min进样至hplc系统的尺寸排阻色谱柱中，并通过多角度光散射分析以确定绝对摩尔质量并检查聚集(参见图10)。该谱图未显示聚集迹象，nt4x
‑
167_sa的平均分子量为约133.98kda，nt4x
‑
167_s7a的平均分子量为约129.92kda，这是该分析设置中igg单体的预期范围。抗体是单分散的(mw/mn<1.05)。质量回收率为100％(计算质量比进样质量高)，这表明良好的蛋白质回收率，并且样品似乎不粘附在色谱柱上或包含不可溶的聚集体，这些聚集体会被保护柱保留。总体而言，数据表明人源化nt4x
‑
167_sa和nt4x
‑
167_s7a抗体没有聚集问题。
[0221]
非特异性蛋白质
‑
蛋白质相互作用(cic)
[0222]
使用大量纯化的人多克隆igg的交叉相互作用色谱法是一种用于监测非特异性蛋白质
‑
蛋白质相互作用的技术，可用于区分可溶和不可溶抗体(第8.19节)。较高的保留指数(k')表示自相互作用倾向和低溶解度。人源化nt4x
‑
167rhs/rka、rhb/rka和rhs7/rka抗体(克隆为mog1k)显示的保留指数低于0.2，表明非特异性相互作用的较低倾向，和良好的溶解性(图11)。
[0223]
人源化nt4x
‑
167rhs/rka和rhs7/rka候选抗体的溶解度
[0224]
使用溶剂吸收浓缩器(mwco 7500kda)浓缩人源化nt4x
‑
167rhs/rka(sa)和rhs7/rka(s7a)抗体，并以一定时间间隔测量浓度。抗体浓缩至>50mg/ml，无明显沉淀。
[0225]
人源化nt4x
‑
167rhs/rka和rhs7/rka候选抗体的冻/融应力分析
[0226]
将纯化的候选抗体的样品在
‑
80℃下进行15分钟的10个循环，然后在室温下融化15分钟。然后通过sec
‑
mals分析样品以检查聚集(图12和13)。数据表明冻/融不会在人源化nt4x
‑
167抗体中引起聚集。
[0227]
人源化nt4x
‑
167rhs/rka和rhs7/rka候选抗体的热诱导应力分析
[0228]
将纯化的候选抗体样品在a)4℃、b)25℃、c)37℃和d)50℃下暴露30天。然后通过sec
‑
mals分析样品以检查聚集(图14)。总体而言，数据表明在人源化nt4x
‑
167抗体中没有聚集问题。
[0229]
人源化nt4x
‑
167rhs/rka和rhs7/rka候选抗体的血清稳定性评估
[0230]
将人源化nt4x
‑
167rhs/rka和rhs7/rka抗体的纯化样品在小鼠、人和食蟹猴血清中孵育。通过将elisa与aβpe3
‑
42和4
‑
42肽结合来测量孵育后抗体的结合能力。将已经在3种不同血清中孵育的nt4x
‑
167人源化抗体的结合与未经历任何孵育的抗体结合和已经在pbs中孵育的抗体进行比较。elisa测定表明，血清孵育的抗体与aβpe3
‑
42和4
‑
42肽的结合与pbs孵育的和非孵育的抗体的结合非常相似。因此，nt4x
‑
167rhs/rka和rhs7/rka人源化抗体在小鼠、人和食蟹猴血清中孵育30天后，仍保留了其结合能力。
[0231]
显示出人源化nt4x
‑
167能够结合淀粉样肽4
‑
42、aβpe3
‑
42并且不结合aβ1
‑
42。人源化抗体还显示出对大鼠和人神经元中的神经元细胞死亡的保护作用。该抗体经过工程改造，并表达为完全人源化的抗体，而结合效力没有明显损失。使用由人恒定区上的鼠可变区组成的嵌合抗体的实验显示，在结合elisa或使用biacore的动力学研究中，与鼠抗体相似
或提高的效价(图1和2)。
[0232]
最初的实验表明，完全人源化的nt4x
‑
167，即没有引入鼠邻近残基的框架突变，不与aβpe3
‑
42肽以及嵌合阳性对照抗体结合，但具有结合的完整组的突变的版本与嵌合阳性对照等同。这种结合的减少被分离到完全人源化的重链上。然而，我们出乎意料地发现，特定反向突变的引入使我们能够生成两种先导候选抗体，nt4x rhs/rka(sa)和nt4x rhs7/rka(s7a)。这些先导候选物也已被克隆到hug1k和hug4k载体以及初始mog1载体中。两种候选均显示出优异的结合、表达、热稳定性、亲和力和功能活性。
[0233]
体外细胞测定
[0234]
nt4x_sa和nt4x_s7a人源化抗体在大鼠和人原代皮层培养物中的神经元保护
[0235]
发现人源化抗体nt4x_sa和nt4x_s7a保留了原始小鼠nt4x抗体保护其免受n截短的淀粉样肽(4
‑
42和pyrogul3
‑
42；图17和18)的大鼠神经元的诱导的细胞死亡的性能，但没有抗淀粉样蛋白全长肽aβ1
‑
42(图19)。所有这三种抗体都对4
‑
42肽具有相当的效力，但是小鼠nt4x对pyro3
‑
42的效力比sa或s7a略强，而s7a的效力比sa略强。
[0236]
发现人源化抗体nt4x_sa和nt4x_s7a保留了原始小鼠nt4x抗体保护其免受n截短的淀粉样肽(4
‑
42和pyrogul3
‑
42；图20和21)的诱导的细胞死亡的性能，但没有抗人神经元中的淀粉样蛋白全长肽aβ1
‑
42(图22)。所有3种人源化抗体在保护免受4
‑
42肽的细胞死亡方面均比原始小鼠nt4x小鼠抗体更有效，然而n92h人源化抗体在pyro 3
‑
42方面更有效。nt4x抗体或人源化版本均未保护人神经元形成aβ1
‑
42淀粉样肽诱导的死亡。结果在很大程度上与大鼠神经元一致，对人神经元中针对pyro3
‑
42的效力有所增加。
[0237]
转基因小鼠模型的体内测试
[0238]
在5xfad和tg4
‑
42小鼠模型中使用rcnt4x_sa和rcnt4x_s7a的阿尔茨海默病治疗
[0239]
从12周龄开始免疫表达aβ4
‑
42的tg4
‑
42小鼠12周。我们证明，rcnt4x_sa和rcnt4x_s7a挽救了tg4
‑
42海马中的ca1神经元丢失，对rcnt4x_s7a具有更高的治疗作用。rcnt4x_s7a在morris水迷宫测试中另外测试了空间参考记忆性能。tg4
‑
42在六月龄时的空间参考记忆缺陷得到了彻底的挽救。
[0240]
从6周龄开始对5xfad小鼠免疫12周。在皮层中分析了对斑块负荷的影响。rcnt4x sa减少了硫黄素染色的斑块和抗焦谷氨酸aβ3
‑
x和aβ4
‑
x的n端特异性抗体。用抗pan
‑
aβ和aβ1
‑
x的抗体未见效果。与用rcnt4x_s7a免疫的小鼠相比，在所有染色测定中均显示出明显的斑块减少：用硫黄素或识别aβ1
‑
x、焦谷氨酸aβ3
‑
x、aβ4
‑
x和pan
‑
aβ的抗体染色的斑块显著减少。
[0241]
rcnt4x_sa和rcnt4x_s7a挽救tg4
‑
42小鼠的神经元丢失和记忆减退
[0242]
tg4
‑
42小鼠海马中的ca1神经元的丢失在4月龄时很明显[6]。因此，我们从三个月开始进行被动免疫治疗，为期12周。与igg1对照组相比，rcnt4x_sa和rcnt4x_s7a免疫的tg4
‑
42小鼠显示出明显更多的神经元。rcnt4x_s7a组的显著性水平较高(图23)。与nt4x相比，用rcnt4x_s7a免疫tg4
‑
42的效力明显更高(图24)。原始nt4x和rcnt4x_sa之间的神经元数量没有差异。将用rcnt4x_sa和rcnt4x_s7a免疫的数据相对于用原始鼠nt4x抗体免疫的免疫作图。注射igg1、igg2b和pbs的对照组无显著差异(图25)。igg2ba和pbs的数据来自antonios et al.[6]。用rcnt4x_s7a的被动免疫完全挽救morris水迷宫测试的tg4
‑
42小鼠的空间参考记忆缺陷(图26)。
[0243]
rcnt4x_sa和rcnt4x_s7a降低5xfad小鼠的斑块负荷
[0244]
在6周至18周龄之间对5xfad小鼠进行处理。与同种型对照igg1抗体相比，两种rcnt4x抗体的被动免疫降低了不同aβ物种的斑块负荷。rcnt4x显著减少了对焦谷氨酸aβ3
‑
x、aβ4
‑
x和硫黄素染色的斑块。在aβ1
‑
x和pan
‑
aβ阳性斑块中未检测到作用。rcnt4x_s7a的斑块降低效果得到显著改变，因为斑块对焦谷氨酸aβ3
‑
x、aβ4
‑
x和硫黄素呈阳性，但aβ1
‑
x和pan
‑
aβ的阳性降低(图27)。
[0245]
tg4
‑
42小鼠出现严重的海马神经元丢失和空间参考记忆缺陷[2,6]。tg4
‑
42模型代表仅表达n截短的aβ4
‑
42的第一小鼠模型。在六月龄时，该模型的特征在于通过morris水迷宫测试评估的大量的空间参考记忆丢失和tg4
‑
42小鼠海马中的大量退化的ca1神经元，其可以通过抗体nt4x被动免疫来挽救[6]。在本研究中，我们使用了克隆在鼠igg1骨架上的新型人源化版本的nt4x抗体。从三月龄开始为期12周的rcnt4x_s7a被动免疫还挽救了tg4
‑
42小鼠的空间参考记忆缺陷。而且，与用igg1处理的tg4
‑
42动物组相比，海马中ca1神经元的数目被显著挽救。有趣的是，比较nt4x、rcnt4x_sa和rcnt4x_s7a的处理效果，暴露于rcnt4x_s7a的tg4
‑
42小鼠比nt4x显著更高。因此，我们假定rcnt4x_s7a在不同的nt4x版本中具有最高的效能。
[0246]
序列
[0247][0248]
seq id no:1rha序列
[0249][0250]
seq id no:2：具有27f、29l、63r和70v和52bx1、53x2、54x3、55x4、56x5和52cx6的rha序列，其中x1是d或n，x2是a、n或p，x3是a或s，x4是f或l，x5是i或k，且x6是f或y。
[0251][0252]
seq id no:3rhs序列
[0253][0254]
seq id no:4rhs7序列
[0255][0256]
seq id no:5rhs71序列
[0257][0258]
seq id no:6具有92x7的rka序列，其中x7为n、h、y或w
[0259][0260]
seq id no:7rka序列
[0261][0262]
seq id no:8rkh序列
[0263]
[0264]
[0265]
[0266]
[0267]
[0268]
[0269]
[0270]
[0271]
[0272]
[0273][0274]
参考文献
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‑
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‑
d422.doi:10.1093/nar/gku1056
[0284]
本发明的其他声明：
[0285]
下列编号的本发明的声明是说明书的一部分；
[0286]
1.一种抗体，所述抗体包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中
[0287]
a)重链可变结构域(vh结构域)包含在框架区具有四个或更少的额外改变如替换的seq id no:2，和
[0288]
b)轻链可变结构域(vk结构域)包含在框架区中具有四个或更少的额外改变如替换的seq id no:6。
[0289]
2.根据声明1所述的抗体，其中所述抗体结合淀粉样肽aβpe3
‑
42和aβ4
‑
42，并且不结合淀粉样肽aβ1
‑
42。
[0290]
3.根据前述声明中任一项所述的抗体，其中所述抗体以至少鼠nt4x
‑
167抗体对淀粉样肽aβpe3
‑
42的结合亲和力的至少85％的结合亲和力结合淀粉样肽aβpe3
‑
42，如通过elisa测量的。
[0291]
4.根据前述声明中任一项所述的抗体，其中所述vh结构域包含seq id no:2。
[0292]
5.根据前述声明中任一项所述的抗体，其中所述vl结构域包含seq id no:6。
[0293]
6.根据前述声明中任一项所述的抗体，其中所述重链可变结构域包含seq id no:2，其中x1(kabat位置52b)为d。
[0294]
7.根据声明1至5中任一项所述的抗体，其中，所述重链可变结构域包含seq id no:2，其中x1(kabat位置52b)为n。
[0295]
8.根据前述声明中任一项所述的抗体，其中所述重链可变结构域包含seq id no:2，其中x2(kabat位置53)为a。
[0296]
9.根据声明1至7中任一项所述的抗体，其中，所述重链可变结构域包含seq id no:2，其中x2(kabat位置53)为p。
[0297]
10.根据前述声明中任一项所述的抗体，其中所述重链可变结构域包含seq id no:2，其中x3(kabat位置54)为a。
[0298]
11.根据声明1至9中任一项所述的抗体，其中，所述重链可变结构域包含seq id no:2，其中x3(kabat位置54)为s。
[0299]
12.根据前述声明中任一项所述的抗体，其中所述重链可变结构域包含seq id no:2，其中x4(kabat位置55)为f。
[0300]
13.根据声明1至11中任一项所述的抗体，其中，所述重链可变结构域包含seq id no:2，其中x4(kabat位置55)为l。
[0301]
14.根据前述声明中任一项所述的抗体，其中所述重链可变结构域包含seq id no:2，其中x5(kabat位置56)为i。
[0302]
15.根据声明1至13中任一项所述的抗体，其中，所述重链可变结构域包含seq id no:2，其中x5(kabat位置56)为k。
[0303]
16.根据前述声明中任一项所述的抗体，其中所述重链可变结构域包含seq id no:2，其中x6(kabat位置52c)为f。
[0304]
17.根据声明1至15中任一项所述的抗体，其中，所述重链可变结构域包含seq id no:2，其中x6(kabat位置52c)为y。
[0305]
18.根据声明1至5中任一项所述的抗体，其中，所述重链可变结构域包含在所述框架区中具有四个或更少的额外替换的seq id no:3。
[0306]
19.根据声明18所述的抗体，其中，所述重链可变结构域包含seq id no:3
[0307]
20.根据声明1至5中任一项所述的抗体，其中，所述重链可变结构域包含在所述框架区中具有四个或更少的额外改变如替换的seq id no:4。
[0308]
21.根据声明20所述的抗体，其中，所述重链可变结构域包含seq id no:4.
[0309]
22.根据声明1至5中任一项所述的抗体，其中，所述重链可变结构域包含在所述框架区中具有四个或更少的额外改变如替换的seq id no:5。
[0310]
23.根据声明22所述的抗体，其中，所述重链可变结构域(vh)结构域)包含seq id no:5。
[0311]
24.根据前述声明中任一项所述的抗体，其中所述轻链可变结构域包含seq id no:6，其中x7(kabat位置92)为n。
[0312]
25.根据声明1至23中任一项所述的抗体，其中，所述轻链可变结构域包含seq id no:6，其中x7(kabat位置92)为h。
[0313]
26.根据声明1至23中任一项所述的抗体，其中，所述轻链可变结构域包含seq id no:6，其中x7(kabat位置92)为y。
[0314]
27.根据声明1至23中任一项所述的抗体，其中，所述轻链可变结构域包含seq id no:6，其中x7(kabat位置92)为w。
[0315]
28.根据声明1至25中任一项所述的抗体，其中，所述轻链可变结构域包含在所述框架区中具有四个或更少的额外改变如替换的seq id no:7
[0316]
29.根据声明28所述的抗体，其中，所述轻链可变结构域包含seq id no:7。
[0317]
30.根据声明1至23和25中任一项所述的抗体，其中，所述轻链可变结构域包含在所述框架区中具有四个或更少的额外改变如替换的seq id no:8
[0318]
31.根据声明30所述的抗体，其中，所述轻链可变结构域包含seq id no:8。
[0319]
32.根据声明1至5中任一项所述的抗体，其包含所述seq id no:3的vh结构域和所述seq id no:7的vk结构域。
[0320]
33.根据声明1至5中任一项所述的抗体，其包含所述seq id no:4的vh结构域和seq id no:7的vk结构域。
[0321]
34.根据声明1至5中任一项所述的抗体，其包含所述seq id no:5的vh结构域和
seq id no:8的vk结构域。
[0322]
35.根据声明1至5中任一项所述的抗体，其包含所述seq id no:5的vh结构域和seq id no:8的vk结构域。
[0323]
36.一种药物组合物，其包含根据前述声明中任一项所述的抗体和药学上可接受的运载体。
[0324]
37.一种核酸分子，其编码声明1至35中任一项所述的抗体。
[0325]
38.一种载体，其包含与启动子可操作连接的声明37所述的核酸。
[0326]
39.一种宿主细胞，其包含声明37所述的核酸或声明38所述的载体。
[0327]
40.一种制备声明1至35中任一项所述的抗体的方法，所述方法包括在宿主细胞培养物中表达根据声明36所述的载体以产生所述抗体；和从所述细胞培养物中回收所述抗体。
[0328]
41.一种通过向需要治疗的个体施用有效量的根据声明1至35中任一项所述的抗体或声明36所述的药物组合物来治疗或预防阿尔茨海默病的方法。
[0329]
42.根据声明1至35中任一项所述的抗体或根据声明36所述的药物组合物，用于治疗人或动物体的方法。
[0330]
43.根据声明1至35中任一项所述的抗体或根据声明36所述的药物组合物，用于治疗个体中的阿尔茨海默病的方法。

技术特征：
1.一种抗体，所述抗体包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中a)重链可变结构域(vh结构域)包含在框架区具有四个或更少的额外改变的seq id no:2，和b)轻链可变结构域(vk结构域)包含在框架区具有四个或更少的额外改变的seq id no:6。2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体结合淀粉样肽aβpe3
‑
42和aβ4
‑
42，并且不结合淀粉样肽aβ1
‑
42。3.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述vh结构域包含seq id no:2且所述vl结构域包含seq id no:6。4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体，其中，所述重链可变结构域包含在所述框架区具有四个或更少的额外改变的seq id no:3，任选地，其中所述重链可变结构域包含seq id no:3。5.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体，其中，所述重链可变结构域包含在所述框架区具有四个或更少的额外改变的seq id no:4，任选地，其中所述重链可变结构域包含seq id no:4。6.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体，其中，所述重链可变结构域包含在所述框架区具有四个或更少的额外改变的seq id no:5，任选地，其中所述重链可变结构域包含seq id no:5。7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体，其中，所述轻链可变结构域包含在所述框架区具有四个或更少的额外改变如替换的seq id no:7，任选地，其中所述轻链可变结构域包含seq id no:7。8.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体，其中，所述轻链可变结构域包含在所述框架区具有四个或更少的额外改变如替换的seq id no:8，任选地，其中所述轻链可变结构域包含seq id no:8。9.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体，其包含所述seq id no:3的vh结构域和所述seq id no:7的vk结构域。10.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体，其包含所述seq id no:4的vh结构域和seq id no:7的vk结构域。11.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体，其包含所述seq id no:5的vh结构域和seq id no:8的vk结构域。12.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体，其包含所述seq id no:5的vh结构域和seq id no:7的vk结构域。13.一种药物组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体。14.根据权利要求1至12中任一项所述的抗体或根据权利要求14所述的药物组合物，用于治疗人或动物体的方法。15.根据权利要求1至12中任一项所述的抗体或根据权利要求14所述的药物组合物，用于治疗个体中的阿尔茨海默氏病的方法。
技术总结
本发明涉及结合淀粉样肽的人源化抗体，该抗体在重链和/或轻链可变结构域中包含突变，该突变改善结合活性。该抗体可用于治疗阿尔茨海默病(AD)。海默病(AD)。


技术研发人员：T
受保护的技术使用者：生命爱科公司
技术研发日：2019.10.02
技术公布日：2021/6/29